甘蔗渣載體填料在海水曝氣生物濾池中的應用

王賢豐， 單洪偉， 張家松， 馬　甡， 李色東

(1廣西壯族自治區(qū)海洋研究所，廣西海洋生物技術重點實驗室，廣西 北海 536000；2中國海洋大學水產學院，教育部重點實驗室，山東 青島 266000；3中國水產科學研究院南海水產研究所，廣州 510300；4湛江恒興南方海洋科技有限公司，廣東 湛江 524000)

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甘蔗渣載體填料在海水曝氣生物濾池中的應用

王賢豐1,2， 單洪偉2， 張家松3， 馬甡2， 李色東4

(1廣西壯族自治區(qū)海洋研究所，廣西海洋生物技術重點實驗室，廣西 北海 536000；2中國海洋大學水產學院，教育部重點實驗室，山東 青島 266000；3中國水產科學研究院南海水產研究所，廣州 510300；4湛江恒興南方海洋科技有限公司，廣東 湛江 524000)

摘要：為研究甘蔗渣作為載體填料用于海水曝氣生物濾池中的可行性，在海水曝氣生物濾池中培養(yǎng)生物膜，并以此為基礎構建海水養(yǎng)殖排放水處理系統(tǒng)。通過監(jiān)測水體總氨氮(TAN)、亞硝酸鹽氮(NO2--N)等水質指標濃度變化，水體游離細菌與載體附著細菌密度變化，評價甘蔗渣載體生物濾池的降解效果。結果顯示，以甘蔗渣為載體的生物濾池掛膜所需時間為26 d，掛膜完成后甘蔗渣附著可培養(yǎng)總菌和芽孢桿菌密度分別為3×108cfu/g 和7.8×107cfu/g。在處理養(yǎng)殖水體時，生物濾池中水體氨氮和亞硝酸鹽氮濃度分別控制在0.2 mg/L和0.05 mg/L以下，同時，水體中芽孢桿菌數(shù)量由3.3×103cfu/L增加至7×104cfu/L，弧菌數(shù)量由4.9×103cfu/L下降至3.1×101cfu/L。研究表明，以甘蔗渣為載體的海水曝氣生物濾池能快速有效地完成掛膜，并在海水養(yǎng)殖排放水處理中取得較好效果。

關鍵詞：甘蔗渣；生物膜載體；曝氣生物濾池；海水養(yǎng)殖；水處理

水產養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖用水未經處理直接排放，不僅浪費資源，污染周邊環(huán)境，同時也會將病毒、細菌等病原生物直接排放到周圍環(huán)境中而增加養(yǎng)殖風險[1-2]。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(RAS)具有節(jié)水、節(jié)地、節(jié)能、環(huán)保等優(yōu)點[3-4]。高效的水處理技術是RAS關鍵所在，利用生物濾池技術降解氨氮、亞硝酸鹽氮等可溶性有害物質是目前水產養(yǎng)殖廢水處理中的研究熱點，也是養(yǎng)殖污染凈化技術的發(fā)展趨勢[5-6]。

生物濾池降解效果主要取決于載體上微生物群落的附著情況及其生理生化活動。選擇適宜微生物附著生長的載體材料及合適的掛膜方式是提高生物濾器凈化功能的關鍵，也是優(yōu)化處理效能的研究重點[7]。目前生物濾池中常用的載體可分為天然載體(如珊瑚石、貝殼、沸石、活性炭等)及有機合成載體(如聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯等高分子材料)兩類。這兩類載體雖然在生產實踐中取得了較好的處理效果，但大多存在使用時間有限、成本高昂、易產生二次污染等問題，限制了生物濾池凈化技術的進一步應用[8-9]。為此，研究人員逐漸開始開發(fā)和使用可生物降解的生物膜載體材料，特別是農副產品等天然高分子可降解材料，此類材料具有取材容易、價格低廉、附著面積大、生物親和性好等優(yōu)點，是新載體研發(fā)的重要方向[10-12]。

