實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)

馮育芳，邢進(jìn)，付瑞，王吉，李曉波，王淑菁，賀爭(zhēng)鳴，岳秉飛*

（中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050）

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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)

馮育芳，邢進(jìn)，付瑞，王吉，李曉波，王淑菁，賀爭(zhēng)鳴，岳秉飛*

（中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050）

【摘要】目的 通過(guò)實(shí)施實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌檢出能力驗(yàn)證計(jì)劃，了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)?zāi)芰Γ岣邔?shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)水平。方法 按照CNAS批準(zhǔn)的能力驗(yàn)證方案，通過(guò)低溫凍干制備樣品，經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性和均勻性檢驗(yàn)合格，作為能力驗(yàn)證樣品。采用隨機(jī)編號(hào)，發(fā)樣給參加單位，并附作業(yè)指導(dǎo)書(shū)。在規(guī)定時(shí)限提交檢驗(yàn)報(bào)告和原始記錄復(fù)印件，其結(jié)果與樣品預(yù)檢結(jié)果一致的判為滿意結(jié)果，不一致或未能提交結(jié)果的判為不滿意結(jié)果。結(jié)果共有28個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加本次能力驗(yàn)證項(xiàng)目，其中獲得滿意驗(yàn)證結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室為22個(gè)，占總參加機(jī)構(gòu)的78.57%；未得到滿意驗(yàn)證結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室為6個(gè)，占21.43%。采用國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法的有27個(gè)，采用PCR檢測(cè)方法的有1個(gè)。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)能力較高，實(shí)施能力驗(yàn)證計(jì)劃能夠反映實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平。

【關(guān)鍵詞】實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；金黃色葡萄球菌；能力驗(yàn)證樣品

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），是人和動(dòng)物體表、皮、毛、鼻、口腔、消化道的常見(jiàn)菌，也是一種條件致病菌。在大多數(shù)情況下，攜帶金黃色葡萄球菌的動(dòng)物為健康動(dòng)物，但當(dāng)動(dòng)物由于外傷、應(yīng)激和環(huán)境造成免疫低下時(shí)，可引起化膿性睪丸炎、前列腺炎、卵巢膿腫、子宮內(nèi)膜炎等，影響動(dòng)物種群繁育和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果［1］。中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB14922.2-2011《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》將金黃色葡萄球菌列為SPF級(jí)大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠和兔必須排除的病原菌［2］。近5年來(lái)我室共檢測(cè)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6199只，其中，金黃色葡萄球菌陽(yáng)性率為2.5%，是SPF級(jí)動(dòng)物檢測(cè)中最常見(jiàn)的污染菌。

實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證，是通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的比對(duì)來(lái)確定實(shí)驗(yàn)室能力的活動(dòng)，是實(shí)驗(yàn)室證明其技術(shù)能力的一種主要手段。當(dāng)前，能力驗(yàn)證是國(guó)際通行的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制方法之一，已成為世界各國(guó)政府以及國(guó)際實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可組織廣泛采用的重要技術(shù)手段［3］。為提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中金黃色葡萄球菌的檢出能力，依據(jù) CNAS-RL03《能力驗(yàn)證提供者認(rèn)可準(zhǔn)則》［4］進(jìn)行本次檢測(cè)能力驗(yàn)證工作（NIFDC-PT-011）。

本項(xiàng)目的研究，包括金黃色葡萄球菌能力驗(yàn)證樣品的制備工作、制定合適的評(píng)價(jià)方案以及比對(duì)結(jié)果的匯總分析，探討實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致病菌檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃的組織和實(shí)施工作，為今后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃的實(shí)施提供有價(jià)值的參考和借鑒作用。

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

金黃色葡萄球菌為標(biāo)準(zhǔn)參考株CMCC26112，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心；本次驗(yàn)證工作設(shè)置1個(gè)干擾菌-木糖葡萄球菌，該菌為日常檢測(cè)中常見(jiàn)的葡萄球菌，菌株為本室分離株，均用梅里埃的Staphy生化條進(jìn)行了鑒定。

1.1.2 試劑材料

凍干液由中國(guó)食品藥品檢定研究院食品化妝品檢定所提供；培養(yǎng)基包括葡萄球菌培養(yǎng)基110、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)和高鹽甘露醇培養(yǎng)基；生化鑒定試劑為梅里埃的葡萄球菌鑒定條。

