王草莖點霉葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性

張馳成++吳偉懷++粱艷瓊++鄭金龍++習(xí)金根++鄭肖蘭++唐文++許沛冬++李銳++賀春萍++易克賢

摘要：針對在廣西橫縣發(fā)生的一種王草葉斑病害，為明確其病原種類，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進行了鑒定，并研究其生物學(xué)特性。結(jié)合致病菌的形態(tài)特征以及ITS序列系統(tǒng)聚類分析結(jié)果，將其鑒定為草莖點霉（Phoma herbarum）。生物學(xué)特性研究表明：該菌菌絲體適宜生長的溫度為20～32 ℃，最適溫度為25～28 ℃；菌絲體生長的最適pH值為5～8；菌絲體生長的最佳碳源為葡萄糖、蔗糖和甘露醇；最佳氮源為蛋白胨，而尿素則不適合菌絲體生長；光/暗交替或暗/光交替均有利于菌絲體生長；菌絲體致死溫度為50 ℃，10 min。

關(guān)鍵詞：王草；莖點霉；病原鑒定；ITS；生物學(xué)特性

中圖分類號： S435.4文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0210-05

收稿日期：2015-02-06

資助項目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項 （編號：201303057）。

作者簡介：張馳成（1992—），男，安徽馬鞍山人，碩士研究生，主要從事熱帶牧草病害調(diào)查及病原鑒定等研究。E-mail：cczhang1992@126.com。

通信作者：賀春萍，碩士，副研究員，從事橡膠樹根病的拮抗菌篩選等研究，E-mail：hechunppp@163.com；易克賢，博士，研究員，從事熱帶牧草、劍麻和蘆筍真菌病害與抗性遺傳育種研究，E-mail：yikexian@126.com。王草（Pennisetum）別稱皇草、皇竹草，是以象草為母本、美洲狼尾草為父本雜交（Pennisetum purpureum×P.americanum）育種而成[1]。我國于1982年由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院從哥倫比亞引進，經(jīng)過多年試種選育而成，后定名為熱研4號王草（Pennisetum purpureum×P.americanum cv. Reyan No.4）[2]。王草為多年生牧草，具有產(chǎn)量高、生長快、抗倒伏、耐干旱、抗病力強等特點，而且莖葉柔軟口感好，營養(yǎng)豐富，以優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)而著稱，被譽為“草中之王”[3]，是各種草食性牲畜和魚類的優(yōu)質(zhì)飼料。適宜在我國熱帶及亞熱帶種植，目前已經(jīng)在海南、廣東、廣西、云南等地成功種植，是華南地區(qū)最適于集約化栽培的刈割型禾本科牧草[4]。然而，隨著種植面積的不斷擴大以及種植年限的延長，各種病害逐漸發(fā)生并逐年加重，很大程度上限制了包括王草在內(nèi)的牧草產(chǎn)量及質(zhì)量[5-6]。牧草病害可使牧草生長量減少，產(chǎn)草量降低，營養(yǎng)成分含量和可消化率下降，有害物質(zhì)含量增加，進而導(dǎo)致動物日增體質(zhì)量減少[7]。王草作為南方主要熱帶牧草之一，同樣面臨多種病害尤其是真菌病害的影響。

2015年5月，在廣西橫縣出現(xiàn)了成片王草大規(guī)模發(fā)生葉斑病的情況，且有迅速蔓延之勢。為明確其病原，本試驗通過病原菌形態(tài)學(xué)檢查，結(jié)合分子生物學(xué)手段對該致病菌進行了鑒定，進而對其進行了生物學(xué)特性研究，以期為當(dāng)?shù)赝醪萑~斑病害的發(fā)生及綜合防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 供試菌株從廣西橫縣熱研4號王草上采集病樣，經(jīng)室內(nèi)無菌條件下分離及單孢分離純化得到供試菌株。

1.1.2供試培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖15～20 g，瓊脂15～20 g，ddH2O定容至 1 000 mL，自然pH值；查氏瓊脂培養(yǎng)基（Czapek）：硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15～20 g，無菌水定容至1 000 mL。上述培養(yǎng)基均于121 ℃高壓滅菌20 min后備用。

