王佳穎，花文婷，余　丹

(南京中醫(yī)藥大學 藥物安全性評價研究中心，江蘇 南京210023)

?

云南紅豆杉中紫杉烷類二萜成分化合物的遺傳毒性研究

王佳穎，花文婷，余丹

(南京中醫(yī)藥大學 藥物安全性評價研究中心，江蘇 南京210023)

摘要目的：研究云南紅豆杉中四種紫杉烷類二萜成分化合物(2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉寧、巴寧亭酸)的安全性。方法：采用Alarmblue檢測采用四種紫杉烷類二萜成分化合物在CHL細胞上的細胞毒性，采用CHL細胞染色體畸變實驗和Ames試驗，觀察云南紅豆杉中四種紫杉烷類二萜成分化合物遺傳毒性作用。結果：四種紫杉烷類二萜成分化合物在CHL細胞株上IC50>0.5 mg/mL；未對鼠傷寒沙門氏桿菌組氨酸缺陷型菌株回復突變數(shù)產(chǎn)生影響；未使得CHL染色體畸變率增加。結論：在本實驗條件下，未觀察到2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉寧、巴寧亭酸對CHL細胞有明顯的細胞毒性以及未觀察到體外遺傳毒性。

關鍵詞遺傳毒性；云南紅豆杉；紫杉烷類二萜成分

紫杉醇是現(xiàn)有的抗癌天然藥物中療效最好、最具潛力的藥物之一。由于其獨特的化學結構和作用機制而倍受世人關注[1]，由此引發(fā)了人們對紅豆杉屬(Taxus)植物的研究熱潮。到目前為止化學家們已從紅豆杉屬植物中分離出紫杉烷類二萜化合物300多個。云南紅豆杉是我國特有樹種，自1990年張宗平等[2]報道其化學成分以來，各國學者對其進行了廣泛的研究，到目前為止已從云南紅豆杉的各個部位分離得到紫杉烷類二萜100多個，由于云南紅豆杉中紫杉醇含量較高，已成為提取紫杉醇的主要原料，同時也被加工成為中藥飲片。然而對于云南紅豆杉的研究現(xiàn)多集中于其化學成分的研究[3-4]，對于其中除紫杉醇外的其他紫杉烷類二萜化合物的藥理毒理學研究相對較少，隨著紫杉烷類抗腫瘤藥物研究的深入，對于其他紫杉烷類二萜化合物的毒理學研究顯得尤為迫切和必要。

遺傳毒理學是研究化學物質和物理因子對機體遺傳物質的作用，闡明遺傳毒物對機體健康造成的后果以及作用機制，為保護人體健康安全提供科學依據(jù)的一門毒理學分支學科。

而目前，許多國家和國際機構都高度重視化學物(藥物)的致突變性，并充分認識到其在遺傳性疾病和癌癥發(fā)生中的重要性。國家的有關政策法規(guī)也高度重視化學物(藥物)致突變性，并且陸續(xù)頒布的有關食品、藥物、農(nóng)藥以及醫(yī)療用品安全性藥理學評價程序中都將致突變性研究作為一項重要的評價指標之一[5- 6]。因而研究與探討云南紅豆杉中紫杉烷類二萜成分的遺傳毒性在紫杉烷類抗腫瘤藥物研究開發(fā)、云南紅豆杉飲片質量及安全性控制中具有極其重要的意義。

按照ICH指導原則的要求，并根據(jù)大量的文獻調(diào)研[7-9]，本研究通過體外細菌突變實驗、動物細胞染色體畸變實驗試圖在體外水平對已得到的云南紅豆杉中紫杉烷類化合物2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸進行遺傳毒性的研究和評價，為云南紅豆杉飲片質量與安全性控制提供理論基礎。

1實驗材料

1.1受試藥物

2-deacetoxytaxinineE(2-去乙酰氧基紫杉寧E); 7-deacetoxytaxinineJ( 7-去乙酰氧基紫杉寧J); 2-deacetoxydecinnamoyltaxinineJ(2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉寧J);baccatin3 (巴寧亭酸)均由江蘇省食品藥品檢驗監(jiān)督研究院制備提取。分別用DMSO溶解，制備成1mmol/L儲存液，臨用前用生理鹽水稀釋成所需濃度。

