徐小勇++許曉玲++劉玉玲

摘要：以椪柑愈傷組織和試管苗為材料，通過酶解分離原生質(zhì)體，于液體培養(yǎng)和觀察；采用羥自由基測(cè)定試劑盒和電子順磁共振技術(shù)分析羥自由基變化，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)總活性氧水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的前3 d，愈傷組織原生質(zhì)體羥自由基和總活性氧水平下降，而葉肉原生質(zhì)體則升高；培養(yǎng)的后3 d，除愈傷組織原生質(zhì)體羥自由基水平升高外，其他都下降。椪柑葉肉原生質(zhì)體可能由于氧化脅迫引起死亡，而愈傷組織原生質(zhì)體能較好地控制總活性氧水平從而順利進(jìn)入再生，另外培養(yǎng)6 d時(shí)其羥自由基含量的升高可能與細(xì)胞壁再生等有關(guān)。

關(guān)鍵詞：椪柑；原生質(zhì)體；羥自由基；活性氧

中圖分類號(hào)： S666.104+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0196-03

原生質(zhì)體指采用機(jī)械法或酶解法去除細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，是研究植物生命理論基礎(chǔ)問題的理想體系，還可對(duì)其進(jìn)行各種細(xì)胞及遺傳操作。因此，原生質(zhì)體技術(shù)已廣泛地用于植物體細(xì)胞雜交、遺傳轉(zhuǎn)化、種質(zhì)資源保存、基因瞬時(shí)表達(dá)等方面。在柑橘植物上，原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞雜交技術(shù)為其遺傳育種工作開辟了一條新思路，它已成為柑橘砧木及接穗品種改良的重要手段[1-2]。目前，柑橘原生質(zhì)體主要從愈傷組織和葉片分離得來，但只有愈傷組織分離的原生質(zhì)體可再生成植株，而葉肉原生質(zhì)體目前尚不可分裂再生，還不能用于柑橘遺傳改良[3-4]。迄今，這2種類型原生質(zhì)體再生能力差異的機(jī)制尚不清楚。

雖然原生質(zhì)體再生能力差異普遍存在于植物、基因型、外植體之間，但是這種現(xiàn)象的相關(guān)研究進(jìn)展緩慢。直至20世紀(jì)90年代，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)活性氧在原生質(zhì)體分離中大量產(chǎn)生[5-7]，然而在原生質(zhì)體培養(yǎng)階段，不同再生能力的原生質(zhì)體活性氧含量雖然都表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，但是不可再生型原生質(zhì)體活性氧水平相對(duì)較高[8-9]。上述研究表明，氧化脅迫可能是造成不可再生型原生質(zhì)體再生難的原因。為此，筆者所在課題組以氧化脅迫為切入點(diǎn)開展了柑橘原生質(zhì)體再生能力差異的研究[10-11]，重點(diǎn)對(duì)總活性氧水平及活性氧另一種重要成分（羥自由基）進(jìn)行檢測(cè)，以期了解活性氧在柑橘原生質(zhì)體再生中的作用。

1材料與方法

1.1植物材料

椪柑（Citrus reticulata）胚性愈傷組織用懸浮培養(yǎng)基（MT+0.5 mg/L ME+1.5 mg/L谷胺酰氨+50 g/L蔗糖）懸浮培養(yǎng)4代后用于原生質(zhì)體分離；取新鮮椪柑果實(shí)，挑選出大粒種子，經(jīng)消毒后接種于MT培養(yǎng)基上，大約培養(yǎng)30～40 d，葉片充分展開后用于原生質(zhì)體分離。

1.2椪柑原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)

原生質(zhì)體的分離與純化參照Xu等的方法[10]，稍作修改。

愈傷組織原生質(zhì)體的分離：取3 g愈傷組織于培養(yǎng)皿中，分別加入2 mL的0.7 mol/L EME培養(yǎng)基（MT+0.7 mol/L蔗糖+0.5 g/L ME）和酶液（2%纖維素酶R-10+2%離析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaCl2·2H2O）。封口膜封口，28 ℃暗條件下酶解 18～20 h。

葉肉原生質(zhì)體的分離：用手術(shù)刀片將試管苗葉片切成 1～2 mm 寬的條狀，之后放入預(yù)先加入2 mL 0.6 mol/L EME（MT+0.6 mol/L蔗糖+0.5 g/LME）培養(yǎng)基中，最后加入 2 mL 酶液（2% 纖維素酶R-10+2%離析酶R-10+10.9%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaCl2·2H2O）。封口膜封口，28 ℃暗條件下酶解20～24 h。

酶解完成后的原生質(zhì)體（酶解混合物）通過孔徑為 45 μm 的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，并用CPW13洗滌、離心。然后采用CPW13/CPW26界面梯度離心，用吸管將2個(gè)液面間的原生質(zhì)體帶吸出。最后將原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基MA（MT+0.15 mol/L蔗糖+0.45 mol/L甘露醇+40 mg/L腺嘌呤）中，封口轉(zhuǎn)入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3椪柑原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中羥自由基含量變化的測(cè)定

