張婷婷

摘要：禽流感是禽流行性感冒的簡(jiǎn)稱，它是由甲型流感病毒的一種亞型（也稱禽流感病毒）引起禽發(fā)生急性出血性的傳染性疾病，以引發(fā)呼吸道發(fā)病或隱性感染為特點(diǎn)。目前疫苗免疫接種是預(yù)防本病的主要措施。在產(chǎn)業(yè)化滅活疫苗生產(chǎn)過程中，傳統(tǒng)滅活工藝（使用2%的甲醛作為滅活劑）存在著局限性，其中甲醛含量雖未超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但多余的游離甲醛醛基不斷降解病毒的抗原，致使抗體效價(jià)降低、保存期縮短以及動(dòng)物機(jī)體副反應(yīng)的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：滅活工藝；病毒濃縮；重組禽流感病毒滅活疫苗

1.禽流感概述及現(xiàn)行工藝討論

禽流感（AvianInfluenza，AI）是禽流行性感冒的簡(jiǎn)稱，它是由甲型流感病毒的一種亞型引起禽發(fā)生急性出血性的傳染性疾病，以引發(fā)呼吸道發(fā)病或隱性感染為特點(diǎn)。禽流感病毒依據(jù)血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的抗原特性，將禽流感病毒分成15種特異的血凝素亞型病毒和9種特異的神經(jīng)氨酸酶亞型病毒翻。不同禽流感亞型病毒毒力差異很大，同一亞型內(nèi)不同的毒株及同一毒株感染不同宿主時(shí)其毒力也不盡相同。非致病性毒株和低致病力毒株感染后，往往只引起感染動(dòng)物一些輕微的臨診癥狀；而高致病力毒株即可引起大于70%以上的感染動(dòng)物死亡率。禽流感病毒感染后可以表現(xiàn)為輕度的呼吸道癥狀、消化道癥狀，死亡率較低；或表現(xiàn)為較嚴(yán)重的全身性、出血性、敗血性癥狀，死亡率較高。這種癥狀上的不同，主要是由禽流感病毒的毒型決定的。

2.甲醛在禽流感疫苗滅活中的主要問題

目前，在禽流感疫苗生產(chǎn)中，用甲醛作為滅活劑進(jìn)行病毒的滅活。甲醛是一種有強(qiáng)烈刺激性的致癌物質(zhì)。其既可作用于病毒含氨基的核苷酸堿基（如A，G，u），又可作用病毒殼蛋白。作用于病毒殼蛋白時(shí)，易使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)或病毒顆粒聚集，不能再作用于殼蛋白內(nèi)的核酸。這樣，病原體蛋白的抗原性會(huì)遭到嚴(yán)重破壞，并可能有病原體存活。故而為了使病原得到充分的滅活，以免發(fā)生散毒事故發(fā)生，在疫苗生產(chǎn)過程中，均采用加大甲醛濃度及延長(zhǎng)滅活時(shí)間等措施。這樣的結(jié)果就可能造成，疫苗產(chǎn)品中殘留大量游離甲醛，若隨疫苗注入機(jī)體后，會(huì)產(chǎn)生刺激性反應(yīng)。且在疫苗的保存過程中，多余的游離甲醛醛基不斷作用于病毒的抗原，使抗原在醛基的作用下逐漸降解，這樣疫苗中的有效成分不斷流逝，不僅縮短了疫苗的保存期，還降低了疫苗免疫動(dòng)物后抗體水平的產(chǎn)生。

3.材料與方法

3.1實(shí)驗(yàn)材料

3.1.1毒株、雞胚和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1）毒株重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)（Re-6株+Re-8株）

2）非免疫雞

3）SPF雞

3.1.2主要生物制劑及化學(xué)制劑硝酸纖維素膜（NC膜）、膜包、白油（進(jìn)口佐劑）、司苯-80、吐溫-80、硬脂酸鋁、甲醛溶液。

3.1.3主要儀器設(shè)備 抗原濃縮設(shè)備、自動(dòng)控制全不銹鋼乳化罐和滅活罐、純水系統(tǒng)Milli-QPLUS、漩渦混合儀。

3.2實(shí)驗(yàn)方法

3.2.1重組禽流感病毒滅活疫苗原液的制備 選擇的重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)（Re-6株+Re-8株）用滅菌的生理鹽水做10-4稀釋，接種于發(fā)育良好孵化的10～11胚齡健康易感的SPF雞胚上，每胚0.1mL，置36℃溫室內(nèi)孵育。等待觀察，雞胚接種后，照蛋2次/d，將24h內(nèi)死胚棄去直至72h后，全部取出置于2～8℃冷卻12h。將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌手術(shù)除去氣室部卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜，吸取胚液，完成重組禽流感病毒滅活疫苗原液的制備。

3.2.2傳統(tǒng)滅活工藝 將無菌檢驗(yàn)合格的重組禽流感病毒滅活疫苗原液混合于一個(gè)滅活罐內(nèi)，吸取數(shù)毫升樣品用于毒價(jià)檢測(cè)。其余病毒原液加入甲醛溶液，隨加隨攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的終濃度為2%。

