摘要：二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）對緩解心律不齊、高血壓等疾病具有重要作用，對調(diào)節(jié)情緒、治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及哮喘也具有積極意義。通過優(yōu)化氮源和碳源、添加生長因子等途徑提高菱形藻HE06的EPA產(chǎn)率。經(jīng)優(yōu)化得到硝酸鈉、氯化銨、尿素、維生素B1、維生素B12、生物素、葡萄糖、甘油、碳酸氫鈉的最佳質(zhì)量濃度分別為 75 mg/L、5 mg/L、30 mg/L、1.5 mg/L、6 μg/L、10 μg/L、1.2 g/L、2.4 g/L、1.2 g/L。在最佳優(yōu)化條件下，EPA產(chǎn)率由最初的31.2 μg/L提升至504.8 μg/L，提高了15倍；生物量產(chǎn)率由19.5 mg/L提高至32.4 mg/L，提高了66.2%。

關(guān)鍵詞：菱形藻；培養(yǎng)條件；二十碳五烯酸（EPA）

中圖分類號： S917文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0317-04

收稿日期：2015-05-05

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：30960215）；廣西自然科學(xué)基金（編號：桂科青0728019）。

作者簡介：劉紅全（1975—），男，黑龍江肇東人，博士，副教授，主要從事生物技術(shù)研究。E-mail：lhongquan@163.com。二十碳五烯酸（EPA）對高血壓、動脈粥樣硬化、血栓等心血管疾病的預(yù)防和治療具有重大意義。在20世紀(jì)80年代前，EPA主要從魚油中提取，由于其含量低、成分復(fù)雜等原因，致使EPA價格昂貴，難以滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求。隨著微藻產(chǎn)EPA研究的深入，EPA的價格越來越低。微藻EPA含量高、生產(chǎn)條件低、提取工藝簡單，已成為生產(chǎn)EPA極具潛力的原料來源。雖然野生型的微藻EPA含量高，但也不足以工業(yè)化生產(chǎn)，因此須對微藻進(jìn)行生產(chǎn)條件優(yōu)化。采用正交設(shè)計方法優(yōu)化氮源、維生素、植物激素、碳源用量，從培養(yǎng)基優(yōu)化方面提高菱形藻HE06的EPA產(chǎn)率。

1材料與方法

1.1儀器與藻種

LDZX-50 KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司），CFM-5002型熒光倒置顯微鏡（上海安捷倫公司），LRH-250-GSII型人工氣候箱（廣東省醫(yī)療器械廠），Scientz-10N型冷凍干燥機(jī)，GC20-14B型氣相色譜。

藻種HE06由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離自廣西壯族自治區(qū)欽州市茅尾海自治區(qū)級紅樹林保護(hù)區(qū)，經(jīng)鑒定為菱形藻屬。該藻培養(yǎng)于f/2培養(yǎng)基中，人工氣候箱的培養(yǎng)條件為光照度 4 000 lx、暗光比12 h/12 h、溫度（24±1）℃、濕度40%。