1.1.3試劑及儀器真菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′）由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。Taq酶、PCR buffer、dNTPs、DNA片段回收試劑盒及T1載體等均購自北京全式金生物試劑公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1病樣采集及病原菌分離純化采用常規(guī)組織分離法進行病原菌的分離純化[8]。將田間采回的發(fā)病王草葉片沖洗干凈、晾干，在病健交界處剪取（2～3） mm×（2～3） mm的組織塊。于超凈工作臺中，首先用0.1% Hgcl2溶液消毒約 1 min，然后用75%乙醇漂洗30 s，經(jīng)無菌水漂洗2～3次后用滅菌濾紙吸干，置于PDA培養(yǎng)基中，在25 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d。待菌落長出后，從其邊緣挑取菌絲塊，置于平板PDA培養(yǎng)基上進行純化，獲得分離菌株。

1.2.2病原菌形態(tài)學(xué)鑒定將分離純化得到的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)6～7 d，期間觀察并記錄菌落在培養(yǎng)基上的生長狀況；在顯微鏡下觀察菌絲體與分生孢子的形態(tài)，測量分生孢子的大小，并拍照保存。

1.2.3病原菌致病性測定取健康王草嫩葉，先用無菌水洗干凈，再經(jīng)75%乙醇消毒，并再次用無菌水沖洗后晾干。將直徑5 mm的菌餅接種于經(jīng)消毒針頭刺傷的葉片（菌絲面緊貼在葉片傷口處），每葉接種2塊菌餅，重復(fù)處理3個葉片，接種無菌培養(yǎng)基塊作為對照。于托盤內(nèi)保濕。接種2 d后開始觀察發(fā)病癥狀，3 d后除去菌絲塊，記錄病斑大小和顏色。待接種葉片發(fā)病后，按照柯赫氏法則，從病部再分離病原菌，觀察所得分離物與原接種病原菌的形態(tài)特征是否一致。

1.2.4病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.2.4.1病原菌基因組DNA的提取和 PCR 擴增用真菌DNA提取試劑盒（Biomiga Fungal gDNA Kit）提取供試菌株DNA，于超微量紫外分光光度計測定DNA濃度及純度，其余的DNA溶液置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ靡颕TS1/ITS4對其rDNA的2個內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)和5.8S區(qū)段進行PCR擴增。每個反應(yīng)體系體積為20 μL：10×PCR反應(yīng)緩沖液2 μL，dNTPs （10 mmol/L） 1.6 μL，引物ITS1和ITS4 （10 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.2 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O補足20 μL。用雙蒸滅菌水代替模板DNA作陰性對照。PCR擴增反應(yīng)在PCR擴增儀（Eppendorf Mastercyler gradient）上進行。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取 5 μL PCR產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析PCR產(chǎn)物片段大小，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.4.2PCR產(chǎn)物的回收、克隆及測序PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，在紫外燈下切下含目的片段的瓊脂糖凝膠，轉(zhuǎn)入無菌的微量離心管，用膠回收試劑盒（OMEGA Gel Extraction Kit）回收純化，具體操作步驟參見說明書；與T1載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α。經(jīng)藍白斑篩選后，隨機挑取5個白斑，利用通用引物M13F/R對待鑒定的菌液進行PCR鑒定。反應(yīng)體系以及PCR擴增反應(yīng)程序參照“1.2.4.1”節(jié)。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下檢查擴增結(jié)果。選取陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA，送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

1.2.4.3病原菌rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建獲得的序列在DNAStar中，利用ITS1、ITS4引物序列去除多余的載體序列。將所得序列在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行Blast比對及同源序列分析，并下載Phoma屬的P. herbarum、P.omnivirens、P. eupyrena、P. schachtii、P. muscivora、P. haematocycla、P. polemonii、P. dutchum、P. multirostrata、P. aliena、P. costarricencis、P. sexea、P. destructiva、P. bulgarica、P. pereupyrena、P. matteuciicola、P. insulana、P. digitalis、P. crystallifera、P. acetosellae等20個種的37條rDNA-ITS序列。利用MEGA 4.0軟件中鄰接法 （neighbor-joining，NJ） 進行聚類分析，繪制出相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)次數(shù)為 1 000 次。