甘蔗渣作為一種產量巨大的可降解農業(yè)副產品，在水產養(yǎng)殖中已有較多的應用，具有改良底質[13]、吸附重金屬離子[14]、減少病害、提高養(yǎng)殖效益等作用，但作為生物濾池載體鮮有報道。本研究將甘蔗渣用作海水曝氣生物濾池的載體，采用優(yōu)勢菌種掛膜法培養(yǎng)生物膜，并以此為基礎構建生物膜處理系統(tǒng)，探究甘蔗渣基生物膜的降解效能，為甘蔗渣在海水曝氣生物濾池中的應用提供理論和技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

甘蔗渣：所用甘蔗渣購自廣東省湛江市湖光鎮(zhèn)金海糖業(yè)有限公司，選取干凈無霉變、大小適中的甘蔗渣，經篩濾選取40～60目篩網(wǎng)之間的甘蔗渣顆粒，蒸煮、曝曬、消毒(20～30 mg/L漂白粉浸泡2 h)、清洗后裝入網(wǎng)袋(由60目篩絹網(wǎng)制成)。

掛膜菌種：所用菌株為芽孢桿菌BZ5(Bacillussp.)株[15]，由中國海洋大學水產學院教育部重點實驗室提供，篩選自浙江省舟山市對蝦集約化溫棚養(yǎng)殖池塘和集約化高位池養(yǎng)殖池塘，具有高效氨氮降解能力，經發(fā)酵后低溫冷凍制成菌粉，菌體濃度約1010～1011cfu/g，經活化后使用。

1.2試驗場地與生物膜處理系統(tǒng)

本試驗在湛江恒興南方海洋科技有限公司進行，該公司有大量集約化海水高位池南美白對蝦(Penaeusvannawei)養(yǎng)殖池塘(鹽度18～30)，并常年進行養(yǎng)殖生產。生物膜處理系統(tǒng)(圖1a)由連接管道與4個串聯(lián)曝氣生物濾池組成，并用水泵與養(yǎng)殖池塘相連接，外置氣泵以控制生物濾池中溶氧。曝氣生物濾池(圖1b)，1個圓形加厚水桶為一個生物濾池，水桶直徑90 cm，高100 cm，體積約600 L。每個桶中放置1個 PVC材料的支架(長×寬×高：60 cm×60 cm×80 cm，共4層，每層間隔20 cm)，每層平鋪孔徑為2.5 cm的聚乙烯塑料網(wǎng)布，其上放置裝有甘蔗渣的網(wǎng)袋。在第1個生物濾池上方設置淋水裝置(由直徑20 mm帶孔的PVC水管制成)，將生物濾池進水管出口設置在底部、出水口在上部，使水流在濾池中由下往上流動，從而增加水體與甘蔗渣載體的接觸時間。

圖1　生物膜處理系統(tǒng)及曝氣生物濾池Fig.1　Biofilm treatment system and biological aerated filter

1.3試驗設計

1.3.1菌種活化

將菌粉與海水按照重量1∶100混合，并以重量比1∶2添加紅糖，在常溫下曝氣活化6～10 h，靜置沉淀10～15 min，取上清液即得到芽孢桿菌BZ5株菌種，密度約為109cfu/mL ，作為接種菌備用。

1.3.2生物濾池掛膜實驗

向生物濾池中泵入對蝦養(yǎng)殖池海水，浸沒甘蔗渣載體?？刂粕餅V池中溶氧維持在4～6 mg/L，按照水體體積添加經活化的芽孢桿菌BZ5株，使生物濾池中芽孢桿菌密度達105～106cfu/mL；同時投加總氨氮和糖蜜，使其在生物濾池中的濃度分別達到5 mg/L和0.3 g/L，促進細菌生長繁殖。在第1次添加的氨氮被降解完全后再添加1次TAN(NH4Cl)。