1.2試劑和藥品

二甲基亞砜，DMSO，Amresco0231 - 100mL；疊氮鈉，LotNo.404C057，CAS：26628-22-8，含量≥98%，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；敵克松，LotNo.4030165-A，CAS：140-56-7含量≥98%，AccuStandard；2-氨基芴，LotNo.10139040，CAS：153-78-6，含量≥98%，AlfaAesar；1,8-二羥基蒽醌，LotNo.LC60P31，CAS：117-10-2，含量≥98%，北京百靈威科技有限公司；絲鏈霉素，LotNo. 130438-200502，CAS：57-92-1，含量99.6%，中國藥品生物制品檢定所；環(huán)磷酰胺，LotNo. 100234-200502，CAS：50-18-0，含量99.6%，中國藥品生物制品檢定所；β-萘黃酮，LotNo.10159729，CAS：6051-87-2，含量≥98%，AlfaAesar；秋水仙堿，LotNo.C22H25NO6，CAS：64-86-8，含量≥98%，BioSharp；NADP，LotNo.B0014K061100，BioSharp；G6PC，LotNo.SLBL0293V,Sigma; 改良型1640培養(yǎng)基(RPMI-1640)，LotNo. 1590348，Gibco；0.25% 胰酶(Trypsin-EDTA)，LotNo. 25200056，Gibco；雙抗(PenStrep)，LotNo. 1568586，Gibco；四季青胎牛血清，LotNo. 150211，浙江天杭生物科技有限公司。Alarmblue，Lot：156450SA，InvitrogenUSA；Hepes，LotNo. 513C0412，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；瓊脂粉，LotNo.402H0324，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；L-組氨酸，LotNo.1018A0518，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；檸檬酸，LotNo. 225A046，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；牛肉膏，LotNo. 20150615，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；結晶紫，LotNo. 125C044，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；蛋白胨，LotNo. 603B054，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；NaNH4HPO4·4H2O，LotNo. 20150812，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；Na2HPO4·12H2O，LotNo. 20150721，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；K2HPO4·3H2O，LotNo. 20150721，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；C6H12O6，LotNo. 405A0920，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；氨芐青霉素，LotNo. 104D0319，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；D-生物素，LotNo. 911A0420，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；四環(huán)素，LotNo. 1104B0416，BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.,Ltd.；NaCl，LotNo. 10019318，國藥集團化學試劑有限公司；冰醋酸，LotNo. 20150326，國藥集團化學試劑有限公司；丙三醇，LotNo. 20130913，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇，LotNo. 14081911787，南京化學試劑有限公司。

1.3儀器

自動細胞計數(shù)儀，IC1000，上海睿鈺生物科技有限公司；自動菌落分析儀，Protocol3，SYNBIOSIS；二氧化碳培養(yǎng)箱，HERAcell150i，德國Thermo；微生物培養(yǎng)箱，IMH180，德國Thermo；搖床，MaxQ4450，德國Thermo；高速冷凍離心機，ALLEGRAX-15R，美國BACDMAN；TS100倒置顯微鏡，ITS100，日本Nikon；酶標儀，瑞士帝肯，M1000PRO。

1.4細胞及培養(yǎng)

CHL細胞株，由江蘇省食品藥品檢驗監(jiān)督研究院提供。培養(yǎng)基為含有10%的四季青胎牛血清的RPMI-1640，置于5%二氧化碳，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5菌株

實驗選用TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535菌株進行試驗，菌株由南京中醫(yī)藥大學藥物安全性評價研究中心提供。正式實驗之前，需對試驗擬用的五種鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株進行了組氨酸需求試驗、抗氨芐青霉素試驗、結晶紫敏感試驗、紫外線敏感試驗、抗四環(huán)素試驗和自發(fā)回變試驗。 結果顯示: 各種菌株的特性正常，自發(fā)回復突變數(shù)均在正常范圍內(nèi)。因此，各菌株基因型均符合實驗要求。

