邵鐵梅++安勝軍+仵陶+焦展++李雪++劉培++柴錫慶+高維娟

摘要：利用PCR技術(shù)，從油菜（Brassica campestris）基因組DNA中克隆20 ku油體蛋白基因上游903 bp 的調(diào)控序列NOP，將其與GUS基因融合構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用花粉管通道法轉(zhuǎn)化油葵并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，組織化學(xué)染色檢測啟動子和GUS基因在油葵基因組中的整合和表達(dá)情況。結(jié)果表明，NOP序列1～903 bp與報道序列同源性為95%，包含驅(qū)動基因表達(dá)的重要元件及驅(qū)動基因在種子中特異表達(dá)所必需的核苷酸序列；目的片段已整合到油葵基因組中，NOP具有種子特異性啟動子的功能，能夠驅(qū)動GUS基因在油葵種子中特異性表達(dá)，而在油葵根、莖、葉中均不表達(dá)。

關(guān)鍵詞：油葵；煙草；種子特異性啟動子；GUS染色；油體蛋白基因

中圖分類號： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0071-02

收稿日期：2015-12-23

基金項(xiàng)目：河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)（編號：ZH2011208）；河北省人力資源和社會保障廳 2011年度河北省人才工程培養(yǎng)（編號：35）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)（編號：ZD2010216）。

作者簡介：邵鐵梅（1974—），女，河北徐水人，博士，副教授，主要從事植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)蛋白類藥物研究。 Tel：（0311）85110321；E-mail：836311038@qq.com。

通信作者：高維娟，博士，教授，主要從事植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)蛋白類藥物研究。Tel：（0311）83938058；E-mail：gwj6088@163.com。植物油體表達(dá)體系是以種子特異性基因?yàn)閱幼?，?qū)動目的蛋白基因與油體蛋白基因在植物油體中融合表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物種子，粉碎種子并離心，回收上層油，利用油體親脂疏水性去除種子中大部分非目標(biāo)成分，進(jìn)一步獲得純化的目的蛋白，使蛋白的分離純化成本得到顯著降低[1]。油用向日葵（Helianthus annuus L.）簡稱油葵，是世界第二大油料作物，也是我國四大油料作物之一[2]，因其產(chǎn)量和含油率高，被認(rèn)為是構(gòu)建植物油體表達(dá)體系較為理想的植物。另外，油葵是一種耐旱作物，可在鹽堿地、干旱地區(qū)甚至沙漠等惡劣環(huán)境下種植，不僅不會與糧食“爭地”，還有利于提高我國山嶺薄地、干旱貧瘠地塊的利用率，適于大面積推廣，有助于緩解我國耕地緊張的壓力。目前，成功用于構(gòu)建植物油體表達(dá)體系的種子特異性啟動子有油菜（Brassica campestris）油體蛋白基因啟動子、菜豆蛋白基因啟動子、擬南芥油體蛋白基因啟動子等。油菜油體蛋白基因啟動子驅(qū)動一種新型降鈣素基因，與芝麻油體蛋白基因在棉花種子和油菜種子中成功融合表達(dá)[3]；菜豆蛋白基因啟動子驅(qū)動擬南芥18 ku油體蛋白單鏈抗體和阿樸脂蛋白AI米蘭突變體，與融合基因在紅花種子中表達(dá)[4]；擬南芥油體蛋白基因啟動子驅(qū)動擬南芥油體蛋白基因和水蛭素基因在油菜種子中融合表達(dá)[5]。驅(qū)動外源基因在油葵種子中特異表達(dá)的研究比較少。

油菜是我國非常重要的油料作物，油菜籽含油量高達(dá)42%～45%，油菜20 ku油體蛋白是24 ku油體蛋白含量的10倍，賈世榮等成功利用20 ku油體蛋白基因在油菜和棉花種子中驅(qū)動外源基因的表達(dá)[3]。本試驗(yàn)從油菜基因組DNA中克隆油菜20 ku油體蛋白基因上游903 bp的調(diào)控序列NOP，構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化油葵，經(jīng)檢測，該啟動子能驅(qū)動GUS基因在油葵種子中的特異表達(dá)。這為油葵植物生物反應(yīng)器的構(gòu)建提供了優(yōu)良的備選啟動子資源，同時也為油葵的油脂基因工程改良提供了候選啟動子。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料、菌株與質(zhì)粒

植物材料為“精選”油葵品種的恢復(fù)系，由河北華豐種業(yè)開發(fā)有限公司惠贈。雙元表達(dá)載體pBI121：GUS，由pCAMBIA1301中的GUS基因替換pBI121中的GUS基因，河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自博邁德生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、連接酶，購自寶生物工程（大連）有限公司；KOD-plus，購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶，購自鼎國生物技術(shù)公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，購自天根生物科技（北京）有限公司；卡那霉素 （kanamycin），購自Roche公司。

1.2油菜基因組的提取

采用SDS法[6]提取油菜基因組。

1.3PCR擴(kuò)增和植物表達(dá)載體pNOP：GUS的構(gòu)建

依據(jù)GenBank發(fā)表的油菜20 ku油體蛋白基因啟動子（序列號：AF134411）設(shè)計上下游引物，引物為：NOP F：5′-CCCAAGCTTTTCAACGTGGTCGGATCATGACG-3′；NOP R：5′-CGC-GGATCCGAATTGAGAGAGATCGAAGAG-3′（下劃線為酶切位點(diǎn)）；在上下游引物上分別引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，以油菜品種青油14的基因組DNA為模板，擴(kuò)增油菜油體蛋白基因啟動子；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ酶處理，插入pBI121：GUS的HindⅢ位點(diǎn)和BamHⅠ位點(diǎn)之間，獲得植物表達(dá)載體pNOP：GUS；對2個陽性克隆由上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.4油葵的轉(zhuǎn)化