1.3.3生物濾池的凈化效果

生物濾池掛膜完成后，分別以模擬養(yǎng)殖廢水和實際養(yǎng)殖水體檢驗生物濾池的處理效能。模擬養(yǎng)殖排放水處理實驗：在生物膜處理系統(tǒng)中添加約10 mg/L的氨氮(NH4Cl)，每天測定生物濾池中總氨氮(TAN)、亞硝酸鹽氮(NO2--N)、硝酸鹽氮(NO3--N)、總氮(TN)濃度；實際養(yǎng)殖水體降解實驗：排盡生物濾池中的存水，泵入對蝦養(yǎng)殖池底層水體，監(jiān)測水體中TAN、NO2--N、NO3--N和TN的濃度變化以及水體游離可培養(yǎng)總菌、芽孢桿菌和弧菌數(shù)量，研究生物濾池的降解能力。

1.4測定項目與方法

1.4.1水質指標

每天使用多功能水質檢測儀(YSI-6600)測定溫度、pH、溶氧、鹽度等常規(guī)水質指標，定期檢測生物濾池中水體的TAN、NO2--N、NO3--N、TN濃度，測定方法按照海洋檢測規(guī)范(2007)分別采用靛酚藍分光光度法、萘乙二胺分光光度法及鋅鉻還原法[16]，水體中TN采用紫外分光光度法[17]。

1.4.2水體及甘蔗渣載體附著細菌密度

水體游離細菌密度測定：從每個生物濾池中取水樣1 mL置于已滅菌離心管中，用滅菌海水進行10倍稀釋，取稀釋后樣品涂布于2216E固體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h后計數(shù)。其中芽孢桿菌樣品在稀釋前先經過80 ℃水浴處理20 min[18]。

甘蔗渣附著細菌密度測定：從每個生物濾池中相同位置取甘蔗渣1 g(濕重)，置于無菌15 mL離心管中，加10 mL滅菌海水，超聲波震蕩5 min后漩渦震蕩5 min，形成細菌懸浮液，取其上清液用滅菌海水進行10倍稀釋，取稀釋后樣品涂布于2216E固體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h后計數(shù)。其中芽孢桿菌樣品在稀釋前先經過80 ℃水浴處理20 min。

1.5數(shù)據(jù)分析

實驗中所得數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件進行處理，水質指標及細菌密度以平均值及標準差(Mean±SD)表示。

2結果與討論

2.1生物濾池掛膜結果

2.1.1氨氮和亞硝酸鹽氮情況

如圖2所示，在掛膜階段共添加了2次營養(yǎng)物質，在第1次添加時，氨氮及亞硝酸鹽氮經過約15 d被基本降解。在第2次添加時氨氮快速下降，2 d后即下降至0.06 mg/L，并穩(wěn)定在這一濃度；而亞硝酸鹽氮則快速積累，經2 d時間升高到2.45 mg/L，之后快速下降，經5 d時間下降至0.12 mg/L，并穩(wěn)定在這一濃度。通常，研究人員將掛膜過程中出現(xiàn)氨氮及亞硝酸鹽氮濃度快速下降階段，即生物濾池中硝化作用的穩(wěn)定發(fā)揮作為生物濾池掛膜成功的標志[19-20]。本實驗中，第2次添加營養(yǎng)鹽時，氨氮經2 d時間即基本被降解，亞硝酸鹽氮則在之后的5 d時間內降解完全，并最終趨于穩(wěn)定，說明此時生物濾池已完成掛膜，共用時26 d。

圖2　掛膜階段氨氮和亞硝酸鹽氮的變化Fig.2　Fluctuations of TAN and NO2--N during thestage of biofilm formation

