李艷麗++金周雨++李玉

摘要：采用溶壁酶進(jìn)行刺芹側(cè)耳菌絲原生質(zhì)體的制備，研究培養(yǎng)基、滲透壓穩(wěn)定劑和稀釋劑PPRL對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響，以從中篩選原生質(zhì)體再生的最佳培養(yǎng)條件。對(duì)再生菌絲進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，提取原生質(zhì)體再生菌株菌絲體胞內(nèi)多糖（IPS）、發(fā)酵液胞外多糖（EPS），并進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明：最佳再生培養(yǎng)基為PPR，滲透壓穩(wěn)定劑、稀釋劑均為0.6 mol/L甘露醇；此時(shí)原生質(zhì)體經(jīng)過(guò)14 d左右的培養(yǎng)可再生出白色菌落，再生率為0.76%；原生質(zhì)體再生菌絲IPS、EPS含量差異明顯，多株高于親本菌株。研究結(jié)果為刺芹側(cè)耳高產(chǎn)多糖菌株的選育奠定了前期基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：刺芹側(cè)耳；多糖含量；原生質(zhì)體；再生率

中圖分類號(hào)： S646.1+41.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0255-03

eryngii）別稱杏鮑菇，是一種珍稀美味食用菌[1]，它不但營(yíng)養(yǎng)豐富[2]，而且具有保健功能[3-5]。近年的研究表明，刺芹側(cè)耳富含有藥理活性的多糖，展現(xiàn)了較強(qiáng)的抗氧化作用[6]、抗腫瘤活性[7-8]以及降脂活性[9]。因此可知，刺芹側(cè)耳及其多糖已經(jīng)逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。

原生質(zhì)體是一種具有生物全能性的細(xì)胞，在食用菌的遺傳育種領(lǐng)域具有重要應(yīng)用[10-12]。本研究探索再生條件對(duì)刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體再生率的影響，旨在篩選出再生率最高的培養(yǎng)條件；同時(shí)對(duì)原生質(zhì)體再生菌株菌絲體胞內(nèi)多糖（IPS）、發(fā)酵液胞外多糖（EPS）進(jìn)行提取，并測(cè)定其含量，以期為刺芹側(cè)耳高產(chǎn)多糖菌株的選育奠定前期基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株為刺芹側(cè)耳菌株HB3，購(gòu)自吉林省高新技術(shù)園區(qū)。溶壁酶購(gòu)自廣東省微生物研究所。

培養(yǎng)基及其配方如下。PDR：200 g馬鈴薯、2 g葡萄糖、20 g瓊脂粉、0.6 mol/L甘露醇，用蒸餾水補(bǔ)足至1 000 mL。

POR：在PDR中添加3 g KH2PO4、1.5 g MgSO4、10 mg維生素B1。PPR：在POR中添加2 g蛋白胨、2 g酵母膏。CMR：20 g葡萄糖、2 g蛋白胨、2 g酵母膏、0.46 g KH2PO4、1.0 g K2HPO4、0.5 g MgSO4、20 g瓊脂粉、0.6 mol/L甘露醇，用蒸餾水補(bǔ)足至1 000 mL。PMR：10 g麥芽糖、4 g葡萄糖、4 g酵母膏、1.0 g KH2PO4、1.0 g MgSO4、10 g可溶性淀粉、20 g瓊脂粉、0.6 mol/L甘露醇，用蒸餾水補(bǔ)足至1 000 mL。YPR：30 g玉米粉、20 g葡萄糖、1.0 g蛋白胨、1.0 g KH2PO4、0.5 g MgSO4、20 g瓊脂粉、0.6 mol/L甘露醇，用蒸餾水補(bǔ)足至 1 000 mL。

以上培養(yǎng)基于121 ℃高壓滅菌20 min，備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1原生質(zhì)體的制備采用相應(yīng)文獻(xiàn)的方法[13]。

