牛蒡子對高糖刺激大鼠系膜細(xì)胞增殖作用的機(jī)制研究

趙輝

（菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東 菏澤 274000）

牛蒡子對高糖刺激大鼠系膜細(xì)胞增殖作用的機(jī)制研究

趙輝

（菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東 菏澤 274000）

目的 探討牛蒡子對高糖刺激的大鼠系膜細(xì)胞（GMC）增殖的影響。方法 大鼠GMC與牛蒡子(100μ mol/L、10μ mol/L)培養(yǎng)48 h后，采用MTT法檢測系膜細(xì)胞的增殖情況；ELISA法檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的分泌水平；實時定量PCR方法檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血小板衍生性生長因子（PDGF）mRNA的表達(dá)。結(jié)果 牛蒡子顯著抑制高糖誘導(dǎo)的GMC增殖，降低TGF-β1的分泌，降低VEGF和PDGF mRNA的表達(dá)。結(jié)論 牛蒡子可以顯著抑制高糖誘導(dǎo)的GMC增殖，該作用可能與降低TGF-β1、VEGF和PDGF的表達(dá)有關(guān)。

牛蒡子；轉(zhuǎn)化生長因子β1；血管內(nèi)皮生長因子；血小板衍生性生長因子

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 大鼠GMC，購自武漢大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640、MTT、DMSO：美國Gibco公司；引物：上海博尚生物有限公司；TGF-β1試劑盒：武漢博士德生物有限公司；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒：TaKaRa Bio公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 GMC在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，2 d傳代一次，取對數(shù)期細(xì)胞用于實驗。將細(xì)胞分為四組，即陰性對照組(含葡萄糖5.4 mmol/L)、高糖組(含葡萄糖30.0 mmol/L)、牛蒡子高濃度組(含牛蒡子100μ mol/L，葡萄糖30.0 mmol/L)、牛蒡子低濃度組(含牛蒡子10μ mol/L，葡萄糖30.0 mmol/L)。

1.2.2 MMT法檢測GMC增殖 取對數(shù)期的GMC，置于96孔板中，按照1.2.1中要求分組，每組設(shè)6個副孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μ l MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μ l DMSO，輕輕震蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測定490 nm處各孔的吸光度值(OD值)，檢測GMC增殖情況。

1.2.3 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中TGF-β1的含量取對數(shù)期的GMC，置于24孔板中，按照2.1中要求分組，每組設(shè)6個副孔，培養(yǎng)48 h后，離心收集上清液，按照ELISA試劑盒操作說明書檢測TGF-β1的含量。

1.2.4 PCR法檢測細(xì)胞中VEGF和PDGF mRNA的表達(dá) 取對數(shù)期細(xì)胞，置于6孔板中，按照1.2.1中要求分組，每組設(shè)3個副孔，培養(yǎng)48 h后，后收集細(xì)胞加1 ml Trizol提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測RNA純度。按cDNA合成試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后。以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，按SYBRGreen熒光染料試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

VEGF的上游引物序列為5′-CCGCTCTCTTGGGTGCACTGG-3′，下游引物序列為5′-ATCCGGCTTGGCTTGTCGCGA-3′;產(chǎn)物200 bp。

QCS003C教學(xué)實驗臺適用于各高等院校、各中等專業(yè)技術(shù)學(xué)校金屬切削機(jī)床液壓傳動課程的教育實驗。同樣適合于各工人大學(xué)培養(yǎng)專門液壓技術(shù)人員及科研單位作為液壓教學(xué)和研究使用。

PDGF的上游引物序列為5’-GGGAATACTGCTCACAGAG-3’，下游引物序列為 5’-CGATACAAAATAGCACTTCGG-3’;產(chǎn)物394bp。

GAPDH的上游引物序列為5’–TGCTAGCACCATGAAGACG-3’，下游引物序列為5’–TAACGCAGCTCAGTAACCA-3’，產(chǎn)物212bp。

記錄每孔Ct值，并采用△△CT法對結(jié)果進(jìn)行定量分析△△Ct=[Ct（實驗組基因）-CtGAPDH（實驗組基因）]-[Ct（對照組基因）-CtGAPDH（對照組基因）]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用方差分析、t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡子對高糖培養(yǎng)的GMC增殖的影響 培養(yǎng)48h后，高糖組與對照組相比，GMC明顯增殖，加入EPA后，GMC的數(shù)量顯著降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性，見表1。

表1 對高糖培養(yǎng)的GMC增殖的影響

表1 對高糖培養(yǎng)的GMC增殖的影響

與對照組比較，*P＜0.0005；與HG組比較，#P＜0.0005；不同濃度牛蒡子比較，※P＜0.005。

組別 n 濃度/(μ mol/L) OD正常組 6 - 0.42±0.01高糖組 6 - 0.70±0.03*高糖+牛蒡子組 6 10 0.63±0.03*#高糖+牛蒡子組 6 100 0.52±0.04*#※

