蘇，周朝東，黃哲Δ，尉然

(1.天津市藥品檢驗(yàn)所 生化室，天津 300070；2.天津華立達(dá)生物工程有限公司，天津 300457)

熒光定量PCR法測(cè)定重組人干擾素α2b原液中宿主DNA的殘留

(1.天津市藥品檢驗(yàn)所 生化室，天津 300070；2.天津華立達(dá)生物工程有限公司，天津 300457)

目的 建立重組人干擾素α2b原液中宿主DNA殘留量測(cè)定的方法并進(jìn)行驗(yàn)證,用于對(duì)該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。方法 通過wako DNA提取試劑盒提取干擾素原液中的宿主殘留DNA，再利用SYBRGreen染料法對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行定量PCR測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA殘留量分析。對(duì)建立的方法進(jìn)行引物特異性以及結(jié)果準(zhǔn)確性和精密性的驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)企業(yè)提供的3批干擾素原液中的殘留DNA測(cè)定。結(jié)果 該方法檢測(cè)假單胞菌基因組DNA的最低準(zhǔn)確定量濃度可達(dá)12 fg/μL，DNA含量在12 fg/μL～120 ng/μL范圍內(nèi)線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r=0.998； wako DNA提取試劑盒提取不同量的加標(biāo)樣品回收率均在50%～200%范圍內(nèi)；該方法檢測(cè)3批干擾素原液的DNA殘留量均低于標(biāo)準(zhǔn)限度，符合《中國(guó)藥典》三部2010年版和2015年版中關(guān)于假單胞菌產(chǎn)重組人干擾素α2b原液中宿主DNA殘留量的要求。結(jié)論 wako DNA提取試劑盒能解決干擾素原液中樣品前處理的技術(shù)難點(diǎn)，與定量PCR法結(jié)合能夠簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地對(duì)干擾素原液中殘留的DNA定量測(cè)定。

wako DNA提取試劑盒；熒光定量PCR；假單胞菌；干擾素；DNA殘留；質(zhì)量控制

重組人干擾素α2b具有廣譜抗病毒、抑制細(xì)胞增殖、提高機(jī)體免疫功能等作用[1-3]?！吨袊?guó)藥典》三部2010年版和2015年版收載的干擾素制劑均由大腸桿菌、釀酒酵母和假單胞菌發(fā)酵產(chǎn)生[4-5]。天津華立達(dá)生物工程有限公司生產(chǎn)的重組人干擾素α2b即由假單胞菌攜帶能夠產(chǎn)生人白細(xì)胞干擾素α2b基因的質(zhì)粒發(fā)酵產(chǎn)生，臨床主要用于治療急慢性病毒性肝炎、帶狀皰疹、尖銳濕疣等。因宿主菌殘留的DNA具有潛在的危害性，所以需要對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中的宿主殘留DNA進(jìn)行質(zhì)量控制[6]?！吨袊?guó)藥典》三部2010年版和2015年版對(duì)干擾素原液中宿主殘留DNA量都作了規(guī)定，兩版藥典在該處的區(qū)別是2010年版要求原液中宿主DNA殘留量不得超過10 ng/劑量而2015版則要求原液中宿主DNA殘留量每支(瓶)不得超過10 ng。兩版藥典附錄收載的宿主殘留DNA檢測(cè)方法也相同，都是2種方法：第一法是DNA探針雜交法，第二法是熒光染色法[7-8]。地高辛標(biāo)記的探針法具有操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)；而熒光染色法也存在靈敏度低的缺點(diǎn)[9-10]?，F(xiàn)使用以SYBRGreen熒光染料為基礎(chǔ)的熒光定量PCR法來檢測(cè)重組人干擾素α2b原液中的宿主DNA殘留量，該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，可用于假單胞菌發(fā)酵產(chǎn)生的重組人干擾素α2b生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品：3批干擾素原液由天津華立達(dá)生物工程有限公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA：干擾素宿主菌假單胞菌由天津華立達(dá)生物工程有限公司提供，采用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒提取，經(jīng)微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度。