分別采用羥自由基測(cè)定試劑盒和電子順磁共振（EPR）儀方法測(cè)定。

羥自由基測(cè)定試劑盒測(cè)定方法：參照南京建成生物科技有限公司的羥自由基測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行。試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 17.0進(jìn)行分析。

電子順磁共振儀測(cè)定方法：首先收集原生質(zhì)體懸液，離心棄上清，用CPW13清洗2次，再用CPW13重懸原生質(zhì)體，最后將90 μL原生質(zhì)體懸液與30 μL濃度為200 mmol/L的二甲基吡啶N-氧化物（DMPO）溶液充分混勻后，采用電子順磁共振儀（Brucker ESP300）記錄捕獲羥自由基的電子順磁共振信號(hào)。

1.4椪柑原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中活性氧含量的測(cè)定

采用碧云天生物技術(shù)有限公司的活性氧檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。具體步驟如下：首先將原生質(zhì)體懸浮于10 μmol/L的二氯熒光素雙醋酸鹽（DCFH-DA）溶液中，37 ℃水浴鍋內(nèi)孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和原生質(zhì)體充分接觸。之后，用原生質(zhì)體培養(yǎng)液MA將處理完的原生質(zhì)體洗滌3次，以充分除去未進(jìn)入原生質(zhì)體內(nèi)的DCFH-DA。最后設(shè)置1個(gè)對(duì)照管，按照1 ∶1 000的體積比加入陽性對(duì)照Rosup，并設(shè)置1個(gè)未加DCFH-DA的陰性對(duì)照。做好前處理后，30 min內(nèi)上樣，用FACSAria流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1椪柑原生質(zhì)體培養(yǎng)與取材

為便于采集原生質(zhì)體用于試驗(yàn)分析，本研究采用液體培養(yǎng)方法，并進(jìn)行持續(xù)觀察。剛分離的椪柑愈傷組織原生質(zhì)體與葉肉原生質(zhì)體細(xì)胞膜完整（圖1-A、圖1-D），活力較高，而在培養(yǎng)6 d的過程中表現(xiàn)出明顯差異。絕大多數(shù)愈傷組織原生質(zhì)體的細(xì)胞膜保持完整，且在培養(yǎng)6 d時(shí)多數(shù)原生質(zhì)體變橢圓（圖1-E、圖1-F），表明已完成了細(xì)胞壁再生。葉肉原生質(zhì)體在培養(yǎng)3 d時(shí)就大量破裂死亡，培養(yǎng)6 d幾乎全部破裂（圖1-B、圖1-C）。因此，本研究以剛分離（0 d）、培養(yǎng)3、6 d的原生質(zhì)體為試驗(yàn)材料，進(jìn)行羥自由基和總活性氧水平的檢測(cè)。

2.2椪柑原生質(zhì)體羥自由基含量的測(cè)定

本研究中，采用間接法（羥自由基測(cè)定試劑盒）和直接法（電子順磁共振測(cè)定法）分析了椪柑原生質(zhì)體羥自由基含量的變化。

2.2.1羥自由基測(cè)定試劑盒檢測(cè)椪柑原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中產(chǎn)羥自由基能力變化從剛分離到培養(yǎng)6 d，愈傷組織原生質(zhì)體產(chǎn)羥自由基能力先下降后上升；而葉肉原生質(zhì)體則相反，即先上升后下降（圖2）。 剛分離時(shí)的愈傷組織原生質(zhì)體產(chǎn)羥自由基能力是葉肉原生質(zhì)體的2.6倍，這種差異可能與原生質(zhì)體來源不同有關(guān)。培養(yǎng)3 d時(shí)，愈傷組織原生質(zhì)體體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)被激活[10]，產(chǎn)羥自由基能力受到抑制；而在培養(yǎng)6 d時(shí)，產(chǎn)羥自由基能力卻意外升高。對(duì)于葉肉原生質(zhì)體，在培養(yǎng)3 d時(shí)出現(xiàn)大量破裂死亡現(xiàn)象（圖1-B），這與其產(chǎn)羥自由基能力的上升相符合，至培養(yǎng)6 d時(shí)，葉肉原生質(zhì)體幾乎全部破裂，產(chǎn)羥自由基能力也明顯下降。