1.2生長條件優(yōu)化

于500 mL錐形瓶內(nèi)裝入180 mL液體培養(yǎng)基，按照10%的接種量在超凈臺中接種對數(shù)期藻種。

1.2.1氮源優(yōu)化分別以f/2原培養(yǎng)基中氮源物質(zhì)的量為中間點(diǎn)，向左右延伸2個質(zhì)量濃度，分別設(shè)置硝酸鈉單因素優(yōu)化質(zhì)量濃度。分別設(shè)置硝酸鈉的質(zhì)量濃度為55、65、75、85、95 mg/L；分別設(shè)置氯化銨的質(zhì)量濃度為35、41、47、53、60 mg/L；分別將尿素的質(zhì)量濃度調(diào)整為10、20、30、40、50 mg/L。氮源的正交試驗(yàn)選用最佳硝酸鈉、氯化銨、尿素單因素優(yōu)化值及其左右鄰值進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.2維生素優(yōu)化維生素的質(zhì)量濃度參照f/2培養(yǎng)基的質(zhì)量濃度進(jìn)行設(shè)置。生物素的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、20、4.0、8.0 μg/L；維生素B1的質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、020、0.40、0.80 mg/L；維生素B12的質(zhì)量濃度分別為025、050、1.00、2.00、4.00 μg/L。維生素的正交試驗(yàn)選用最佳生物素、維生素B1、維生素B12單因素優(yōu)化值及其左右鄰值進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.3植物激素優(yōu)化IAA的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、20、4.0、8.0 mg/L；6-BA、赤霉素的質(zhì)量濃度分別為0.2、04、0.6、0.8、1.0 mg/L。植物激素的正交試驗(yàn)選用最佳IAA、6-BA、赤霉素單因素優(yōu)化值及其左右鄰值進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.4碳源優(yōu)化葡萄糖的質(zhì)量濃度分別為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 g/L；甘油的質(zhì)量濃度分別為0.3、0.9、1.8、2.7、3.6 g/L；碳酸氫鈉的質(zhì)量濃度分別為0.3、0.9、1.8、2.7、3.6 g/L。碳源的正交試驗(yàn)選用最佳葡萄糖、甘油、碳酸氫鈉單因素優(yōu)化值及其左右鄰值進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化。

1.3生長速率的測定

將所有培養(yǎng)體系置于人工氣候箱中，于2 d時開始測定培養(yǎng)體系的D680 nm，此后每天在規(guī)定時間測定1次D680 nm。當(dāng)培養(yǎng)體系的D680 nm在3次測定內(nèi)無變化時，將 100 mL 藻液倒入250 mL離心瓶中，于6 000 r/min離心 10 min 收集藻液，將沉淀轉(zhuǎn)移至10 mL帶螺旋蓋的離心管中，用去離子水洗滌離心2次并冷凍干燥。干燥后的藻粉直接保存于-20 ℃冰箱中。微藻的比生長速率μ按照如下公式[1]進(jìn)行計算：

μ=ln（Nt/N0）/（Tt-T0）。

式中：Nt為穩(wěn)定期懸浮藻液在680 nm處的吸光度；N0為接種后2 d懸浮藻液的D680 nm；Tt為進(jìn)入穩(wěn)定期的時間（d）；T0為接種后2 d的時間（d）。

1.4不飽和脂肪酸的提取及測定

脂肪酸的提取及甲酯化方法參照文獻(xiàn)[2]。將50 mg干燥粉置于帶螺旋蓋的離心管中，加入混合溶液（三氯甲烷 ∶ 甲醇 ∶ 水=2 ∶ 1 ∶ 0.8）并充入N2 1 min，以80 W超聲20 min后于 75 ℃ 水浴15 min，冷卻后以4 000 r/min離心10 min，取三氯甲烷層；重復(fù)以上步驟2次，合并三氯甲烷層，加入等體積混合溶液（甲醇 ∶ 氫氧化鈉=2 ∶ 1）并充入N2 1 min，以 80 W 超聲 20 min 后于75 ℃水浴15 min，冷卻后以4 000 r/min離心 10 min，取上清并加入500 μL正己烷萃取30 min。

對Liang等的EPA氣相色譜測定升溫程序[3]稍作改進(jìn)，初溫72 ℃保持1 min，以30 ℃/min升溫至150 ℃并保持 1 min，再以5 ℃/min升溫至250 ℃并保持5 min。進(jìn)樣口、檢測器的溫度均為280 ℃。載氣為高純度氮?dú)?，流速?30 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL。

2結(jié)果與分析

2.1生長速率

由圖1、表1可知，在正交優(yōu)化的4組試驗(yàn)中，進(jìn)入穩(wěn)定期的時間均延后。其中，氮源、維生素、植物激素試驗(yàn)組進(jìn)入穩(wěn)定期的時間延后至10 d；而碳源試驗(yàn)組進(jìn)入穩(wěn)定期的時間延后最長，達(dá)到15 d。所有試驗(yàn)組的D680 nm均有所提高，激素正交優(yōu)化組的D680 nm與前一優(yōu)化組（維生素組）相比有所下降，表明植物激素正交試驗(yàn)對菱形藻HE06具有抑制作用，而氮源、維生素試驗(yàn)組基本無變化。維生素試驗(yàn)組進(jìn)入對數(shù)期較快，氮源試驗(yàn)組適應(yīng)期較長。比生長速率測定結(jié)果顯示，氮源與維生素培養(yǎng)優(yōu)化中的比生長速率最高，而碳源組與對照組相比基本無變化。