1.2.5病原菌生物學(xué)特性研究

1.2.5.1病原菌菌絲體生長特性測定將供試病原菌在PDA培養(yǎng)基平板上于28 ℃培養(yǎng)5 d，用無菌的打孔器在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅備用。將菌餅接種于PDA平板中央，分別置于5、10、15、20、25、28、32、37 ℃以及40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；另將接種供試菌株的PDA平板分別置于完全光照、完全黑暗、光/暗交替（18 W，1根燈管；光照和黑暗各 12 h）、暗/光交替（黑暗和光照各12 h）的28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)；用稀鹽酸和氫氧化鈉溶液將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)為4、5、6、7、8、9、10、11后制成PDA平板，將菌餅接種于不同pH值的平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)；用等量的碳源（麥芽糖、D-果糖、葡萄糖、乳糖和甘露醇）及氮源（蛋白胨、甘氨酸、牛肉浸膏、尿素和L-天冬酰胺）分別替換Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖和硝酸鈉，制成含不同碳氮源的Czapek培養(yǎng)基平板，分別以不含碳源（蔗糖）及氮源（硝酸鈉）的培養(yǎng)基為對照，將供試菌株菌餅接種于平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)；所有處理均重復(fù)5次，培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測量菌落直徑并計算菌絲體生長速率，用SAS軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.2.5.2病原菌致死溫度和時間測定在含有2 mL無菌水的試管中加入供試菌株菌餅，分別在45、50、55、60、65 ℃的恒溫水浴鍋中加熱10 min，20 min后迅速冷卻，取菌餅接種在PDA培養(yǎng)基平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)，逐日觀察菌絲體生長情況。

2結(jié)果與分析

2.1王草葉斑病田間發(fā)病癥狀

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病主要危害王草葉片，在葉片邊緣或尖端形成枯黃色條狀斑點（圖1-a，后期整個葉片黃化枯死并且變脆，有黑色小霉點形成（圖1-b）。經(jīng)室內(nèi)分離后及單孢純化得到3個菌株，編號分別為GX8-2、GX12、GX葉斑-2。經(jīng)鏡檢表明，這3個菌株的培養(yǎng)性狀、菌絲體及分生孢子形態(tài)等均相同，因此認(rèn)為屬于同一種真菌，故后續(xù)研究只對 GX8-2進行研究。

2.2病原菌的培養(yǎng)形狀和形態(tài)學(xué)觀察

菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈近圓形，有輪紋，邊緣不均勻，菌落中央稍隆起，菌絲灰白色，生長旺盛，棉絮狀（圖2-a、圖2-b）。經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲表面粗糙、不平滑（圖2-c），分生孢子器呈橢圓形，黑褐色，具孔口，表面不光滑，大小約為124.78 μm×92.99 μm（圖2-d）；分生孢子呈卵圓形或橢圓形，無色單胞，大小為（5.16～6.92） μm×（2.56～3.54） μm （圖2-e）。其型態(tài)特征與莖點霉（Phoma sp.）描述高度相符。

2.3致病性測定

將純化后的單孢菌株GX8-2菌塊接種至王草葉片上，2～3 d后，接種葉片均表現(xiàn)病癥，接種發(fā)病癥狀與大田發(fā)病初期癥狀一致，但比大田自然發(fā)病初期癥狀嚴(yán)重（圖3）。根據(jù)柯赫氏法則將發(fā)病組織進行再分離， 獲得的分離物形態(tài)特征與原接種菌株一致，表明所獲得的分離物為王草葉斑病的致病菌。

2.4病原菌ITS序列分析

利用引物ITS1/ITS4對菌株GX8-2的DNA模板進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，該引物從基因組中擴增出1條特異性條帶，其大小介于500～750 bp之間（圖4）。經(jīng)克隆測序最終獲得534 bp rDNA-ITS序列，將該序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列登錄號為KU324835。經(jīng)Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，該序列與數(shù)據(jù)庫中已登錄的Phoma herbarum（KJ767078.1，AB369456.1，KJ767079.1） 草莖點霉ITS

序列同源性達99%。通過與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的20個Phoma屬序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹揭示，GX8-2與Phoma herbarum的同源性最高，聚為一個分枝（圖5）。最終結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，將GX8-2鑒定為草莖點霉（Phoma herbarum）。