2.1.2游離細菌和附著菌情況

由圖3可知，由于養(yǎng)殖池塘中細菌密度較低，故生物濾池中水體起始游離細菌數(shù)量較少，芽孢桿菌密度僅為3.2×102cfu/mL，在添加營養(yǎng)鹽及接種菌后，水體可培養(yǎng)總菌和芽孢桿菌密度均呈先升高后下降趨勢，最后其密度分別穩(wěn)定于5.04×105cfu/mL 和4.17×104cfu/mL。甘蔗渣附著可培養(yǎng)總菌及芽孢桿菌呈快速上升后維持穩(wěn)定的變化趨勢，從第7 天起即分別穩(wěn)定于3×108cfu/g和7.8×107cfu/g左右。甘蔗渣載體上附著細菌密度在第7天后即維持相對穩(wěn)定，說明生物濾池中生物膜上細菌群落在數(shù)量上已趨于穩(wěn)定，這也從側面反映了掛膜階段的完成。

生物濾池的掛膜啟動階段是一個比較費時的過程，而且海水獨特的高鹽、寡營養(yǎng)等特點使得在海水處理中掛膜時間比生活污水及工業(yè)廢水處理中的時間要長。柳瑤等[21]以石英砂為載體研究在流化床生物濾器中掛膜啟動過程，發(fā)現(xiàn)淡水和海水環(huán)境中的掛膜時間分別需要47和60 d。Zhu等[22]研究認為海水中生物濾器功能達到穩(wěn)定狀態(tài)需要40～80 d。本實驗以甘蔗渣為載體，采用優(yōu)勢菌種掛膜法，僅需26 d即可完成掛膜，縮短了掛膜時間。這一方面可能是因為甘蔗渣本身為生物有機體，具有較好的生物親和性，容易被細菌附著生長，同時甘蔗渣也具有較大的比表面積，能在較短時間附著生長大量的微生物；另一方面，在掛膜過程中添加了碳源及較高的氨氮濃度，為微生物提供了豐富的營養(yǎng)，促進了氮循環(huán)菌及其他異養(yǎng)菌的繁殖生長，從而明顯減少微生物群落結構達到穩(wěn)定狀態(tài)的時間，增強了生物膜的去氮能力。此外，在掛膜啟動時添加高濃度的芽孢桿菌，可大大增加水體中初始細菌數(shù)量，從而縮短生物膜到達穩(wěn)定狀態(tài)的時間[23]。實驗結果顯示，甘蔗渣能滿足海水曝氣生物濾池對載體的要求，能在較短的時間內完成掛膜。

圖3　掛膜階段水體游離細菌及蔗渣附著菌的變化Fig.3　Changes of bacteria in water and bagasse during the stage of biofilm formation

2.2生物濾池效果

2.2.1模擬養(yǎng)殖廢水試驗效果

如圖4所示，氨氮與總氮均呈下降后穩(wěn)定趨勢，氨氮濃度由起始的11 mg/L，經4 d時間下降至0.06 mg/L，并穩(wěn)定在這一水平；總氮則在6 d后穩(wěn)定在4 mg/L左右。亞硝酸鹽氮呈先升高后下降的趨勢，前3 d快速積累至6 mg/L，7 d后下降至0.06 mg/L。實驗過程中硝酸鹽氮呈現(xiàn)緩慢積累趨勢，最終穩(wěn)定在3 mg/L左右。

圖4　處理模擬養(yǎng)殖廢水時水質變化Fig.4　Changes of water quality parameter

觀察掛膜階段生物濾池中水質變化情況發(fā)現(xiàn)，隨著氨氮濃度的下降，均會出現(xiàn)一個亞硝酸鹽氮積累的過程。關于生物濾池中亞硝酸鹽氮積累的現(xiàn)象已有許多研究報道，Laanbroek等[24]認為在生物膜微生物群落中氨化細菌和硝化細菌的增長速率及氧飽和常數(shù)存在差異，造成兩種細菌處于不同的空間位置從而產生亞硝酸鹽氮積累的現(xiàn)象；邱立平等[24]研究發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽氮的積累與氨氮濃度過高、溶氧不足及有機物濃度過高有關；宋協(xié)法等[7]在研究水力停留時間對以無剩余污泥懸浮型材料為載體的曝氣生物濾池的處理效能時同樣觀察到亞硝酸鹽氮的積累現(xiàn)象，其原因是進入生物濾池的氨氮濃度過高。在本次試驗過程中，由于控制了溶氧的變化，因此推測亞硝酸鹽氮的積累與起始階段添加了較高濃度的氨氮及較高濃度的有機物有關。