2.2優(yōu)化結(jié)果

單因素優(yōu)化結(jié)果（表2）顯示，單獨(dú)添加氯化銨、尿素均能提高菱形藻HE06的EPA含量，EPA含量分別達(dá)到0.234%、0.219%，與硝酸鈉作為氮源相比分別增加了45.3%、360%。但在單因素優(yōu)化中，其生物量產(chǎn)率均有所下降，而在隨后多種氮源正交優(yōu)化中，與未優(yōu)化對照組相比，生物量產(chǎn)率增加了19.0%，EPA產(chǎn)率增加了 161.5%（圖2-b）。可見，硝酸鈉、尿素、氯化銨的正交優(yōu)化更有利于菱形藻EPA的積累。在使用質(zhì)量濃度方面，三者在正交優(yōu)化的使用質(zhì)量濃度均有所回落，其中氯化銨的變動最大，變?yōu)? mg/L，尿素下降了 10 mg/L，硝酸鈉回到f/2的使用質(zhì)量濃度。

表2、圖2-e表明，菱形藻經(jīng)過維生素正交優(yōu)化后，生物量產(chǎn)率提升22.4%，EPA產(chǎn)率提升206.0%，與氮源正交優(yōu)化結(jié)果類似，均能有效提高EPA產(chǎn)率，且對生物量的影響不大。在使用質(zhì)量濃度方面，維生素B1、B12、生物素的使用質(zhì)量濃度分別上升了0.9、2.0、4.0倍，與氮源優(yōu)化結(jié)果相反。在僅有維生素B1、維生素B12、生物素的培養(yǎng)基中生物量產(chǎn)率低下，分別為6.5、8.9、15.9 mg/L。

在植物激素正交優(yōu)化中，不僅生物量產(chǎn)率沒有得到提升，EPA產(chǎn)率也有所下降（圖2-c），表明對菱形藻HE06而言，IAA、6-BA、赤霉素的正交并不適于其生物量、EPA產(chǎn)物的積累。在單因素優(yōu)化中，僅加入IAA對生物量產(chǎn)率具有促進(jìn)作用，而6-BA、赤霉素均表現(xiàn)出抑制作用。

碳源正交試驗(yàn)中，在使用質(zhì)量濃度方面，除碳酸氫鈉不變以外，葡萄糖、甘油的使用質(zhì)量濃度均有所上升。生物量產(chǎn)率由維生素試驗(yàn)組的28.4 mg/L上升至32.6 mg/L，僅提高了14.8%。氣相色譜測定結(jié)果（圖2）顯示，在21.9 min左右出現(xiàn)1個較大的峰值，表明EPA產(chǎn)率得到極大提高，達(dá)到 503.9 μg/L，與維生素試驗(yàn)組相比提高了101.8%。4個試驗(yàn)組中氮源、維生素、植物激素、碳源的添加對菱形藻HE06的總脂組分影響均不大，EPA含量主要隨總脂含量的升高而升高。