1.1.2 主要試劑及儀器：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根公司，宿主殘留DNA提取試劑盒wako DNA Extractor kit 購自日本wako公司。2×PowerSYBRGreen Master Mix購自美國(guó)ABI公司，微量紫外可見分光光度計(jì)NanoDrop購自美國(guó)Thermo公司，熒光定量PCR儀stepone購自美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 干擾素原液中宿主殘留DNA提?。喝〔煌?hào)的干擾素原液按wako DNA extractor kit說明書提取樣品中的殘留DNA。

1.2.2 q-PCR方法建立及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：利用假單胞菌16sRNA的序列設(shè)計(jì)特異引物，引物序列如下：上游5′-CACG-CCGTAAACGATGTCAA-3′；下游5′-AGCTGCGCCACTAAAATCTCA-3′，引物序列由Invitrogen公司合成。反應(yīng)體系中各成分的加入量為：上下游引物各10 μM各加入1 μL，2×PowerSYBRGreen Master Mix 10 μL，模板1 μL，超純水 7 μL，總體系20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃再次延伸5 min。取滅菌超純水按10倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA，濃度從120 ng/μL～0.12 fg/μL,以各濃度的DNA為模板行PCR擴(kuò)增。以模板DNA濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性擬合，求出回歸方程。每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣品亦做3個(gè)復(fù)孔。

1.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.1 引物特異性的驗(yàn)證：按1.2.2的方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢后做熔解曲線，若無雜峰則說明設(shè)計(jì)的引物特異性較好同時(shí)也說明選擇退火的溫度合適。

1.3.2 準(zhǔn)確性及精密性驗(yàn)證：在干擾素原液批號(hào)為BD150102中分別加入1200、120、12 pg的基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品，采用DNA extractor kit提取總DNA后，進(jìn)行q-PCR檢測(cè)，并按下述公式計(jì)算加標(biāo)回收率(%)，分析該方法的準(zhǔn)確性。加標(biāo)回收率(%)=(實(shí)際測(cè)定值-本底殘留值)/加標(biāo)理論值×100%

1.4 方法應(yīng)用 用建立的q-PCR方法對(duì)3批干擾素原液的宿主DNA殘留量測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 DNA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及純度 經(jīng)提取后測(cè)定，其濃度為120 ng/μL,純度A260/A280為1.87。

2.2 q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程 標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，線性回歸方程為：y=-3.6012x+40.035(r=0.998)，Ct值與模板DNA濃度的對(duì)數(shù)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998。

圖1 假單胞菌基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of pseudomonas genome DNA

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 引物特異性的驗(yàn)證：在q-PCR擴(kuò)增不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)DNA做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)給熒光定量PCR儀設(shè)置熔解曲線步驟，實(shí)驗(yàn)證明除主峰之外無雜峰，證明引物特異性良好，退火溫度適當(dāng)，符合實(shí)驗(yàn)要求。熔解曲線見圖2。

圖2 熔解曲線分析Fig.2 Analysis of melt curve

2.3.2 準(zhǔn)確性及精密性驗(yàn)證：干擾素原液的加標(biāo)回收率在q-PCR可接受范圍內(nèi)(50%～200%)，不同濃度加標(biāo)回收率的變異系數(shù)均在20%以內(nèi)。見表1。

表1 干擾素原液不同加標(biāo)量樣品的回收率

2.4 方法應(yīng)用 檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾素原液中宿主DNA殘留量均遠(yuǎn)低于10ng/劑量，符合《中國(guó)藥典》三部(2010年版)的相關(guān)要求。見表2。

表2 干擾素原液中宿主DNA殘留量的測(cè)定結(jié)果

3 討論

生物制品的質(zhì)量控制不僅是對(duì)終產(chǎn)品的質(zhì)量控制，更是對(duì)整個(gè)生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制。生物制品在生產(chǎn)過程中宿主殘留的微量DNA本身可引起人體免疫反應(yīng)[11-13]，因此，如何選擇靈敏度高、準(zhǔn)確性好、簡(jiǎn)單快速的方法對(duì)生產(chǎn)過程中的宿主殘留DNA進(jìn)行質(zhì)量控制便成為提高產(chǎn)品質(zhì)量的重要一環(huán)。