1.6動物

SPF級SD大鼠5只，雄性，體重200～220g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK(滬)2013-0006。動物合格證編號：2010002604205。動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學藥物安全性評價研究中心SPF級動物房。實驗動物使用許可證：SYXK(蘇)2014-0003。飼養(yǎng)溫度：20～26 °C；濕度：40%～70%；換氣次數(shù)8～10次/小時；工作照明：100～200lx，動物照明：15～20lx，明暗交替12小時；噪音：≤60dB；氨濃度<20mg/kg；落下菌數(shù)：≤3CFU/0.5h·90mm平皿。飼養(yǎng)條件符合飼養(yǎng)條件符合國標GBl4922. 2—2001。

2統(tǒng)計方法

各組計量數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(M±SD)表示。采用GraphPadPrism5.0進行統(tǒng)計，兩組間采用Student’sTest。多組間比較采用單因素方差分析法(One-wayANOVA)及Dunnett法。

3實驗方法

3.1S9制備

采用苯巴比妥和β-萘黃酮作為誘導劑制備S9[10-12]，苯巴比妥和β-萘黃酮經(jīng)灌胃給藥，劑量均為80mg/kg，連續(xù)3天。處死前16小時停止飲食，自由飲水。動物斷頭處死后動物斷頭處死后，令血液流盡，剝?nèi)テっ?，在無菌及4℃條件下進行下列步驟操作：用冰凍的0.15mol/LKCl溶液從門靜脈處注入肝臟，以沖洗肝臟。摘取肝臟，按每克肝重加3mL冰冷的0.15mol.L-1KCl液勻漿，0～4℃條件下，9 000×g，10min，過濾取上清液。分裝并于-80℃保存?zhèn)溆?，每批S9勻漿應在完全培養(yǎng)基上做無菌試驗。

3.2IC50測定

CHL以1 000個細胞每孔種于386孔板黑色底透的細胞培養(yǎng)板，每孔接種1000個細胞，每孔45μL。孵育24h后，加入不同濃度2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝帯蛯幫に?，再孵育24h后，每孔加入5μL的Alarmblue，6小時后測定熒光強度，采用酶標儀檢測吸光度，激發(fā)波長為530nm，發(fā)射波長 590nm。

3.3染色體畸變實驗

將指數(shù)生長的CHL細胞接種在75mL的培養(yǎng)瓶中, 細胞濃度為3×104/mL，每瓶接種5mL，共接種32瓶，培養(yǎng)24 小時后給藥。試驗組共分兩部分，不給S9組和給予S9組，均包括2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉寧、巴寧亭酸高中低三個劑量組，劑量分別為0.5mg/mL、0. 25mg/mL和0.125mg/mL，陰性對照組(生理鹽水)和陽性對照組。其中不給予S9組陽性藥為絲裂霉素，藥物劑量為0.4μg/mL；給予S9組陽性藥為環(huán)磷酰胺，藥物濃度為20μg/mL。不給予S組加入藥物后培養(yǎng)24小時。給予S9組，給藥后培養(yǎng)4小時后用PBS洗滌細胞3次，重新加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24小時。終止培養(yǎng)前4小時，于5mL全培養(yǎng)液中加0.1mL秋水仙堿稀釋液，秋水仙堿終濃度為0.2μg/mL。隨后終止培養(yǎng)，每瓶分別取細胞培養(yǎng)液制作染色體玻片標本，各組觀察100個中期分裂相細胞，計數(shù)其染色體畸變率。試驗重復1次。

3.4Ames實驗

采用平板摻入法進行試驗，2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸分別設5個劑量組，劑量分別為0.05、0.015 8、0.005、0.001 58、0.000 5mg/皿，同時設定陰性對照組和陽性對照組，平行做加S9和不加S9試驗。37 ℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)各平扳菌落數(shù)并算出均值，試驗重復1次。陽性對照組藥物及給藥劑量見表1。

表1　Ames試驗陽性藥物及給藥劑量

4實驗結果

4.1IC50結果

經(jīng)過試驗，發(fā)現(xiàn)2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸在藥物可溶解的最高劑量0.5mg/mL均未對CHL細胞產(chǎn)生毒性作用。因此，我們認為此四種物質均無細胞毒性。因此，后續(xù)染色體畸變試驗以及Ames試驗均已藥物可溶解的最高濃度作為給藥的高濃度劑量。

