趙　莉，李思怡，張立虎，李　冠

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,烏魯木齊 830046)

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甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的密碼子偏好性分析

趙莉，李思怡，張立虎，李冠*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,烏魯木齊 830046)

摘要：以甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因序列為材料，研究甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因密碼子偏好性，為改良甜瓜風(fēng)味與品質(zhì)提供理論依據(jù)。運(yùn)用在線分析軟件CodonW對(duì)甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶的編碼序列(Coding sequence，CDS)進(jìn)行密碼子分析，利用Mobyle在線工具分析同義密碼子相對(duì)使用度(RSCU)、有效密碼子數(shù)(ENC)、GC及GC1s、GC2s、GC3s含量。甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因偏好于以A或T結(jié)尾的密碼子。密碼子ATT、GTT和AGA的RSCU值都大于1，屬于共同偏好使用的密碼子，而密碼子GCG、CGG的RSCU值小于1，屬于使用頻率較低的密碼子。發(fā)現(xiàn)密碼子偏好性與親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近有一定的關(guān)系。要實(shí)現(xiàn)目的基因在外源表達(dá)系統(tǒng)中的成功表達(dá)和提高其表達(dá)量，可通過增加目的基因劑量，目的基因密碼子優(yōu)化，改善培養(yǎng)條件等方法實(shí)現(xiàn)，其中目的基因密碼子優(yōu)化起到了關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞：甜瓜；蔗糖轉(zhuǎn)化酶；密碼子偏好性

甜瓜(CucumismeloL.)果實(shí)中主要含有還原糖(葡萄糖、果糖)和非還原糖(蔗糖)，以及檸檬酸和蘋果酸等成分,不同的糖酸組分及含量形成了不同風(fēng)味，其中糖酸代謝酶起到了重要作用[1]。甜瓜果實(shí)中積累的糖分主要是蔗糖，而蔗糖的積累又一定受某種特定的代謝機(jī)制的調(diào)控,而蔗糖轉(zhuǎn)化酶就是果實(shí)中蔗糖代謝相關(guān)酶中重要的一種，普遍的存在于酵母、細(xì)菌和植物中，在植物糖代謝中發(fā)揮著重要的作用，能夠不可逆的催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖。按亞細(xì)胞定位，蔗糖轉(zhuǎn)化酶可分為細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶[2]；按最適pH劃分，可分為酸性轉(zhuǎn)化酶和中性轉(zhuǎn)化酶。細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶歸為酸性轉(zhuǎn)化酶，而細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶歸為中性轉(zhuǎn)化酶[3]。可溶性酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶是一種液泡酶，催化蔗糖水解成己糖，起著調(diào)節(jié)植物組織中糖的積累和液泡中蔗糖的利用的作用。細(xì)胞壁酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶主要參與韌皮部質(zhì)外體卸載時(shí)蔗糖的分解，以保持庫-源之間的濃度梯度[4]。許多研究證明，植物體內(nèi)蔗糖轉(zhuǎn)化酶能對(duì)碳水化合物的代謝和分配有著調(diào)控，進(jìn)而可以提高瓜果等作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。有關(guān)植物蔗糖轉(zhuǎn)化酶方面的研究很多，但在甜瓜方面開展的工作卻較少。我國是甜瓜生產(chǎn)大國，甜瓜糖度是一個(gè)反應(yīng)甜瓜成熟度的重要指標(biāo)，也是決定甜瓜商品等級(jí)的重要因素[5]。曾有研究表明擬南芥花中蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因突變后會(huì)造成花蜜合成受阻，可溶性糖含量下降[6]；另有研究者通過RNA干擾的方式抑制了番茄中蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白，使番茄的蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性增強(qiáng)，果實(shí)中的糖分含量顯著增加[7]。這些探索為我們提供了啟示，在改良甜瓜風(fēng)味的研究中，未見對(duì)甜瓜糖酸代謝相關(guān)酶的密碼子使用偏好性進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因密碼子進(jìn)行探討研究，以甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因序列為材料，通過CodonW等軟件分析CDS序列，并尋找密碼子偏好性規(guī)律，為進(jìn)一步改善甜瓜品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1序列來源

本研究使用的甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼序列(CDS)來源通過Cucurbit Genomics Database(http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi)再在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找到CDS區(qū)，甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶在數(shù)據(jù)庫中的登錄號(hào)及基因類型(見表1)。

表1　甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶在數(shù)據(jù)庫的登錄號(hào)

注：來源為首次發(fā)現(xiàn)所在植物，之后在甜瓜中發(fā)現(xiàn)。

Notes：Source：For the first time found in the plant, and then discovery in melon.