1.2.2原生質(zhì)體的再生將原生質(zhì)體懸液用0.6 mol/L甘露醇適當(dāng)稀釋，取100 μL涂布于再生培養(yǎng)基中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，同時(shí)用蒸餾水稀釋原生質(zhì)體懸液作為空白對(duì)照。再生率計(jì)算公式：

再生率=再生培養(yǎng)基中菌落數(shù)/涂布的原生質(zhì)體數(shù)×100%。

1.2.3培養(yǎng)基種類對(duì)再生率的影響用“1.1”節(jié)中培養(yǎng)基進(jìn)行原生質(zhì)體再生，考察其對(duì)再生率的影響。

1.2.4滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)再生率的影響以甘露醇、蔗糖、MgSO4、NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，分別考察其在濃度為0.4、0.6、0.8 mol/L時(shí)對(duì)再生率的影響。

1.2.5PPRL對(duì)再生率的影響PPRL為PPR的液體培養(yǎng)基，考察其對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響。

1.2.6再生菌株多糖的發(fā)酵培養(yǎng)、提取及含量的測(cè)定隨機(jī)篩選原生質(zhì)體再生菌株10株（編號(hào)為SH1至SH10），先經(jīng)PPA（無(wú)0.6 mol/L甘露醇的PPR）活化培養(yǎng)，然后用直徑 1 cm 打孔器取出2塊菌絲，接種在CMA（無(wú)0.6 mol/L甘露醇的CMR液體培養(yǎng)基）中，于25 ℃、160 r/min培養(yǎng)5～6 d，轉(zhuǎn)接至CMA加富培養(yǎng)基（CMA中添加20 g玉米浸汁）中，于25 ℃、160 r/min培養(yǎng)9 d，真空抽濾菌絲，冷凍干燥。采用相應(yīng)文獻(xiàn)方法提取IPS、EPS[14]，采用苯酚硫酸法測(cè)定含量[15]。

2結(jié)果與分析

2.1原生質(zhì)體的制備及再生

由圖1可見(jiàn)：鏡檢下原生質(zhì)體呈現(xiàn)球狀，無(wú)殘余菌絲片段，說(shuō)明采用本試驗(yàn)方法可獲得純凈的刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體，且產(chǎn)量較高，達(dá)到6.34×107個(gè)/mL。經(jīng)過(guò)12～14 d的培養(yǎng)，原生質(zhì)體可以萌發(fā)出幼眼可見(jiàn)的白色菌落，空白對(duì)照則無(wú)再生菌落生長(zhǎng)，進(jìn)一步說(shuō)明原生質(zhì)體純化較好。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，可見(jiàn)菌落形態(tài)各異，或濃密，或稀疏，且大小不等。有的菌落形態(tài)較特殊，中心、外周突起，形成1個(gè)環(huán)狀凹陷（圖1-Ⅱ中箭頭指示）；有的菌落間會(huì)產(chǎn)生拮抗（圖1-Ⅲ中箭頭指示）。這些現(xiàn)象表明，再生菌落之間遺傳性狀差異明顯。

2.2培養(yǎng)基種類對(duì)再生率的影響

培養(yǎng)基種類對(duì)再生率的影響如圖2所示：PPR培養(yǎng)基再生率最高，為0.76%；其次是PMR、YPR、CMR，再生率與PPR相差不明顯；再次是POR、PDR，它們的再生率明顯偏低，PDR的再生率僅為0.32%。

此外，原生質(zhì)體在不同培養(yǎng)基中再生成菌落時(shí)間并不一致。在YPR中約12 d，而在其他培養(yǎng)基中約14 d，可見(jiàn)再生培養(yǎng)基成分對(duì)原生質(zhì)體再生率有較大影響。綜上可知，PPR、PMR、YPR、CMR均有利于原生質(zhì)體的再生，可作為再生培養(yǎng)基使用，本試驗(yàn)選取PPR作為最終再生培養(yǎng)基。