1.1.3 SPF大鼠

在進(jìn)行造林之后需要進(jìn)行及時(shí)的驗(yàn)收，但是在實(shí)際的驗(yàn)收工作中存在一定的問(wèn)題。第一，對(duì)需要驗(yàn)收的項(xiàng)目沒(méi)有進(jìn)行及時(shí)的自查驗(yàn)收，沒(méi)有進(jìn)行建檔工作。第二，一些驗(yàn)收工作只是在表面上進(jìn)行，沒(méi)有真正落實(shí)到位。第三，驗(yàn)收?qǐng)D紙和實(shí)際的情況存在一定才差距。

SPF級(jí)SD大鼠5只，體重200～250 g，2月齡，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供【SCXK（京）2014-0013】。實(shí)驗(yàn)在中國(guó)食品藥品檢定研究院進(jìn)行【SYXK（京）2011-0008】。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)控樣品制備

將36℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌和木糖葡萄球菌分別用無(wú)菌生理鹽水調(diào)成1011CFU的菌懸液備用。將75%的凍干液和25%的SPF大鼠糞便（高壓滅菌后）震蕩混合制成混懸液，每個(gè)凍存管中分裝180 μL的混懸液，然后加入20 μL金黃色葡萄球菌菌懸液作為單一陽(yáng)性樣品、加入20 μL金葡菌和20 μL木糖菌菌懸液作為混合陽(yáng)性樣品，加入20 μL凍干保護(hù)液作為陰性樣品，用冷凍干燥機(jī)制成凍干樣品。樣品采用隨機(jī)編號(hào)原則進(jìn)行編號(hào)。

1.2.2 質(zhì)控樣品均勻性試驗(yàn)

隨機(jī)抽取每種凍干質(zhì)控樣品20管，參照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，對(duì)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。陽(yáng)性質(zhì)控樣品應(yīng)檢出金黃色葡萄球菌，陰性質(zhì)控樣品不應(yīng)檢出金黃色葡萄球菌。

將金黃色葡萄球菌能力驗(yàn)證質(zhì)控樣品于-20℃、4℃、25℃、37℃保存。-20℃和4℃于0、1、2、3、4、5、6周，各抽取2個(gè)樣品，25℃、37℃于0、1、3、5、7、14、28 d，各抽取2個(gè)樣品，對(duì)質(zhì)控樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。陽(yáng)性樣品只要能夠檢出金葡菌即為可用，而陰性樣品不能檢出金葡菌。同時(shí)對(duì)貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.4 參加實(shí)驗(yàn)室

全國(guó)共28家實(shí)驗(yàn)室參加了此次能力驗(yàn)證計(jì)劃。

1.2.5 檢測(cè)方法

本次能力驗(yàn)證建議參考GB/T14926.14-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法。但不規(guī)定具體測(cè)試方法，僅要求在結(jié)果報(bào)告單中注明所用的檢測(cè)方法。

1.2.6 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

陰性樣品和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品的檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致，即判定為滿意結(jié)果。陰性樣本檢測(cè)結(jié)果或標(biāo)準(zhǔn)菌株陽(yáng)性樣本的檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致，即判定為不滿意結(jié)果［5］。

2　結(jié)果

2.1 質(zhì)控樣品均勻性試驗(yàn)結(jié)果

隨機(jī)選取20瓶陽(yáng)性、20瓶混合樣品和20瓶陰性樣品用于均勻性驗(yàn)證，所有樣品以隨機(jī)次序在重復(fù)性條件下分別對(duì)樣品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)。在20瓶陰性樣品中均未檢出目標(biāo)菌，而在20陽(yáng)性樣品和20瓶混合樣品中均檢出目標(biāo)菌，表明所制備的樣品是均勻的。

2.2 質(zhì)控樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.3的方法對(duì)所制備的質(zhì)控品進(jìn)行溫度和運(yùn)輸穩(wěn)定性試驗(yàn)，冷藏（4℃）存儲(chǔ) 6周，常溫（2℃）放置28 d或高溫（37℃）放置14 d，陽(yáng)性檢測(cè)率均能達(dá)到100%。常溫（25℃）或高溫（37℃）運(yùn)輸7 d，陽(yáng)性檢測(cè)率也能達(dá)到100%，也證明了所制備質(zhì)控品的穩(wěn)定性達(dá)到發(fā)放要求。

