邱貞娜，朱秀同，梁武*，李曉艷，郁宏偉，劉濤，趙玉龍，劉超

（1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司河北保定071000；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心河北保定071000）

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細胞密度對豬圓環(huán)病毒增殖與檢測準確度的影響

邱貞娜1，2，朱秀同1，2，梁武1，2*，李曉艷1，2，郁宏偉1，2，劉濤1，2，趙玉龍1，2，劉超1，2

（1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司河北保定071000；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心河北保定071000）

摘要：為了提高豬圓環(huán)病毒毒液生產(chǎn)批次間滴度的穩(wěn)定性，提高培養(yǎng)毒液病毒滴度檢驗和成品疫苗效力檢驗的準確度，本實驗對PK15細胞接種密度進行了研究。結(jié)果顯示：病毒培養(yǎng)階段，細胞最佳接種密度為2～2.5×105/mL，毒液滴度和疫苗效力檢驗時，最佳細胞接種密度為1.5～2×105/mL。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒；細胞密度；病毒滴度；疫苗效力檢驗

豬圓環(huán)病毒是 （Porcine circovirus type 2，PCV2）一種圓形小顆粒病毒，粒子直徑為17 nm，呈20面體對稱，無囊膜，CsCl浮力密度為1.37 g/cm3，是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的病原。PCV2感染可導(dǎo)致動物機體免疫系統(tǒng)功能嚴重受損，形成免疫抑制，增強對其它多種病原體的易感性，引起在正常情況下具有較低致病性的病原體感染發(fā)病，使豬群發(fā)生難以控制的復(fù)發(fā)性疾病和多重感染［1］。該病呈世界流行，我國的大型豬場普遍存在該病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟損失，疫苗免疫是控制PCV2感染引起相關(guān)疾病的重要手段。

PK15細胞是PCV2敏感細胞系，被廣泛用于疫苗生產(chǎn)。本實驗就培養(yǎng)和檢驗PCV2的PK15細胞密度參數(shù)進行了研究，以期找到最佳病毒培養(yǎng)細胞密度，保證疫苗生產(chǎn)中培養(yǎng)毒液批次間滴度的穩(wěn)定性，提高病毒滴度檢驗和疫苗效力檢驗的準確度。

1材料和方法

1.1主要試劑和生物材料

豬腎傳代細胞系（PK15細胞）和豬圓環(huán)病毒2型（ZJ/C株）由公司種毒室保存和提供；新生牛血清、MEM干粉培養(yǎng)基購自gibco公司；PCV2-cap單克隆抗體購自浙江同點生物技術(shù)有限公司；羊抗鼠二抗購自KPL公司。

1.2豬圓環(huán)病毒培養(yǎng)

長成良好單層的PK15細胞，采用EDTA-胰酶消化，經(jīng)吹打分散均勻，細胞計數(shù)后，接種培養(yǎng)瓶，同時加入豬圓環(huán)病毒，37℃培養(yǎng)72～96 h收獲，將培養(yǎng)瓶反復(fù)凍融3次，取樣后冷凍保存。

1.3病毒滴度檢驗

將病毒液用MEM液10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7三個滴度接種96孔板，0.1 mL/孔，每滴度6孔，同時接種分散均勻的PK15細胞，0.1 mL/孔，置37℃培養(yǎng)72 h，冷丙酮固定，采用IFA法檢驗，統(tǒng)計病毒感染孔數(shù)，按照Reed-Muench法計算半數(shù)細胞感染量（TCID50/mL）。

1.4疫苗效力檢驗

按照《豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（ZJ/C株）制造及檢驗試行規(guī)程》進行滅活疫苗制備和效力檢驗。效力檢驗采用小鼠攻毒法，將疫苗免疫健康Balb/c小鼠，并同空白對照鼠進行攻毒，將免疫組和空白對照組小鼠脾研磨后，在PK15細胞上進行培養(yǎng)，用IFA法檢測PCV2抗原，出現(xiàn)綠色熒光即為陽性?？瞻讓φ招∈髴?yīng)至少7/10為病毒分離陽性，免疫小鼠應(yīng)至少7/10為病毒分離陰性。

2結(jié)果

2.1細胞密度對PCV2培養(yǎng)滴度的影響

分散均勻的PK15細胞，分別以每毫升細胞數(shù)量為1.5×105、2×105、2.5×105、3×105、4×105的細胞密度接種培養(yǎng)瓶，進行病毒培養(yǎng)，并重復(fù)接毒培養(yǎng)4個批次，收獲的病毒液的病毒滴度（見表1）。