2.2 牛蒡子對高糖培養(yǎng)的GMC TGF-β1分泌的影響培養(yǎng)48 h后，高糖組與對照組相比，細(xì)胞上清液中TGF-β 1的分泌量顯著升高（P＜0.05），加入EPA后，細(xì)胞上清液中TGF-β1的分泌量顯著降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性，見表2。

表2 對高糖培養(yǎng)的GMC TGF-β1分泌的影響

表2 對高糖培養(yǎng)的GMC TGF-β1分泌的影響

與對照組比較，*P＜0.0005，△P＜0.05；與HG組比較，#P＜0.01，☆*P＜0.001；不同濃度牛蒡子比較，◇P＜0.05。

組別 n 濃度/(μ mol/L) TGF-β1（ng/ml）正常組 6 - 0.44±0.04高糖組 6 - 0.57±0.03*高糖+牛蒡子組 6 10 0.53±0.02*#高糖+牛蒡子組 6 100 0.49±0.04△☆◇

2.3 牛蒡子對高糖培養(yǎng)的GMC VEGF和PDGF表達(dá)的影響 培養(yǎng)48 h后，高糖組與對照組相比，GMC VEGF和PDGF mRNA的表達(dá)增加（P＜0.05），加入EPA后，GMC VEGF和PDGF mRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性，見表3。

表3 對高糖培養(yǎng)的GMC VEGF和PDGF mRNA表達(dá)的影響

表3 對高糖培養(yǎng)的GMC VEGF和PDGF mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，*P＜0.05；與HG組比較，#P＜0.05。

組別 n 濃度/(μ mol/L) VEGF PDGF正常組 6 29.96±0.33 25.66±0.49高糖組 6 33.35±1.04* 27.00±0.49*高糖+牛蒡子組 6 10 32.2±0.25# 26.13±0.19#高糖+牛蒡子組 6 100 31.4±0.18# 25.29±0.14#

3 討論

DN即是糖尿病嚴(yán)重而常見的微血管并發(fā)癥，又是其死亡的主要原因。DN的發(fā)生過程中主要的病理變化是腎小球基底膜增厚和系膜外基質(zhì)增多，導(dǎo)致腎小球硬化和腎功能衰竭。GMC是腎小球中最活躍的細(xì)胞，能合成分泌多種細(xì)胞因子，在腎小球病的發(fā)生中處于重要地位[3]。高糖可以通過激活活性氧、糖基化終末產(chǎn)物、血管緊張素等途徑，促進(jìn)系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，其中包括TGF-β1、VEGF和PDGF[4]。

TGF-β1屬于多肽鏈組成的二聚體，是由多種細(xì)胞分泌的的多肽生長因子，廣泛存于腎臟中，參與腎小球細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程[5]。VEGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及誘導(dǎo)血管生成，參與DN早期蛋白尿產(chǎn)生和系膜細(xì)胞增殖，目前已成為研究熱點[6]。PDGF作為多種因素導(dǎo)致腎臟損傷共同的重要中介,與腎小球系膜細(xì)胞增殖、腎小球細(xì)胞外基質(zhì)蛋白積聚密切相關(guān),也與腎小球硬化密切相關(guān)[7]。

牛蒡子是從菊科草本植物牛蒡的干燥的成熟果實中提取分離而來的木脂素化合物。研究表明牛蒡子除了抗病毒、抗腫瘤作用外，還能通過抗炎、抗免疫發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[8,9]。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下培養(yǎng)48 h，RMC增殖明顯。而牛蒡子可以抑制高糖環(huán)境下GMC的增殖，且濃度越高，抑制作用越強。本實驗還發(fā)現(xiàn)，牛蒡子還可以抑制高糖環(huán)境引起的TGF-β1、VEGF和PDGF的表達(dá)增加，且濃度越高，抑制作用越強。這些結(jié)果顯示，牛蒡子可抑制高糖誘導(dǎo)GMC增殖，保護(hù)腎臟，該作用可能與下調(diào)TGF-β1、VEGF和PDGF的表達(dá)有關(guān)。

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Effects of Arctium on Proliferation of High Glucose Stimulated Rat Glomerular Mesangial Cell

Zhao Hui

（Heze Medical College，Heze 274000,Shandong）

ObjectiveTo investigate the effects of arctium on Proliferation of highglucose stimulated rat glomer?ular mesangial cell.MethodsGMC were incubated with arctium(100μ mol/L、10μ mol/L)for 48 hours,the Prolifera?tion of rat glomerular mesangial cell was measured by MTT method,the secretion of TGF-β1was measured by ELISA method,and the expression of VEGF and PDGF mRNA was measured by real-time PCR method.ResultsArctium could decrease the the Proliferation of rat glomerular mesangial cell,TGF-β1secretion,VEGF and PDGF mRNA ex?pression by high glucose stimulated rat glomerular mesangial cell.ConclusionThe arctium can decrease the the Prolif?eration of rat glomerular mesangial cell by reducing the expression of TGF-β1,VEGF and PDGF.

Burdock;Transforming growth factor-β1;Vascular endothelial growth factor;Platelet-derived growth factor

R285.5

A

1008-4118（2016）03-0012-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2016.03.004

2016-07-14