參照劉芳等的方法[7]，采用花粉管通道法轉(zhuǎn)化精選油葵恢復(fù)系。

1.5轉(zhuǎn)基因油葵的PCR檢測與組織化學(xué)分析

以SDS 法小量提取轉(zhuǎn)基因油葵T1代幼苗基因組DNA為模板，NOP F、NOP R為引物進(jìn)行PCR 檢測，鑒定獲得轉(zhuǎn)化植株；依據(jù)Rueb等的方法[8]，對轉(zhuǎn)化植株的根、莖、葉、種子進(jìn)行GUS檢測，以驗(yàn)證NOP啟動子的功能。

2結(jié)果與分析

2.1啟動子片段的克隆、植物表達(dá)載體pNOP：GUS的構(gòu)建及啟動子序列分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，以油菜青油14品種基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)展產(chǎn)物有1條約0.9 kb的擴(kuò)增條帶，將該片段插入pBI121：GUS的HindⅢ和BamHⅠ位點(diǎn)之間，可獲得植物表達(dá)載體pNOP：GUS，經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切鑒定，獲得預(yù)期大小0.9 kb的目的片段（圖1），這說明該植物表達(dá)載體構(gòu)建正確。將NOP 核苷酸序列在NCBI中運(yùn)用Blast進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，NOP與油菜油體蛋白基因的啟動子序列同源性為95%，這說明NOP是油菜20 ku油體蛋白基因的啟動子。NOP 核苷酸序列經(jīng)Place數(shù)據(jù)庫查詢分析，結(jié)果表明，此序列包含TATA-box，可能序列為ATATAT，位于817～822位，主要功能是保證轉(zhuǎn)錄得以精確起始；包含ABRES元件，可能序列為ACACGTGGC，位于758～766位，在生長組織中介導(dǎo)脫落酸（ABA） 應(yīng)答，是種子成熟階段不可缺少的順式調(diào)控元件之一；含有1個G-box，可能序列為TGACGTGG，位于536～543位，這在種子特異性啟動子中普遍存在，高度保守，是光調(diào)控的應(yīng)答元件，對種子特異基因的表達(dá)在時間和空間上起到重要的順式調(diào)節(jié)作用，發(fā)生突變的種子特異性啟動子將喪失大部分活性[9]；包含2個CAAT-box，可能序列為CAAAT，位于669～673、359～363 位，存在比較廣泛，與基因表達(dá)的種子特異性和活性相關(guān)，主要起數(shù)量調(diào)節(jié)作用[10-11]；包含1個I-box，序列為TTTCAAA，位于666～672位。

2.2轉(zhuǎn)基因油葵的獲得

經(jīng)花粉管通道法轉(zhuǎn)化精選油葵恢復(fù)系，將收獲的種子進(jìn)行種植，每株取幼嫩真葉提取基因組，PCR檢測，結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物得到約0.9 kb的特異條帶，與以pNOP：GUS為模板的陽性對照擴(kuò)增結(jié)果一致，這初步說明目的片段已整合到油葵基因組DNA中。

2.3轉(zhuǎn)基因油葵的GUS檢測

為驗(yàn)證所克隆啟動子的功能，取轉(zhuǎn)基因油葵植株不同部位的組織進(jìn)行GUS檢測，結(jié)果表明，啟動子驅(qū)動下的基因不能在油葵根、莖和葉中表達(dá)，只能在油葵種子中表達(dá)（圖2）。這說明油菜油體蛋白基因啟動子可以驅(qū)動外源基因在油葵種子中特異表達(dá)。

3結(jié)論與討論

油菜籽粒含油量高，20 ku油體蛋白是24 ku油體蛋白含量的10倍，因此，20 ku油體蛋白基因的啟動子被推測是一個較強(qiáng)的種子特異性啟動子，朱亞蘭等克隆了該基因并構(gòu)建了植物表達(dá)載體[12]。本試驗(yàn)從青油14中克隆了油菜油體蛋白啟動子，包含基因表達(dá)的重要特征元件及TATA-box、ABRES、G-box、I-box、CAAT-box等種子特異表達(dá)所必需的核苷酸序列，與GenBank中序列號為AF134411的油菜 20 ku 油體蛋白基因啟動子同源性為95%，與劉昱輝等克隆到的油菜油體蛋白基因啟動子[13]同源性為100%。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建油菜油體蛋白啟動子與GUS基因融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化油葵，經(jīng)組織化學(xué)染色，結(jié)果表明，該啟動子可以驅(qū)動GUS基因在油葵種子中的特異表達(dá)，這為油葵利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建生物反應(yīng)器和油脂基因工程改良奠定了基礎(chǔ)。

本研究選用花粉管通道法轉(zhuǎn)化油葵，該方法有效地利用了自然生殖過程，可直接得到轉(zhuǎn)化種子，無需進(jìn)行繁瑣的組織培養(yǎng)。但是，花粉管通道法也有缺點(diǎn)，由于將基因?qū)胧荏w基因組會引起性狀的大量分離，需要經(jīng)過多代的自交純化，才能得到目標(biāo)性狀穩(wěn)定的純合后代[14]。本試驗(yàn)主要目的是為研究油菜油體蛋白基因啟動子能否驅(qū)動外源基因在油葵種子中的特異性表達(dá)，采用花粉管通道轉(zhuǎn)化是一種較快較好的選擇，且也獲得了比較理想的試驗(yàn)結(jié)果。

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