4.2染色體畸變實驗結果

染色體畸變試驗結果如經(jīng)檢測，未給予S9組，溶劑對照組染色體畸變率為1%，絲裂霉素組(0.4μg/mL)染色體畸變率為39%；而給予S9組，溶劑對照組染色體畸變率為1%，環(huán)磷酰胺組(20μg/mL)染色體畸變率為32%；結果表明試驗系統(tǒng)可靠。而各試驗組染色體畸變率均小于5%，呈陰性結果。表明，在該試驗條件下，2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸對CHL細胞染色體無致畸作用。

表2　染色體畸變試驗結果

注：P(Polyflod)多倍體、G(Gap)裂隙、B(BREAK)斷裂、R(環(huán))RING、E(EXCHANGE)交換、O(Otheraberrations)；畸變率<5，陰性(-)；畸變率>5，陽性(+)；畸變率>20，陽性(++)。

4.3Ames實驗結果

Ames實驗結果如表3～6所示。陽性藥的菌落數(shù)均高于陰性對照組自發(fā)回復突變數(shù)2倍以上，表明實驗系統(tǒng)可靠。2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸給藥組的菌落數(shù)與陰性對照組相比，無顯著性差異。表明在試驗條件下，2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸均未對鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株的回復突變數(shù)產(chǎn)生影響。

5結論和討論

紫杉醇抗腫瘤作用靶點為微管蛋白，幫助微管蛋白二聚體裝配成微管，并阻止其解聚而穩(wěn)定微管，從而抑制細胞有絲分裂[13-14]。微管是細胞骨架重要的組成部分，起到維持細胞形態(tài)，固定和支持細胞器位置的重要作用。同時它參與構成纖毛、鞭毛、中心粒以及基體，因而參與細胞收縮、偽足運動及細胞內(nèi)物質運輸。在有絲分裂期間，微管參與構成紡錘體，在分裂細胞中牽引染色體到達分裂極過程中發(fā)揮著重要作用。本研究采用的四個化合物均為云南紅豆杉中紫杉烷類結構，推測可能與紫杉醇作用靶點相似。同時程東等[15]研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇可誘導CHL細胞染色體畸變率增加。因而，本研究采用Ames實驗和CHL細胞染色體畸變實驗評價2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉寧、巴寧亭酸的體外遺傳毒性。

Ames實驗結果顯示，在加S9和未加S9實驗系統(tǒng)下2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝?、巴寧亭酸并未增加鼠傷寒沙門氏桿菌組氨酸缺陷型的回復突變數(shù)，表明該四種化合物既沒有間接誘變活性，也沒有直接誘變活性。主要可能由于該類物質主要作用于微管，對DNA無直接損傷作用，因為未對鼠傷寒沙門氏桿菌組氨酸缺陷型菌株產(chǎn)生致突變作用，回變菌落數(shù)沒有增加。

本研究檢測了2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂?；仙紝帯蛯幫に嵩贑HL細胞上的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)在可溶解的最高濃度下，四種化合物均未對細胞產(chǎn)生明顯的細胞毒性，因此我們初步認為四種化合物在CHL細胞上均為無細胞毒性物質。染色體畸變實驗可以反映受試物對哺乳動物骨髓細胞染色體的作用能力，以檢測致突變物對遺傳物質的損傷情況[16-17]。結果顯示，該四種化合物未導致CHL細胞的染色體畸變率增加，因此該四種物質對哺乳動物體細胞沒有致突變型。

綜上所述，本研究表明在現(xiàn)有實驗條件下，2-去乙酰氧基紫杉寧E、7-去乙酰氧基紫杉寧J、2-去乙酰氧基去肉桂酰基紫杉寧、巴寧亭酸未發(fā)現(xiàn)有體外遺傳毒性。

參考文獻：

[1]WANIMC,TAYLORHL,WALLME,etal.Plantantitumoragents.VI.Theisolationandstructureoftaxol,anovelantileukemicandantitumoragentfromTaxusbrevifolia[J].JAmChemSoc, 1971, 93(9): 2325-2327.

[2]ZHANGZP,JIAZJ,TaxanesfromTaxusyunnanensis[J].Phytochemistry, 1990, 29(11): 3673-3675.