2.3 實(shí)驗(yàn)室反饋結(jié)果及采用方法

參加此次比對(duì)共28個(gè)實(shí)驗(yàn)室，均在規(guī)定時(shí)間內(nèi)給出了反饋結(jié)果；根據(jù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)滿意的實(shí)驗(yàn)室有22個(gè)，占實(shí)驗(yàn)室總數(shù)的79%，不滿意的實(shí)驗(yàn)室有6個(gè)，占實(shí)驗(yàn)室總數(shù)的21%，這6家不滿意實(shí)驗(yàn)室中，有4家將混合陽(yáng)性樣品檢測(cè)為陰性，有1家將陰性樣品檢測(cè)為陽(yáng)性，有1家將陽(yáng)性樣品檢測(cè)為陰性。本次結(jié)果不公布具體實(shí)驗(yàn)室名稱，僅以實(shí)驗(yàn)室編號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)室編號(hào)從 NIFDC-PT-011-001～NIFDC-PT-011-028，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌檢出能力驗(yàn)證結(jié)果匯總Tab.1 Summaries of validation of the detection ability of Staphylococcus aureus in laboratory animals

3　討論

從NIFDC-PT-011實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌檢出能力驗(yàn)證計(jì)劃結(jié)果報(bào)告中可以看出，本次能力驗(yàn)證計(jì)劃共計(jì)有28家實(shí)驗(yàn)室參加，所有實(shí)驗(yàn)室均在規(guī)定時(shí)間內(nèi)提交了結(jié)果反饋單。其中滿意結(jié)果的22家，占79%，不滿意結(jié)果有6家，占21%，27家實(shí)驗(yàn)室均參照了國(guó)標(biāo)中的方法進(jìn)行檢測(cè)，只有1家實(shí)驗(yàn)室采用的是PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。6家不滿意實(shí)驗(yàn)室中有4家將混合陽(yáng)性樣品判定為陰性，一方面說(shuō)明樣品因?yàn)閾诫s了木糖葡萄球菌對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)有一定的影響，致使在分離培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)了漏檢金葡菌的現(xiàn)象，另一方面也說(shuō)明在參加比對(duì)計(jì)劃時(shí)應(yīng)盡可能采用2種以上的培養(yǎng)基對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，以免造成漏檢，出現(xiàn)對(duì)結(jié)果的判斷不正確。必要時(shí)可實(shí)行2人同時(shí)檢測(cè)，避免出現(xiàn)主觀判斷錯(cuò)誤。

能力驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量監(jiān)控的重要手段，既是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的補(bǔ)充，又是政府和社會(huì)了解實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的重要方法［9］。能力驗(yàn)證作為日常監(jiān)督檢查的輔助手段，能夠有效提升實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力。促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室保持有效的檢測(cè)能力，同時(shí)也幫助部分實(shí)驗(yàn)室及時(shí)發(fā)現(xiàn)自身的不足并加以改進(jìn)，為更好地檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供有力的技術(shù)支撐［5-8］。

參考文獻(xiàn)

［1］ 方喜業(yè)，邢瑞昌，賀爭(zhēng)鳴.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制［M］.北京，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，008：371-372.

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［9］ 陳文勝，羅建波，劉禮平.實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量監(jiān)督工作探討［J］.華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，33（增刊）：105-107.

Evaluation of the ability to detect Staphylococcus aureus in experimental animal laboratories

FENG Yu-fang，XING Jin，F(xiàn)U Rui，WANG Ji，LI Xi-bo，WANG Shu-jing，HE Zheng-ming，YUE Bing-fei*
（Institute for Laboratory Animal Resources，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective To verify the detection ability of experimental animal quality detection laboratories in China for Staphylococcus aureus.Methods The testing samples for Staphylococcus aureus detection were prepared by bacterial culture，homogeneity test and stability test，according to the study plan approved by CNAS.Then the samples and operation instruction were sent to the participant laboratories.The detection reports from these laboratories should be submitted before the deadline expires，and the collected data were summarized and analyzed.Results There were 28 laboratories which joined to this test plan.Among them 22 laboratories（78.57%）achieved satisfactory test results，and six laboratories （21.43%）had unsatisfactory test results.27 Laboratories used the national standard detection assay，while only one laboratory used PCR assay.Conclusions Most of experimental animal quality testing laboratories in China have sufficient proficiency in detection of Staphylococcus aureus.The obtained information are very helpful for the laboratory ability verification testing in future.

【Key words】Laboratory animals；Staphylococcus aureus；Detection ability validation

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）02-0195-04

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.016

［基金項(xiàng)目］國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2015BAI09B00）。

［作者簡(jiǎn)介］馮育芳（1981-），女，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)。E-mail：fyf307@126.com

［通訊作者］岳秉飛（1960-），男，研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail：y6784@126.com

Corresponding author：YUE Bing-fei，Email：y6784@126.com

［收稿日期］2016-01-13