2.5病原菌生物學(xué)特性

2.5.1病原菌菌絲體生長特性病原菌菌絲體生長特性測定結(jié)果表明，適宜草莖點霉菌菌株GX8-2生長的溫度范圍為25～32 ℃，最適生長溫度為25 ℃，當(dāng)溫度低于10 ℃或高于37 ℃時，菌絲體生長受到抑制或無法正常生長（圖6）；光/暗交替或暗/光交替條件最適宜菌絲體生長，完全黑暗或完全光照條件下菌絲體生長速率相對較慢（圖7）；在供試的所有pH值下GX8-2菌絲體均能生長，最適宜菌絲體生長的pH值范圍為5～8（圖8）；該菌在含有葡萄糖、蔗糖和甘露醇的查氏培養(yǎng)基上生長狀況良好且生長狀況較一致，在含有乳糖的查氏培養(yǎng)基上生長受到一定的影響，菌絲體稀薄，在不含任何碳源的查氏培養(yǎng)基上生長時，菌絲體極其稀薄，肉眼幾乎很難看到（圖9）；該菌在含有不同氮源的查氏培養(yǎng)基上生長狀況存在較大差異，在含有蛋白胨的培養(yǎng)基上生長最快，且菌絲密實，在含有尿素的培養(yǎng)基上生長最慢，在不含任何氮源的培養(yǎng)基上生長時菌絲稀薄，生長不旺盛（圖10）。

2.5.2病原菌致死溫度和時間菌株GX8-2經(jīng)45 ℃處理10～30 min后仍然能在PDA平板上正常生長，但是在50 ℃及以上溫度處理10 min后不能生長。由此表明，菌株 GX8-2 菌絲體的致死溫度為50 ℃ 10 min。

3討論

熱帶、亞熱帶地區(qū)多年生牧草資源十分豐富，而高溫高濕的氣候也非常適宜病原微生物的生長和繁殖，導(dǎo)致熱帶牧草病害普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響牧草產(chǎn)量及干草質(zhì)量。練啟仙等2004—2005年對貴州花江地區(qū)王草病害調(diào)查結(jié)果表明，該地區(qū)有莖腐病（病原為Gibberella sp.）、褐斑?。ú≡瓰锳lternaria sp.）、葉斑?。ú≡瓰镻homa sp.）、斑點?。ú≡瓰镋picoccum sp.）和紋枯?。ú≡瓰镽hizoctonia sp.）等典型病害[9-10]。鄭麗等對海南省牧草病害調(diào)查結(jié)果表明，造成海南王草葉斑病病害的病原菌主要有Phoma sp.、Rhizoctonia oryzae、Curvular sp.、Drechslera sacchari和 Alternaria sp. 5種[11]。雖然國內(nèi)對由Phoma sp.侵染王草引起的葉斑病早有記錄，但未見對該病病原進行系統(tǒng)生物學(xué)研究的報道。

筆者從發(fā)生在廣西橫縣地區(qū)王草葉斑病病葉上，分離得到1株致病菌GX8-2。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定將其鑒定為草莖點霉（Phoma herbarum），并對其生物學(xué)特性進行了初步研究。研究表明，適宜GX8-2菌株生長的溫度范圍為25～32 ℃，這與張翠英的研究結(jié)果[12]相符合，只有溫度低于10 ℃或高于37 ℃時，菌絲體的生長才會受到抑制或無法正常生長；該病菌的適宜pH 值范圍很廣，酸或堿的條件對其菌絲生長影響不大；GX8-2菌株在含有葡萄糖、蔗糖和甘露醇的查氏培養(yǎng)基上生長狀況良好且生長狀況較一致，會產(chǎn)生紅色素，與許愛清等報道的由鎘誘導(dǎo)草莖點霉產(chǎn)生紅色素的描述[13]類似；該病菌對碳氮源的要求不嚴(yán)格，僅是以尿素為氮源時病原菌的生長狀況不太理想，說明該菌有很強的環(huán)境適應(yīng)性。本次在廣西橫縣暴發(fā)的王草莖點霉葉斑病發(fā)生情況十分嚴(yán)重，這可能與該病原菌對環(huán)境的適應(yīng)性較強有一定的關(guān)系。

莖點霉屬真菌種類繁多，且大部分是重要的植物致病菌，能侵染植物并引起葉斑、莖枯、根腐和果腐等癥狀[14-17]。在牧草上，多喙莖點霉（Phoma multirostrata）侵染多花筋骨草引起黑脛病，導(dǎo)致植株整株枯萎死亡[18]。苜蓿莖點霉（Phoma medicaginis）引起苜蓿黑脛病和葉斑病[19-21]，以及莖點霉（Phoma sp.）引起紅豆草葉斑病[6]均有報道。不同病原菌侵染植物發(fā)生葉斑病的危害癥狀較為相似[22-24]，給病害診斷及病原鑒定帶來了較大困難。是否可以根據(jù)不同的牧草葉斑病害開發(fā)出田間快速檢測及診斷的方法，值得進一步研究。

參考文獻：

[1]劉國道. 熱帶牧草栽培學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：82-87.

