李海利，鄧祖麗穎，徐引弟，郎利敏，張青嫻，游 一，王克領(lǐng)，馮亞杰，侯自花，白獻(xiàn)曉*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州450002; 2.鄭州幼兒師范高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450000)

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌磺胺類藥物耐藥基因的檢測

李海利1，鄧祖麗穎2，徐引弟1，郎利敏1，張青嫻1，游 一1，王克領(lǐng)1，馮亞杰1，侯自花1，白獻(xiàn)曉1*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州450002; 2.鄭州幼兒師范高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 450000)

為了解河南省及周邊地區(qū)規(guī)?；i場豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)對磺胺類藥物的耐藥情況，本研究從河南省及周邊地區(qū)49個規(guī)?；i場的肺臟和氣管中分離出79株疑似APP菌株，血清型鑒定結(jié)果顯示，分離菌株為1、2、3、5、7、8、9、10型APP，采用紙片擴(kuò)散法對分離株進(jìn)行了耐藥表型鑒定，同時采用PCR方法對磺胺類藥物耐藥基因進(jìn)行了檢測。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，APP對磺胺類藥物的耐藥率為100%(79/79)。根據(jù)GenBank中登錄的序列，設(shè)計了3對特異性引物，對磺胺類藥物的耐藥基因Sul1、Sul2、Sul3進(jìn)行擴(kuò)增檢測。耐藥基因檢測結(jié)果顯示，分離的79株細(xì)菌中，Sul2基因檢出率為100%(79/79)，Sul1基因的檢出率為79.75%(63/79)，Sul3基因的檢出率為89.87%(71/79)，Sul1和Sul2基因同時檢出率為70.89%(56/79)，Sul1和Sul3同時檢出率為62.03%(49/79)，Sul2和Sul3基因同時檢出率為77.22%(61/79)。

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌； 磺胺類藥物； 耐藥基因

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)是導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原菌之一，已被國際公認(rèn)為是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要細(xì)菌性病原菌[1-3]。目前，養(yǎng)殖業(yè)逐步向規(guī)?；?、集約化方向發(fā)展，中小養(yǎng)殖企業(yè)逐步退出市場，向大型、規(guī)?；姆较虬l(fā)展，養(yǎng)殖密度增大，應(yīng)激因素增多，導(dǎo)致臨床病例越來越復(fù)雜。近年來，臨床抗生素的廣泛應(yīng)用及不合理使用，使細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致多重耐藥菌株和超級耐藥細(xì)菌出現(xiàn)，給細(xì)菌病的防治帶來了挑戰(zhàn)[4-6]。目前，細(xì)菌耐藥研究已成為全球公認(rèn)的熱點(diǎn)，歐美發(fā)達(dá)國家正在使用肽類制劑來替代抗生素[7-11]。

磺胺類藥物是獸醫(yī)臨床常用藥物，這類藥物具有抗菌作用強(qiáng)、抗菌譜廣、毒性小、口服易吸收等優(yōu)點(diǎn)。部分革蘭氏陽性菌如鏈球菌、葡萄球菌、炭疽桿菌、破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌和放線菌等，部分革蘭氏陰性菌如沙門氏菌、大腸桿菌、變形菌、克雷白桿菌、腸道細(xì)菌等，立克次體和原生動物的弓形蟲、球蟲等對磺胺類藥物敏感[12-13]。目前，獸醫(yī)臨床仍大量使用磺胺類藥物?；前奉愃幬锟蛇B續(xù)抑制葉酸途徑中的酶，從而抑制細(xì)菌脫氧胸腺嘧啶的合成，阻斷對氨基苯甲酸(PABA)向二氫葉酸(DFA)的轉(zhuǎn)化[14-18]。對磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制是出現(xiàn)了對磺胺類藥物親和力更低的新二氫葉酸合成酶，其由3個耐藥基因編碼，分別為Sul1、Sul2、Sul3，臨床中主要是通過對這3個基因的檢測來評價和反映磺胺類藥物的耐藥情況。目前，國內(nèi)外有關(guān)APP耐藥基因的研究報道較少，國內(nèi)APP耐藥現(xiàn)狀和耐藥流行分子特征也不清楚。為了解河南省及周邊地區(qū)APP的流行情況和耐藥情況，對從河南省及周邊地區(qū)規(guī)模化豬場豬的肺臟和氣管中分離的APP進(jìn)行了鑒定和磺胺類藥物敏感試驗(yàn)及耐藥基因的擴(kuò)增，旨在為今后APP的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)，為臨床用藥提供參考，為控制耐藥菌株的傳播提供有力的手段。

1 材料和方法

1.1 菌株

從河南省及周邊地區(qū)規(guī)?；i場豬的肺臟和氣管中分離的79株疑似APP菌株、支原體陰性對照菌株，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離保存。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

腦心浸液瓊脂(含10%犢牛血清和100 μg/mL NAD)購于北京路橋生物技術(shù)有限公司。DL 2000 Marker、TaqDNA 聚合酶(5 U/μL) 及相應(yīng)的10×Buffer、dNTPs、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 APP的分離鑒定