3.2.3新的滅活工藝 將無菌檢驗(yàn)合格的重組禽流感病毒滅活疫苗原液混合于一個(gè)滅活罐內(nèi)，吸取數(shù)毫升樣品用于毒價(jià)檢測(cè)。將待濃縮的病毒原液用連續(xù)離心機(jī)12000r/min，至少2次，然后將離心處理的病毒原液用0.45um濾膜過濾，以去除病毒液中的雜質(zhì)和雜蛋白。其余病毒原液加入甲醛溶液，隨加隨攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的終濃度為2%。

3.2.4重組禽流感病毒滅活疫苗原液中甲醛濃度的檢測(cè)

1）對(duì)照品溶液的制備：如被測(cè)樣品為油乳劑疫苗，取已標(biāo)定的甲醛溶液適量，配成每1mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5mL于50mL量瓶中，加20%吐溫-80乙醇溶液10mL，加水至刻度，搖勻，既得。

2）供試品溶液的制備：油乳劑疫苗用5mL刻度吸管量取本品5mL，置50mL量瓶中，用20%吐溫-80乙醇溶液10mL，分次洗滌吸管，洗液并入50mL量瓶中，搖勻，加水稀釋至刻度，強(qiáng)烈振搖，靜止分層，下層液如不澄清，過濾，棄去初濾液，取澄清續(xù)濾液，即得。

3）檢驗(yàn)法：精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各0.5mL，分別加醋酸-醋酸銨緩沖液10.0mL，乙酰丙酮試液10.0mL，至60℃恒溫水浴15min，冷水冷卻5min，放置20min后，照分光光度法，在410nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，計(jì)算即得。

3.2.5判定標(biāo)準(zhǔn)表

1）甲醛溶液含量（含40%甲醛）應(yīng)不超0.2%。甲醛溶液稱取量（w甲醛溶液）：0.2579g，甲醛溶液含量：37.10%。

2）對(duì)照品溶液吸收度（A對(duì)照品）：0.63L

3）吸收度（A供試品）：供試品1為0.22L，供試品2為0.224L。

4）計(jì)算公式：甲醛溶液（40%）含量%（g/mL）=0.25×A供試品/A1.0mg

A1.0mg=A對(duì)照品×100/W甲醛溶液×1000×甲醛溶液含量

3.2.6重組禽流感病毒滅活疫苗免疫效果的檢驗(yàn) 主要用檢驗(yàn)用材料：24日齡SPF雞、禽流感病毒H5亞型二價(jià)抗原批號(hào)201501來源哈獸研、重組禽流感病毒滅活疫苗（H5亞型二價(jià)）

1）檢驗(yàn)方法：用24日齡SPF雞15只，其中10只雞每只肌肉注射疫苗0.3mL，5只雞不接種作為對(duì)照。接種后21d，分別采血，分離血清，用禽流感病毒H5亞型二價(jià)抗原測(cè)定HT抗體。

2）判定標(biāo)準(zhǔn)：免疫雞HT抗體平均滴度（GMP）應(yīng)≥6log2，對(duì)照雞均應(yīng)為陰性。

4.結(jié)果

最后，傳統(tǒng)滅活疫苗產(chǎn)品（按《規(guī)程》規(guī)定生產(chǎn)）保存15個(gè)月后，其效價(jià)下降明顯，已不能達(dá)到《規(guī)程》的要求，說明傳統(tǒng)滅活疫苗產(chǎn)品保存期僅為12個(gè)月，新的滅活疫苗產(chǎn)在保存期18個(gè)月后，用其免疫雞只，其效價(jià)仍能達(dá)到《規(guī)程》要求.試驗(yàn)結(jié)果說明，相比于傳統(tǒng)滅活工藝的滅活疫苗產(chǎn)品，新的滅活工藝的滅活疫苗產(chǎn)品的保存期有顯著的延長(zhǎng)。

5.討論

新的滅活工藝也是按照SOP標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程的滅活方法加入0.2%的滅活劑（甲醛）進(jìn)行滅活，但不同之處是在于在加入滅活劑前制備的病毒液要通過過濾離心設(shè)備進(jìn)行雜質(zhì)及雜蛋白的去除。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是為病毒濃縮做好基礎(chǔ)，使?jié)饪s時(shí)的病毒液可以純凈無雜質(zhì)，防止?jié)饪s儀的膜包堵塞影響濃縮效果。此外，在病毒液加入滅活劑后通過美國(guó)PALL公司的超濾濃縮設(shè)備及配套膜包進(jìn)行病毒液的濃縮和甲醛的洗脫，這樣做的優(yōu)點(diǎn)是有效地提高疫苗的抗體水平和降低病毒液中的甲醛濃度，新的滅活工藝并不是完全地改變傳統(tǒng)滅活，而是在其之上加入了更為優(yōu)化的機(jī)器設(shè)備，控制好一切可能會(huì)影響滅活過程的環(huán)節(jié)，提升了疫苗品質(zhì)的同時(shí)也降低了可能造成副反應(yīng)的幾率。（編輯：蔡中梅）