表1 不同細胞密度收獲毒液病毒滴度

試驗結(jié)果表明，細胞最佳接種密度為2～2.5× 105/mL時，單批次病毒液滴度最高，批次間滴度水平最穩(wěn)定。而細胞密度為1.5×105/mL和4×105/mL時，病毒滴度明顯下降，而細胞密度為3×105/mL時，批次差異增大。

2.2細胞密度對病毒滴度檢驗的影響

同一病毒液樣品分別以每毫升PK15細胞數(shù)量為1.5×105、2×105、2.5×105、3×105、4×105的細胞密度進行病毒滴度測定，并且重復(fù)3次。檢驗結(jié)果（見表2）。

表2 不同細胞密度的檢驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明，細胞密度為1.5～2×105/mL時，測定效價最高，批次間浮動最小。

2.3細胞密度對病毒分離率的影響

空白對照組鼠脾，分別用每毫升PK15細胞數(shù)量為1.5×105、2×105、3×105的細胞密度進行測定，并重復(fù)檢測三個批次的空白對照組鼠脾。測定結(jié)果（見表3）。

表3 不同細胞密度的病毒分離比率

由結(jié)果可得，細胞密度控制在1.5～2×105/mL時，陽性對照鼠脾的分離率高，細胞密度達到3× 105/mL時，病毒分離率明顯下降。

3討論

實驗結(jié)果顯示，在病毒培養(yǎng)階段，細胞最佳接種密度為2～2.5×105/mL，細胞密度過低或過高，收獲毒液的病毒滴度均會下降；病毒滴度和成品疫苗效力檢驗時，最佳細胞接種密度為1.5～2×105/mL，在這個細胞密度下，測定值最高，批次間最穩(wěn)定。PCV2在體外培養(yǎng)時，并不會造成培養(yǎng)細胞的病變，病毒復(fù)制過程中，依賴宿主細胞的聚合酶，這種酶類主要是在細胞繁殖的S周期中合成［2，3］，所以豬圓環(huán)病毒適合在增殖旺盛的細胞上增殖，而不同的細胞接種密度，會影響細胞生長，尤其是細胞培養(yǎng)一定時間后，隨著細胞密度的增加，會出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象，影響細胞的分裂增殖，從而影響病毒的復(fù)制。在豬圓環(huán)病毒生產(chǎn)和檢驗中精確控制細胞接種密度，可保證生產(chǎn)批次間滴度的穩(wěn)定性，提高病毒滴度和成品效力檢驗的準確度。（編輯：趙曉松）

參考文獻

［1］宣長和，馬春全，陳志寶［M］.3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：172-180.

［2］劉長明，張超范，危艷武，等.豬圓環(huán)病毒2型細胞培養(yǎng)適應(yīng)毒株的培育和鑒定［J］.中國獸醫(yī)預(yù)防學(xué)報，2006，（3）：248-252.

［3］嚴偉東，李文浩，李文濤等.豬圓環(huán)病毒2型WH株的優(yōu)化培養(yǎng)［J］.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2010學(xué)術(shù)年會論文集，2010：1184-1188.

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2016.6.044

基金項目：國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2014GB2A200324）

作者簡介：邱貞娜（1982-），女，河北保定人，助理獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)生物制品方面研究，E-mail：qzn8082@163.com。

*通信作者：梁武（1968-），男，天津人，博士，高級獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)生物制品方面研究，E-mail：sales@ringpu.com。

The Effect of Cell Density on Porcine Circovirus Proliferation and Detection Accuracy

Zhen Naqiu1，2，Xiu Tongzhu1，2，Liang Wu1，2*，Xiao Yanli1，2，Hong Weiyu1，2，Liu Tao1，2，Yu Longzhao1，2，Liu Chao1，2
（1.Ringpu（Baoding）Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，Baoding，Hebei，071000；2.Engineering and Technology Research Center of Veterinary Biological Products，Baoding，Hebei，071000）

Abstract：In order to improve the stability of the batch of porcine cirovirus proliferation，and improve the testing accuracy for virus titer or vaccine efficacy，we studied the density of the PK15 cell inoculation.The results show that，the optimal cell inoculation density is 2～2.5 x 105/mL in the virus culture stage，while the best cell inoculation density is 1.5～2 x 105/mL in the stage of the testing for virus titer or vaccine efficacy.

Keywords：Porcine circovirus virus；Cell density；Virus titer；Vaccine efficacy test