2.3滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)再生率的影響

由圖3可知：甘露醇、蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑的再生率明顯高于無(wú)機(jī)滲透壓穩(wěn)定劑MgSO4、NaCl，且再生率與滲透壓穩(wěn)定劑的濃度明顯相關(guān)，當(dāng)濃度為0.6 mol/L時(shí)（除0.8 mol/L蔗糖），原生質(zhì)體的再生率最高，其次是0.8 mol/L，濃度為0.4 mol/L 時(shí)再生率最低。0.6 mol/L的甘露醇再生率達(dá)到0.76%，0.4 mol/L NaCl 再生率僅為0.25%。綜上可知，0.6 mol/L 甘露醇、0.6～0.8 mol/L蔗糖均有助于刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體的再生，可作為滲透壓穩(wěn)定劑使用，因此本試驗(yàn)選取0.6 mol/L甘露醇作為最終的滲透壓穩(wěn)定劑。

2.4PPRL對(duì)再生率的影響

由圖4可知：PPRL作為稀釋劑，再生率明顯低于0.6 mol/L 甘露醇，僅為0.46%，說(shuō)明0.6 mol/L甘露醇更有利于原生質(zhì)體的再生。

2.5多糖含量的測(cè)定結(jié)果

由表1可知：原生質(zhì)體再生菌株與親本菌株的IPS、EPS含量差異均較大，有4株再生菌株IPS含量高于親本菌株HB3，分別為SH3、SH4、SH5、SH7，其中SH7最高，為（127.8±3.2）mg/g，比親本菌株高34.8%；有6株再生菌株EPS含量高于親本菌株，分別為SH1、SH2、SH4、SH6、SH8、SH9，其中SH9的EPS含量最高，為（324.4±8.3）mg/L，比親本菌株高42.1%。其他幾株菌株的IPS、EPS含量或接近或低于親本菌株。

3討論與結(jié)論

原生質(zhì)體酶解后需要過(guò)濾純化除去殘余的菌絲片段，以減少對(duì)原生質(zhì)體后續(xù)操作的影響。本研究通過(guò)溶壁酶制備系統(tǒng)較好地實(shí)現(xiàn)了原生質(zhì)體的純化。原生質(zhì)體再生受到多種因素的影響[16-18]，但有關(guān)刺芹側(cè)耳原生質(zhì)體最佳再生條件的研究鮮有報(bào)道。

本研究設(shè)計(jì)了不同的培養(yǎng)基、滲透壓穩(wěn)定劑及稀釋劑，以期篩選最佳再生條件。結(jié)果顯示：PPR培養(yǎng)基為最佳再生培養(yǎng)基，再生率是PDR的2.37倍。筆者認(rèn)為，與PDR相比，PPR含有蛋白胨、酵母膏等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它們更有利于原生質(zhì)體再生為菌絲。0.6 mol/L甘露醇作為最佳滲透壓穩(wěn)定劑，再生率比0.4 mol/L NaCl高2.04倍。一般認(rèn)為，有機(jī)滲透壓穩(wěn)定劑比無(wú)機(jī)滲透壓穩(wěn)定劑更有利于食用菌原生質(zhì)體的再生[16-17]，本試驗(yàn)結(jié)果與其一致。有報(bào)道稱，真菌細(xì)胞壁成分主要為葡萄糖、幾丁質(zhì)[19]；筆者認(rèn)為，甘露醇、蔗糖等糖醇類有機(jī)滲透壓穩(wěn)定劑更有利于轉(zhuǎn)化為真菌的細(xì)胞壁物質(zhì)，這是再生率高的主要原因。

再生菌株、親本菌株IPS、EPS含量測(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)原生質(zhì)體再生的菌絲多糖含量與親株相比差異明顯，有幾株多糖含量分別高于親株，暗示其遺傳物質(zhì)可能發(fā)生了變異，這點(diǎn)通過(guò)再生菌絲的形態(tài)和菌絲間拮抗也可以得到初步證實(shí)。通過(guò)原生質(zhì)體再生篩選刺芹側(cè)耳高產(chǎn)多糖菌株鮮有報(bào)道，因此這些菌株的獲得具有一定的理論和實(shí)際參考價(jià)值。

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