[3]劉麗華, 王麗軍, 任天坤, 等. 云南紅豆杉種子的化學成分研究[J]. 中草藥,2013(11): 1380-1385.

[4]楊燕. 云南紅豆杉、黃龍尾和蕪菁還陽參的化學成分研究[D]. 昆明：云南中醫(yī)學院, 2014.

[5]王心如. 毒理學實驗方法與技術[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2003.

[6]袁伯俊. 新藥臨床前安全性評價與實踐[M]. 北京：軍事醫(yī)學科學出版社, 1997: 102.

[7]BRAMBILLAG,MATTIOLIF,ROBBIANOL,etal.Genotoxicityandcarcinogenicitystudiesofbronchodilatorsandantiasthmadrugs[J].BasicClinPharmacolToxicol, 2013, 112(5): 302-313.

[8]CIARAVINOV,PLATTNERJ,CHANDAS,Anassessmentofthegenetictoxicologyofnovelboron-containingtherapeuticagents[J].EnvironMolMutagen, 2013,54(5): 338-346.

[9]SANT’ANNAJR,YAJIMAJP,ROSADALJ,etal.Metformin’sperformanceininvitroandinvivogenetictoxicologystudies[J].ExpBiolMed(Maywood), 2013, 238(7): 803-10.

[10]單純, 張鳳蘭, 崔生輝.螺旋涂布法評價聯(lián)合誘導制備大鼠肝S9的活性大小[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2015(3): 48-52.

[11]何黎黎, 楊立開, 鄧黎, 等.S9代謝活化酶系統(tǒng)制備及蛋白含量的測定[J]. 西南民族大學學報(自然科學版), 2010(2): 243-245.

[12]WOODALLGMJR,DAUTERMANWC,DeMariniDM.EffectofdietarycaseinlevelsonactivationofpromutagensinthespiralSalmonellamutagenicityassay. Ⅱ.StudieswithinducedratliverS9[J].MutatRes, 1996,360(2): 127-143.

[13]SCHIFFPB,FANTJ,HORWITZSB,Promotionofmicrotubuleassemblyinvitrobytaxol[J].Nature, 1979,277(5698): 665-667.

[14]SCHIFFPB,HORWITZSB,Taxolstabilizesmicrotubulesinmousefibroblastcells[J].ProcNatlAcadSciUSA, 1980,77(3): 1561-1565.

[15]程東, 韓曉英, 張?zhí)炝? 等. 紫杉醇遺傳毒性研究[J]. 毒理學雜志, 2014(3): 231-233.

[16]吳雨龍, 華春, 扶慶權, 等. 蘆蒿總黃酮提取物的急性毒性及遺傳毒性[J]. 食品科學,2014(7): 206-210.

[17]夏祺悅,劉燕萍,楊潤芳, 等. 吳茱萸及其主要成分的遺傳毒性研究[J]. 世界中醫(yī)藥,2014(2): 145-150,154.

收稿日期：2015-08-15

基金項目：南京中醫(yī)藥大學青年自然科學基金資助。

作者簡介：王佳穎，女，助理研究員。研究方向：藥物毒理學。E-mail：lisa850913@hotmail.com

doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2016.02.009

中圖分類號：R285

文獻標識碼：A

文章編號：1006-9690(2016)-02-0027-07

GeneticToxicityofTaxaneDiterpenoidsofTaxus yunnanensis

WangJiaying,HuaWenting,YuDan

(CenterforDrugSafetyEvaluationandResearch,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023，China)

AbstractObjective：To evaluate the safety of 2-deacetoxytaxinine E, 7-deacetoxytaxinine J, 2-deacetoxydecinnamoyl taxinine J and baccatin 3. Methods: Alarmblue Assay was performed to research the IC50of these four compounds in CHL cell. Then, chromosome aberration test in CHL cell and Ames test were conducted to investigated the genetic toxicity of four compounds in vitro.Results: In CHL cell, the IC50was>0.5 mg/mL. No genetic toxicity was observed. Conclusion: Under the conditions of this experiment, four compounds have neither cell toxicity nor genetic toxicity.

Key wordsgenetic toxicity; Taxus yunnanensis; taxane diterpenoids