1.3.1 分離純化 將樣品接種于腦心浸液瓊脂(含10%犢牛血清和100 μg/mL的NAD)置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取特征菌落進(jìn)行鑒定。

1.3.2 革蘭氏染色鏡檢 挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)。

1.3.3 細(xì)菌生化試驗(yàn)鑒定 取單菌落接種于含1%NAD的各種細(xì)菌生化培養(yǎng)管(購于北京路橋生物技術(shù)有限公司)中，置于10%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.3.4 細(xì)菌血清型鑒定 取純培養(yǎng)的細(xì)菌，制備適宜含量的細(xì)菌懸液，與不同血清型APP標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)反應(yīng)，進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，觀察凝集現(xiàn)象，確定分離菌的血清型。

1.4 藥敏試驗(yàn)

采用K-B法進(jìn)行磺胺類藥物藥敏試驗(yàn)，判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)抑菌圈大小(NCCLS2005)，抑菌圈≤10 mm為耐藥，11～15 mm為中等耐藥，≥16 mm為敏感。

1.5 細(xì)菌基因組提取及耐藥基因的檢測

1.5.1 細(xì)菌基因組DNA的提取 將每株細(xì)菌在腦心浸液瓊脂平板上培養(yǎng)，5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。然后用滅菌接種環(huán)收集細(xì)菌，轉(zhuǎn)入200 μL滅菌超純水中。4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集沉淀，按照基因組提取試劑盒進(jìn)行操作，提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 耐藥基因的PCR檢測 1.5.2.1 引物合成與設(shè)計 設(shè)計了3對特異性較高的引物，Sul1F：5′-GTGACGGTGTTCGGCATTCT-3′，Sul1R：5′-CTAACCTAGGGCTTTGGA-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段780 bp；Sul2F：5′-GAGCAAGATTTTTGGAATCG-3′，Sul2R：5′-TCCGAGAAGGTGATTGCGCT-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段720 bp；Sul3F：5′-TGTGCGGATGAAGTCAGCTC-3′，Sul3R：5′-CGGCATCGTCAACATAACCT-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段770 bp；上述引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.5.2.2 耐藥基因的檢測 PCR反應(yīng)條件如下：體系為50 μL，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，dNTPs濃度為0.15 mmol/L，TaqDNA聚合酶濃度為0.04 U/μL，引物濃度為0.3 μmol/L，DNA量為100 ng。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min。

1.5.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及測序 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行回收，然后送寶生物工程(大連)有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離細(xì)菌培養(yǎng)特性觀察

將分離的疑似APP菌株進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢可見細(xì)菌兩極染色，菌體呈球狀、桿狀或球桿狀等多形性(圖1),與APP菌株形態(tài)一致。

圖1 分離細(xì)菌形態(tài)特征

2.2 分離細(xì)菌生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

由表1可以看出，分離菌株均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露糖，不發(fā)酵乳糖、甘露醇、阿拉伯糖和七葉苷，不產(chǎn)生硫化氫和靛基質(zhì)，尿素酶試驗(yàn)和過氧化氫酶試驗(yàn)呈陽性,與APP菌株的生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果一致。

表1 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

注：“+”表示陽性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)。

2.3 分離細(xì)菌血清型鑒定結(jié)果

細(xì)菌的純培養(yǎng)物分別與1型—12型APP標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離到的部分菌株能與標(biāo)準(zhǔn)型陽性血清呈現(xiàn)明顯的凝集現(xiàn)象，與其他標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和生理鹽水對照均不發(fā)生凝集反應(yīng)。血清型鑒定結(jié)果表明，分離到的菌株為APP血清1型、2型、3型、5型、7型、8型、9型和10型。

2.4 分離細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，分離細(xì)菌對磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶(SMZ-TMP)的耐藥率均為100%。

表2 分離細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

2.5 分離細(xì)菌耐藥基因檢測結(jié)果

對分離細(xì)菌耐藥基因檢測結(jié)果顯示，分離的79株菌株均檢測出了磺胺類藥物耐藥基因，其中，Sul2基因檢出率為100%(79/79)，Sul1基因的檢出率為79.75%(63/79)，Sul3基因的檢出率為89.87%(71/79)，Sul1和Sul2基因同時檢測出率為70.89%(56/79)，Sul1和Sul3同時檢出率為62.03%(49/79)，Sul2和Sul3基因同時檢出率為77.22%(61/79)。部分檢測結(jié)果的電泳圖譜見圖2—圖4。

可見，79株分離細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果和耐藥基因PCR檢測結(jié)果一致，均為100%。