1.2實(shí)驗(yàn)所用軟件

運(yùn)用CodonW 版本1.4.4(http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?#forms::CodonW)對(duì)甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶的CDS序列進(jìn)行密碼子分析，利用Mobyle在線工具(http://mobyle.pasteur.fr) 分析同義密碼子相對(duì)使用度(Relative synonymius codon usage, RSCU)、有效密碼子數(shù)(Efective Number of Codon, ENC)、GC及GC1s、GC2s、GC3s含量與密碼子適應(yīng)指數(shù)(Condon Adaptation Index,CAI)。

同義密碼子相對(duì)使用度(RSCU)是對(duì)同義密碼子使用偏好性的評(píng)估，定義為某一同義密碼子使用次數(shù)的觀察值與該密碼子出現(xiàn)次數(shù)的期望值的比值。如果密碼子的使用無偏好性，則RSCU值為1；如果某一密碼子使用頻繁，則RSCU值大于1；如果某一密碼子使用頻率低，則RSCU值小于1[8]。有效密碼子數(shù)(ENC)反映基因密碼子使用的偏好程度，取值范圍為20(每個(gè)氨基酸只使用一個(gè)密碼子)～61(各個(gè)密碼子被均衡使用)，其值越小，表明該基因的密碼子使用偏好性越強(qiáng)[9]?？梢愿鶕?jù)已知高表達(dá)基因的序列來估計(jì)未知基因密碼子使用的偏好性程度。CAI的值在0～1,如果越高則表明該基因的密碼子使用偏好性越強(qiáng)。

利用DNAMAN8軟件對(duì)甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶的CDS序列進(jìn)行多序列比對(duì)，之后對(duì)CDS序列用鄰接距離矩陣法進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1有效密碼子數(shù)及堿基組成分析

13條甜瓜蔗糖代謝酶基因的ENC值、GC堿基含量以及密碼子第一、第二、第三位的GC堿基含量計(jì)算見表2。結(jié)果顯示：在13條甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶的基因序列中，有9條(2:MU4509、4: MU47159、6:MU51339、7:MU51906、8:MU51981、9:MU53184、10:MU53489、12:MU60417、13:MU65693)基因的ENC值大于50，說明它們的密碼子使用偏好性很弱，剩余4條(1:MU43713、3:MU46770、5:MU50786、11:MU59776)基因的ENC值在40.649-49.769之間，為一般偏好性基因。進(jìn)一步分析13條甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因GC含量及密碼子第一、二、三位的GC含量，發(fā)現(xiàn)3條為一般偏好性基因(1: MU43713、3: MU46770、5: MU50786)的GC含量呈現(xiàn)GC1s>GC2s>GC3s規(guī)律，且它們的GC含量都小于50%，說明這3條甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因在編碼時(shí)偏好使用A或T結(jié)尾的密碼子。8:MU51981、10:MU53489、11:MU59776的GC3s含量都大于GC2s與GC1s，且GC3s含量大于50%，說明這些基因在編碼時(shí)偏好使用G或C結(jié)尾的密碼子，其余的基因都偏好使用A或T結(jié)尾的密碼子(見表2)。

表2　13條甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的有效密碼子數(shù)及堿基組成

2.2甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶密碼子使用特性分析

用CodonW1.4.4軟件計(jì)算13條甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因密碼子的RSCU值。分析發(fā)現(xiàn)，在13條基因中，密碼子ATT、GTT和AGA的RSCU值都大于1，屬于共同偏好使用的密碼子，而密碼子GCG、CGG的RSCU值小于1，屬于共同使用頻率較低的密碼子，見表3。

綜上所述，在基因工程中可以根據(jù)每條甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的密碼子使用特征來設(shè)計(jì)基因序列，優(yōu)化基因密碼子，盡量避免使用頻率低的密碼子，使外源基因在受體物種中能夠高效穩(wěn)定地表達(dá)[10]。

表3　13條甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因同義密碼子的相對(duì)使用度

注：方框中的密碼子為共同偏好使用密碼子，下劃線密碼子為共同使用頻率低的密碼子。

Notes:Common preference for the use of codon in the box,the common use of the low frequency of the underline.