2.2.2電子順磁共振波譜儀檢測(cè)椪柑原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中羥自由基變化本研究利用自旋捕捉劑DMPO捕捉羥自由基后，經(jīng)電子順磁共振儀檢測(cè)，得到羥自由基的特征譜圖，根據(jù)相對(duì)峰高可判斷信號(hào)的強(qiáng)弱，即羥自由基含量的高低。通過比較愈傷組織原生質(zhì)體和葉肉原生質(zhì)體的電子順磁共振譜圖（圖3、圖4），發(fā)現(xiàn)2種原生質(zhì)體皆無DMPO-OH·的EPR 譜的典型譜線，可能是原生質(zhì)體含有的金屬離子影響了 DMPO-OH· 的EPR譜信號(hào)，但仍可通過信號(hào)強(qiáng)弱判斷相對(duì)羥自由基含量的高低。對(duì)于愈傷組織原生質(zhì)體，在培養(yǎng)的0、3、6 d，0 d的DMPO-OH·的信號(hào)最強(qiáng)，3 d時(shí)減弱，6 d時(shí)又增強(qiáng)（圖3）；而葉肉原生質(zhì)體在3 d時(shí)DMPO-OH·的信號(hào)最強(qiáng)，6 d時(shí)最弱（圖4），這些研究結(jié)果與產(chǎn)羥自由基能力測(cè)定結(jié)果一致?？梢姡摲椒芸焖贆z測(cè)原生質(zhì)體或細(xì)胞中羥自由基變化。此外，對(duì)于如何消除或減少細(xì)胞內(nèi)其他成分對(duì)羥自由基信號(hào)的干擾還有待進(jìn)一步研究。

2.3流式細(xì)胞儀測(cè)定椪柑原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中總活性氧含量變化

由于各種活性氧能氧化熒光染料DCFH-DA成發(fā)強(qiáng)綠色熒光的DCF，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞胞內(nèi)的DCF熒光強(qiáng)度即可反映細(xì)胞的總活性氧水平。本研究中也采用該方法檢測(cè)了原生質(zhì)體在培養(yǎng)6 d過程中總活性氧含量的變化。結(jié)果

表明，剛分離的愈傷組織原生質(zhì)體具有較高水平的活性氧，但在培養(yǎng)3 d時(shí)顯著下降，之后略有降低。而葉肉原生質(zhì)體的活性氧含量在培養(yǎng)前3 d無顯著差異，即前期保持較高的活性氧水平，之后下降（圖5）。

3討論

在正常的代謝下，高等植物細(xì)胞不可避免地產(chǎn)生羥自由基、超氧陰離子和過氧化氫等活性氧，逆境條件下活性氧會(huì)過多積累，易引起氧化脅迫，引發(fā)或加劇膜脂過氧化，甚至造成細(xì)胞死亡。在葡萄、油菜、煙草等幾種植物上開展的研究結(jié)果表明，活性氧的水平對(duì)原生質(zhì)體再生能力會(huì)產(chǎn)生一定的影響[5-7]，因此本研究檢測(cè)了羥自由基和總活性氧水平的變化。椪柑愈傷組織原生質(zhì)體和葉肉原生質(zhì)體在培養(yǎng)的6 d過程中，其羥自由基和總活性氧含量表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。目前已知，原生質(zhì)體分離是一個(gè)逆境過程，易引起活性氧的過多積累，會(huì)造成細(xì)胞的損傷或死亡[12-14]。因此，培養(yǎng)早期活性氧的控制是原生質(zhì)體重新進(jìn)入細(xì)胞周期的關(guān)鍵。本研究中，在培養(yǎng)的前3 d，愈傷組織原生質(zhì)體的羥自由基和總活性氧水平都下降?？紤]到分離后愈傷組織原生質(zhì)體的抗氧化酶（超氧化歧化酶、過氧化物酶）活力和抗氧化物質(zhì)含量（還原型維生素C、還原型谷胱甘肽）都升高[10]，因此我們認(rèn)為分離后抗氧化系統(tǒng)的激活是原生質(zhì)體再生的必要條件。而對(duì)于不可分裂再生的葉肉原生質(zhì)體，培養(yǎng)的前3 d，其羥自由基和總活性氧水平略有升高，這可能是造成其大量死亡的重要原因之一。在培養(yǎng)的后3 d，愈傷組織原生質(zhì)體的總活性氧水平略有下降，而羥自由基含量上升，此外過氧化氫含量也是上升的[10]，我們分析愈傷組織原生質(zhì)體的羥自由基升高可能與細(xì)胞壁再生及分裂有關(guān)?？梢姡钚匝踉谠|(zhì)體再生中具有雙面性，既會(huì)造成原生質(zhì)體再生難，也會(huì)對(duì)原生質(zhì)體再生起重要的調(diào)控作用。

雖然我們的研究已清楚了氧化脅迫是椪柑愈傷組織原生質(zhì)體與葉肉原生質(zhì)體再生能力差異的原因。但仍有一些問題有待解決。如抗氧化物質(zhì)的添加是否可以促進(jìn)原生質(zhì)體再生？2種類型的原生質(zhì)體其活性氧主要分布在哪些部位？主要相關(guān)基因是哪些？部分工作已在進(jìn)行中，相信隨著研究進(jìn)一步的深入，將揭示柑橘原生質(zhì)體再生能力差異的機(jī)制，同時(shí)為促進(jìn)利用原生質(zhì)體再生體系進(jìn)行柑橘及其他果樹遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新奠定理論與技術(shù)基礎(chǔ)。

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