圖2 Sul1基因檢測結(jié)果

圖3 Sul2基因檢測結(jié)果

圖4 Sul3基因檢測結(jié)果

3 討論

細(xì)菌耐藥性已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)，大多數(shù)臨床分離細(xì)菌呈現(xiàn)多重耐藥，甚至出現(xiàn)超級耐藥菌株。這與臨床不合理用藥有關(guān)[19-21]?；前奉愃幬锸桥R床常用的一類藥物，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用，有的超量添加使用，造成細(xì)菌對這類藥物的抗藥性增加，甚至出現(xiàn)普遍耐藥。其原因可能是通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移或酶突變產(chǎn)生，包括二氫葉酸合成酶與磺胺的親和力降低，細(xì)菌對磺胺的通透性降低，以及細(xì)菌改變了代謝途徑，如產(chǎn)生了較多的對氨基苯甲酸或二氫葉酸合成酶[22-25]。

APP有2個生物類型，生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型的生長需要NAD，生物Ⅱ的生長不需要NAD。APP共有15個血清型，我國流行的主要是血清1型、2型、3型、5型、7型、9型和10型。APP抗原主要是莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、溶血素、黏附素等抗原。不同血清型之間抗原差異比較大，血清1型、5型、9型、10型和11型毒力較強(qiáng)，常見于嚴(yán)重暴發(fā)、高死亡率和嚴(yán)重的肺纖維素化病變的病料中。由于抗原差異較大及各血清型之間交叉保護(hù)低，導(dǎo)致臨床用疫苗不能提供完全保護(hù)，因此要有針對性地選用疫苗。當(dāng)豬場感染發(fā)病時，應(yīng)先分離細(xì)菌確定血清型及藥物敏感性才能產(chǎn)生較好療效。

本研究分離的79株APP對磺胺類藥物普遍產(chǎn)生了耐藥性，耐藥率高達(dá)100%。其中，Sul2基因的檢出率最高，為100%(79/79)，Sul1基因的檢出率為79.75%(63/79)，Sul3基因的檢出率為89.87%(71/79)。Sul1和Sul2基因同時檢測出率為70.89%(56/79)，Sul1和Sul3同時檢出率為62.03%(49/79)，Sul2和Sul3基因同時檢出率為77.22%(61/79)。Sul1基因的檢出率低于Sul2和Sul3。

對APP防治的重點(diǎn)在于血清學(xué)監(jiān)測、細(xì)菌分離及血清學(xué)鑒定和藥敏試驗(yàn)，豬場一旦發(fā)病，應(yīng)采取嚴(yán)格的凈化措施。建立無APP的凈化豬群，采用多種監(jiān)測手段進(jìn)行檢測。臨床上要合理用藥，避免耐藥菌株的產(chǎn)生，并且按療程用藥，長期給藥會造成病原菌的抗藥性及肉制品的藥物殘留。此外，采用相應(yīng)血清型的疫苗免疫接種仍然是預(yù)防和控制APP流行的有效措施。

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Detection of Sulfonamides Resistant Genes in Porcine ContagiousActinobacilluspleuropneumoniaeIsolated from Pigs

LI Haili1,DENGZU Liying2,XU Yindi1,LANG Limin1,ZHANG Qingxian1,YOU Yi1,WANG Keling1,FENG Yajie1,HOU Zihua1,BAI Xianxiao1*

(1.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 2.Zhengzhou Infant Normal School,Zhengzhou 450000,China)

In order to understand the scale of swine infectiousActinobacilluspleuropneumoniae(APP) resistant to sulfonamides in Henan province and neighboring regions.A drug sensitivity test was carried out in 79Actinobacilluspleuropneumoniaestrains isolated from lung and trachea pigs from 49 large scale pig farms in Henan province and neighboring regions.Serotype identification results showed that isolates were 1,2,3,5,7,8,9,10.Antimicrobial susceptibility disk method of isolates were used in resistant phenotype identification.At the same time,the PCR method was used for detection of sulfonamides resistance genes.Drug sensitivity test results showed that the sulfonamides resistance rates of the isolates from pigs were 100%(79/79).Sulfonamides resistant genesSul1,Sul2 andSul3 were detected by PCR with three pairs of specific primers designed according to the sequence available in GenBank.Among the 79 strains,the detection rate ofSul2 was the highest,which was 100%(79/79),the detection rate ofSul1 gene was 79.75%(63/79),and the detection rate ofSul3 gene was 89.87%(71/79).TheSul1 andSul2 genes were detected at the same time of 70.89%(56/79),Sul1 andSul3 were 62.03%(49/79),Sul2 andSul3 were 77.22%(61/79).

Actinobacilluspleuropneumoniae; sulfonamides; resistant genes

2015-12-10

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金(20151126)

李海利(1982-)，男，河南開封人，助理研究員，博士，主要從事動物傳染病臨床診斷及防控研究。 E-mail:haili8693@sina.com

*通訊作者：白獻(xiàn)曉(1963-)，男，河南南陽人，研究員，主要從事畜牧技術(shù)經(jīng)濟(jì)、食品安全研究以及畜牧技術(shù)示范推廣工作。E-mail:bxx388@sina.com

S855.1

A

1004-3268(2016)05-0135-05