2.3CDS序列的聚類分析

通過DANMAN將甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因CDS序列進(jìn)行聚類結(jié)果，結(jié)合甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶密碼子使用特性發(fā)現(xiàn)基因密碼子偏好性差異大小與親緣關(guān)系遠(yuǎn)近有關(guān)。

前人研究發(fā)現(xiàn)在基因類型和功能一定的情況下，進(jìn)化上親緣關(guān)系較近的作物間，同義密碼子的用法相似[11]，與本研究的結(jié)論一致。通過進(jìn)化樹分枝可以看出2和 13、1和9、4和6的進(jìn)化樹分枝較近，總變異值差較小，發(fā)現(xiàn)在18個(gè)氨基酸中有11個(gè)氨基酸密碼子偏好性相同，其中2與13都為中性轉(zhuǎn)化酶，4與6的最初來源相同，而3和8雖然在進(jìn)化樹一個(gè)分枝，但總變異值相差較大，在18個(gè)氨基酸中有6個(gè)氨基酸密碼子偏好性相同。5和11的總變異值差較小，但不在一個(gè)進(jìn)化樹分枝，在18個(gè)氨基酸中只有1個(gè)氨基酸密碼子偏好性相同。由此得出總變異值差較小且在同一進(jìn)化分枝上的密碼子偏好性差異最小，其次為在同一進(jìn)化分枝上但總變異值差較大的密碼子偏好性差異較小，總變異值差較大且不在同一分枝的密碼子偏好性差異較大(見圖1)。

3討論

糖分含量是衡量甜瓜品質(zhì)的主要指標(biāo)之一，而蔗糖的積累是甜瓜果實(shí)糖分提高的重要因素[12]。密碼子偏好性在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能、生物信息學(xué)等研究中有重要的意義，受到了廣泛的關(guān)注，密碼子使用偏好性受很多因素影響，如基因堿基組成、表達(dá)水平等[13-14]。

先前的研究表明禾本科作物少用或避免使用以A或T結(jié)尾的密碼子，偏好于使用以G或C結(jié)尾的密碼子，而雙子葉作物則相反[15-17]，這與我們研究的甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的偏好性結(jié)果一致。甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因中密碼子ATT、GTT和AGA為共同偏好使用密碼子，而GCG和CGG為共同使用頻率低的密碼子。甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近對(duì)密碼子偏好性也有一定的影響，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，基因密碼子偏好性差異越大，反之則密碼子偏好性差異越小。為了提高外源蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因在甜瓜的表達(dá)水平，雖然可通過優(yōu)化目的基因密碼子，增加目的基因表達(dá)量，但是甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的CAI值較低，不易對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化。

圖1　13條甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的聚類分析

4結(jié)論

通過分析甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因的密碼子偏好性，發(fā)現(xiàn)該基因的密碼子的第三位主要偏好以A或T，而較少使用以C或G。共同偏好使用的密碼子為ATT、GTT和AGA，而使用頻率較低的密碼子為GCG、CGG。研究甜瓜蔗糖轉(zhuǎn)化酶密碼子使用特性發(fā)現(xiàn)基因密碼子偏好性差異大小與親緣關(guān)系遠(yuǎn)近有關(guān)。

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Analysis of codon bias of invertase genes in melon(CucumismeloL.)

ZHAO Li,LI Siyi,ZHANG Lihu,LI Guan*

(CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

Abstract：The sequence of invertase genes of melon was used for studying the codon bias of invertase genes to provide a basis for the improvement of flavor and quality of melon. The sequence of CDS of invertase genes of melon was analyzed by Codon W program, then the Relative synonymius codon usage (RSCU) ,Efective Number of Codon ( ENC) ,and the content of GC,GC1s,GC2s,GC3s were analyzed by Mobyle program.The invertase genes of melon preferred to use condons ending with A or T. ATT, GTTand AGA were common preference used codon with RSCU value more than 1.However,GCG and CGG was low frequently used codon with RSCU value less than 1.It is showed that preferences of condon has a certain relationship with genetic relationship.Successful expression of target gene in exogenous gene expression system and enhancement of its expression level were achieved through increasing the dose of the target gene, optimizing the codon of target gene, improving culture conditions and other methods, which the optimization of codon of target gene has played a key role.

Keywords：Cucumis melo L.; Invertase; Codon usage

收稿日期：2015-12-22；修回日期：2016-04-04.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31260258)。

作者簡(jiǎn)介：趙莉，女，碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：1416964466@qq.com . *通信作者：李冠，男，教授，研究方向：植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：guanli@xju.edu.cn.

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.02.02

中圖分類號(hào)：S652;Q343.1+2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-5565(2016)02-071-07