16sRNA是微生物的核糖體RNA，在進(jìn)化過程中保持相對(duì)恒定的序列信息。因此常被用來設(shè)計(jì)特異性引物以進(jìn)行微生物種屬的鑒別[14]。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-18]利用假單胞菌的16sRNA為序列設(shè)計(jì)特異性引物后通過基于SYBRGreen染料的熒光定量PCR，最終根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度來確定干擾素原液中宿主殘留的DNA量。

《中國(guó)藥典》三部2010年版和2015年版收載的宿主殘留DNA測(cè)定方法有2種，分別是DNA探針雜交法和熒光染色法，二者都存在靈敏度低，操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)[16-17]。熒光定量PCR法則具有靈敏度高、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)生物制品中宿主殘留DNA測(cè)定的最佳方法。目前定量PCR方法尚無統(tǒng)一的驗(yàn)證接受標(biāo)準(zhǔn)，因PCR產(chǎn)物的量呈2n增長(zhǎng)，每增加1個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物量即在原有的基礎(chǔ)上增加1倍，因此回收率的計(jì)算應(yīng)按理論值±2x倍評(píng)價(jià)，通常最大可接受回收率標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)設(shè)定在理論值±21倍，即±1個(gè)循環(huán)(50%～200%)[14]。

宿主殘留DNA屬于微量雜質(zhì)，測(cè)定時(shí)干擾因素多。為確保干擾素原液中殘留DNA能夠被有效提取，本文經(jīng)過對(duì)比，采用了美國(guó)藥典推薦的wako DNA extractor kit，其提取回收率符合要求。在實(shí)驗(yàn)過程中還采用了磁珠提取試劑盒對(duì)干擾素原液進(jìn)行提取，其回收率亦符合要求，只是對(duì)操作人員的技能要求較高，且實(shí)驗(yàn)花費(fèi)較大，因此筆者傾向于選擇wako公司生產(chǎn)的DNA純化試劑盒。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，3批干擾素原液中的宿主DNA殘留量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于10ng/劑量的標(biāo)準(zhǔn)，符合《中國(guó)藥典》的要求。綜上所述，本文建立的檢測(cè)方法可作為假單胞菌產(chǎn)重組人干擾素α2b原液中宿主DNA殘留量測(cè)定的常規(guī)檢測(cè)方法。

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(編校：王儼儼)

Determination of residual host cell DNA in recombinant human interferon α2b substances by quantitative PCR

SU Zhe1, ZHOU Chao-dong1, HUANG Zhe-su1Δ, WEI Ran2

(1.Biochemical Lab, Tianjin Institute for Drug Control, Tianjin 300070, China; 2.Tianjin Hualida Biotechnology Co., Ltd, Tianjin 300457, China)

ObjectiveTo develop and verify a method for determination of residual host cell DNA in recombinant human interferon α2b substances, which is used for the quality control of the product.MethodsThe residual host cell DNA was extracted by wako DNA extractor kit and determined by SYBRGreen based q-PCR using standard DNA as control. The residual host cell DNA was analyzed according to the standard curve. The developed method was verified by primer specifity, results accuracy and precision and used for determination of 3 batches of interferon substances.ResultsThe minimum quantitative limit of residual host cell DNA by the developed method was 12 fg/μL, while the linear range was 12 fg/μL-120 ng/μL, with a correlation coefficient (r) of 0.998. The designed primers were specific to the DNA templates. The recovery rates of spiked samples with different DNA quantity were between 50%-200%. The residual host cell DNA determined by this method were not more than the limit, which were complied with the requirements for residual host cell DNA in Chinese Pharmacopeia (volume III,2010 edition and 2015 edition).ConclusionThe wako DNA extractor kit could successfully solved the technical difficulties of sample pretreatment during residual DNA assay. The q-PCR method was simple, rapid and accurate for quantitation of residual host cell DNA in interferon substances.

wako DNA extractor kit; quantitative PCR(q-PCR); pseudomonas; interferon; residual DNA；quality control

蘇喆，女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：生化藥品檢驗(yàn)與研究,E-mail：marilyn66@163.com；黃哲甦，通信作者，女，本科，主任藥師，研究方向：生化藥品檢驗(yàn)與研究，E-mail：zcd82@163.com。

R917

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.61