[2]劉國道，白昌軍，王東勁，等. 熱研4號王草選育[J]. 草地學(xué)報，2002，10（2）：92-96.

[3]孫凡. 草中之王——皇竹草[J]. 山區(qū)開發(fā)，2003（8）：12-13.

[4]涂旭川，劉國道，白昌軍，等. 熱研4號王草栽培技術(shù)初探[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（10）：533-535.

[5]南志標(biāo). 銹病對豆科牧草生長和營養(yǎng)成分的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報，1990，1（1）：83-87.

[6]聶紅霞，李彥忠. 莖點霉葉斑病對紅豆草產(chǎn)量和養(yǎng)分的影響[J]. 草業(yè)科學(xué)，2014，31（4）：689-696.

[7]Leath K T，Shenk J S，Barner R F. Relation of foilar disease to quality of alfalfa forage[J]. Agronomy，1974，66：675-677.

[8]方中達. 植病研究方法[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：142-145.

[9]練啟仙，桑維鈞，李小霞，等. 貴州花江地區(qū)皇竹草真菌病害種類調(diào)查及防治[C]//2007年中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會年會論文集，武漢，2007：225-227.

[10]練啟仙，桑維鈞，楊茂發(fā)，等. 貴州皇竹草紋枯病的發(fā)生特點與防治建議[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2006，25（2）：177-178.

[11]鄭麗，易小平，文衍堂，等. 海南省熱帶牧草病害調(diào)查及病原菌初步鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報，2014，35（5）：967-973.

[12]張翠英. 云南玄參主要真菌病害病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究[D]. 昆明：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009：53.

[13]許愛清，宋早文，藍淑莉，等. 鎘誘導(dǎo)抗鎘莖點霉產(chǎn)生水溶性紅色素[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2014，37（7）：61-65.

[14]謝昌平，張 能，紀(jì)燁斌，等. 香蕉莖點霉鞘腐病的病原鑒定與藥劑毒力測定[J]. 熱帶作物學(xué)報，2007，28（3）：88-92.

[15]Ni M，Liu T，Ding Y，et al. A leaf spot of figwort （Scrophularia ningpoensis） caused by Phoma sp.[J]. Canadian Journal of Plant Pathology，2010，32（4）：493-495.

[16]常瑾，井金學(xué)，張海寬，等. 陜西黃答莖枯病病原菌的鑒定[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報，2006，21（3）：81-82.

[17]陳衛(wèi)民，郭慶元，宋紅梅，等. 國內(nèi)新病害——向日葵莖點霉黑莖病在新疆伊犁河谷的發(fā)生初報[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，23（5）：609-612.

[18]吳玲，胡小倩，樓兵干，等. 多花筋骨草黑脛病及其病原菌鑒定[J]. 菌物學(xué)報，2009，28（6）：765-768.

[19]Akamatsu H O，Chilvers M I，Peever T L. First report of spring black stem and leaf spot of alfalfa in Washington State caused by Phoma medicaginis[J]. Plant Disease，2008，92（5）：833.

[20]張麗，潘龍其，王生榮，等. 苜蓿莖點霉葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，20（4）：158-166.

[21]王瑜，劉怡，周彬彬，等. 苜蓿對匍柄霉葉斑病與莖點霉葉斑病的抗性評價研究[J]. 草業(yè)學(xué)報，2015，24（7）：155-162.

[22]謝美華，李霖，李雪玲，等. 芒萁葉斑病病原菌分離鑒定和生物學(xué)特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：130-133.

[23]謝美華，李霖，李雪玲，等. 云南紅豆杉葉斑病病原菌的分離鑒定和生物學(xué)特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（11）：146-149.

[24]趙麗萍，趙統(tǒng)敏，余文貴，等. 番茄灰葉斑病研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，30（6）：1524-1530.