細菌對氮有多種利用途徑，Xiao等[26]對一株具有較高氨氮去除作用的枯草芽孢桿菌(B.subtilisAYC)研究發(fā)現(xiàn)，其轉化路徑為NH4+-N→NO2--N→NO3--N→NO2--N→N2；單洪偉等[27]對一株溶藻弧菌(VibrioalginolyticusZ5)氮利用途徑進行研究，發(fā)現(xiàn)其對無機氮的利用途徑有兩種，分別是NH4+-N→菌體蛋白和NO2--N→NH4+-N→菌體蛋白。在本次降解試驗中，總氮濃度從15 mg/L下降至4 mg/L，氨氮及亞硝酸鹽氮濃度維持在0.05 mg/L以下，實驗中生物濾池溶解態(tài)氮含量大大降低，推測減少的氮一部分被生物膜吸收，合成自身蛋白，另一部分經反硝化作用生成N2溢出系統(tǒng)。其具體的氮轉化途徑需要進一步研究。由實驗結果可知，以甘蔗渣為載體的曝氣生物濾池能有效降低水體氨氮、亞硝酸鹽氮濃度，具有較高的去氮效能。

2.2.2實際養(yǎng)殖廢水試驗效果

實際養(yǎng)殖水體實驗過程中水體水質指標及細菌密度的變化如圖5所示。由于試驗時對蝦養(yǎng)殖池塘爆發(fā)病害，對蝦存塘量較低，養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽氮等污染負荷不高而弧菌數(shù)量較多，經生物濾池2 d時間的凈化處理，氨氮和亞硝酸鹽氮分別下降至0.2 mg/L和0.04 mg/L，水體中游離可培養(yǎng)總菌密度略有上升，維持在105cfu/L水平，芽孢桿菌密度大量增加，由起始1.2×103cfu/L上升至5.9×104cfu/L，弧菌密度大幅下降，由起始4.88×103cfu/L下降至7.25×101cfu/L。

圖5　處理養(yǎng)殖水體時水質及細菌密度變化Fig.5　Changes of water quality parameter and densities of bacteria

微生物群落在海水養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)占據(jù)重要的地位，具有穩(wěn)定養(yǎng)殖環(huán)境、減少病害爆發(fā)、促進物質循環(huán)等作用。許多種類的弧菌是海水養(yǎng)殖中常見且危害嚴重的病原性細菌或條件致病菌[28]，同時，養(yǎng)殖環(huán)境中弧菌數(shù)量的多少被許多研究者看作是養(yǎng)殖環(huán)境好壞的標準之一，而芽孢桿菌則作為一種益生菌在水產養(yǎng)殖中廣泛應用，并在養(yǎng)殖實踐中取得了巨大成效[29-30]。由實驗結果可知，經生物濾池處理后水體中芽孢桿菌數(shù)量增加而弧菌數(shù)量大幅下降，其原因可能是在掛膜啟動階段以芽孢桿菌BZ5株為接種菌，使生物膜在成熟時微生物群落中有大量的芽孢桿菌。因此，在處理養(yǎng)殖水體時，甘蔗渣載體上附著的芽孢桿菌在繁殖增長的同時會有一部分進入水體，從而大量增加水體中游離芽孢桿菌數(shù)量。

黃汝添等[31]研究枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisBs-1)發(fā)現(xiàn)其對大海馬養(yǎng)殖水體中多種弧菌具有顯著的抑制作用；蘇浩等[32]認為芽孢桿菌對鮑魚養(yǎng)殖池中硅藻上的弧菌具有很強的拮抗作用。因此，實驗中弧菌數(shù)量的大幅減少可能是因為水體中芽孢桿菌數(shù)量增加，對部分弧菌產生抑制作用。與此同時，甘蔗渣載體上附著有數(shù)量巨大的可培養(yǎng)總菌，在凈化養(yǎng)殖水體時這些細菌會慢慢進入水體通過競爭拮抗作用使弧菌數(shù)量大幅下降，雖然水體中總菌數(shù)量不變，但是群落結構卻得到優(yōu)化，改善了水體菌相，這對養(yǎng)殖環(huán)境具有重要意義。

3結論

以甘蔗渣作為載體、芽孢桿菌BZ5株作為接種菌，在海水曝氣生物濾池中進行掛膜試驗，并構建生物濾池處理系統(tǒng)，研究其凈化效果。試驗證明，甘蔗渣很好地滿足了曝氣生物濾池對載體的要求，經26 d即掛膜成功，該生物濾池能快速降解氨氮及亞硝酸鹽氮，并分別將其控制在0.2 mg/L、0.04 mg/L以下，同時能增加水體中的芽孢桿菌，減少弧菌數(shù)量，改善群落結構。試驗取得了較好的掛膜效果及凈水處理效果。然而掛膜與降解過程中生物膜微生物群落的生理生態(tài)變化、作用機理等仍需要更深入的研究，其大規(guī)模應用于生產也需要更為豐富的理論與實踐基礎。

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Application of bagasse as substrates in biological aerated filter

WANG Xianfeng1， SHAN Hongwei2， ZHANG Jiasong3， MA Shen2， LI Sedong3

(1GuangxiInstituteofOceanology,KeyLaboratoryofMarineBiotechnologyofGuangxi,BeihaiGuangxi536000,China； 2TheKeyLaboratoryofMariculture,MinistryofEducation,OceanUniversityofChina,QingdaoShandong266003,China；3SouthChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou510300,China；4ZhanjiangEvergreenSouthMarineScienceandTechnologyCo.Limited,ZhanjiangGuangdong524000,China)

Abstract：In order to evaluate the feasibility and validity of using bagasse as the substrates in biological aerated filter (BAF), biofilms were cultured in BAF, based on which wastewater treatment system for marine aquaculture was established. The decomposing effect of BAF using bagasse as substrates was evaluated by monitoring the concentrations of water quality parameters such as total ammonia nitrogen (TAN), nitrite nitrogen (NO2--N), etc.. The result showed that it took 26 d for the BAF using bagasse as substrates to form biofilm, while the density of total heterotrophic bacteria and the bacillus attached in bagasse were 3×108cfu/g and 7.8×107cfu/g respectively. During the wastewater treatment, the concentrations of ammonia nitrogen and nitrite nitrogen were controlled below 0.2 mg/L and 0.05 mg/L respectively, and the density of bacillus increased from 3.3×103cfu/L to 7×104cfu/L, while that of vibrio decreased from 4.9×103cfu/L to 3.1×101cfu/L. The study indicates that bagasse as is very efficient in biomass formation, and is a preferable material for BAF in mariculture wastewater treatment.

Key words：bagasse； biofilm carrier； biological aerated filter； mariculture； wastewater treatment

DOI：10.3969/j.issn.1007-9580.2016.03.003

收稿日期：2016-02-11修回日期：2016-05-12

基金項目：國家科技支撐計劃項目(2011BAD13B10)；公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201103034)

作者簡介：王賢豐(1989—)，男，碩士，研究實習員，研究方向：海水清潔養(yǎng)殖技術研究工作。E-mail：wang_xfeng@qq.com 通信作者：馬甡(1955—)，男，教授，研究方向：甲殼動物增養(yǎng)殖技術。E-mail：mashen@ouc.edu.cn

中圖分類號：S959；X703

文獻標志碼：A

文章編號：1007-9580(2016)03-012-07