3結(jié)論與討論

經(jīng)優(yōu)化得到硝酸鈉、氯化銨、尿素、維生素B1、維生素B12、生物素、葡萄糖、甘油、碳酸氫鈉的最佳質(zhì)量濃度分別為75 mg/L、5 mg/L、30 mg/L、1.5 mg/L、6 μg/L、10 μg/L、1.2 g/L、2.4 g/L、1.2 g/L。在該條件下，EPA產(chǎn)率為 504.8 μg/L，提高了15倍；生物量產(chǎn)率為32.4 mg/L，提高了66.2%。本研究同時添加3種氮源，不僅促進(jìn)了菱形藻HE06生物量的增加，也促進(jìn)了微藻EPA產(chǎn)量的積累。氨存在于所有細(xì)胞器中，微藻對氨態(tài)氮的吸收不僅受到環(huán)境中氨濃度的影響，還受到環(huán)境pH值、光照條件、自身對氮源的需求、環(huán)境中硝酸鹽濃度的影響[4]。微藻對氨的持續(xù)吸收使環(huán)境中的pH值下降，pH值持續(xù)下降導(dǎo)致微藻更傾向于吸收硝酸鹽，從而使環(huán)境中的pH值上升。環(huán)境中質(zhì)子濃度的升高對藻細(xì)胞具有毒性作用，這種作用可在一定程度上促進(jìn)產(chǎn)物的積累，而高濃度的質(zhì)子能夠破壞膜系統(tǒng)從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]；因此，在單因素優(yōu)化中，最佳氨濃度下菱形藻HE06的生物量產(chǎn)率不高，而EPA含量卻有所增加。銨離子的存在還會抑制微藻對環(huán)境中硝酸鹽的吸收，因此氮源正交優(yōu)化中微藻對氮源的吸收下降[6]，使用氨態(tài)氮作為氮源時必須使培養(yǎng)基中的pH值條件保持穩(wěn)定[7-8]。本研究中菱形藻HE06氨的單因素優(yōu)化在三角錐形瓶中進(jìn)行，沒有持續(xù)控制培養(yǎng)基的pH值，因此生物量產(chǎn)率較低。微藻對硝酸鹽的同化吸收過程須消耗大量的能量和質(zhì)子，使pH值上升，與氨的同化作用相反[9]。微藻對尿素的同化作用主要依靠脲酶或尿素氨基水解酶催化完成，這2種酶在微藻細(xì)胞內(nèi)的活性均不高；因此，在尿素單因素培養(yǎng)中，菱形藻HE06的生物量產(chǎn)率也較低[10]。在三者的正交試驗(yàn)中，微藻先后對氨、氮的吸收維持了培養(yǎng)基的pH值平衡，而培養(yǎng)基中不斷變化的pH值刺激了微藻總脂的積累，從而促進(jìn)EPA的積累。

目前，維生素在微藻內(nèi)的合成代謝過程尚不明確，研究表明，其更多作為乙酰輔酶A羧化酶、丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶等酶的輔因子參與微藻的新陳代謝。單因素及正交結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中缺乏某種維生素時，會對微藻的生物量產(chǎn)率產(chǎn)生較大影響；當(dāng)培養(yǎng)基中存在維生素時，其濃度對生物量的影響并不顯著。維生素正交對菱形藻HE06的EPA產(chǎn)率影響較顯著，表明向培養(yǎng)基中加入多種維生素能夠促進(jìn)某些微藻生物量及產(chǎn)物的積累[11]。

植物激素主要作為促生長因子促進(jìn)微藻生長或產(chǎn)物的積累，而維生素作為生長因子維持微藻的基本生長需求。在菱形藻HE06的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中缺乏維生素時表現(xiàn)為微藻生長緩慢、生物量產(chǎn)率低下；而缺乏植物激素并不影響微藻的基本生長需求，反而當(dāng)加入植物激素時影響微藻的生長，具有促進(jìn)或抑制作用。

在亞心形扁藻（P. Subcordiformis）細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)使用葡萄糖進(jìn)行兼養(yǎng)時，細(xì)胞能夠通過糖酵解同化葡萄糖，光合作用也在同步進(jìn)行，只是光合作用的強(qiáng)度明顯變?nèi)鮗12]。對菱形藻HE06的單因素優(yōu)化和正交試驗(yàn)均表明，這2種藻能夠在有機(jī)碳源下兼養(yǎng)。在菱形藻HE06優(yōu)化試驗(yàn)中，生物量產(chǎn)率過低歸根于葡萄糖轉(zhuǎn)化效率過低，這與藻種本身的特性[13]及光照度有關(guān)，過低的光照度[輻射強(qiáng)度低于22 μmol/（m2·s）]導(dǎo)致己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性過低，從而降低了葡萄糖通過細(xì)胞膜的效率[14-15]。在兼養(yǎng)過程中并不是碳源濃度越高、光照度越強(qiáng)越好；過量的碳酸氫鈉會使碳酸根與碳酸氫根的離子平衡被破壞，從而形成沉淀；葡萄糖濃度及光照度的增加會抑制某些微藻的生長，同時影響總脂含量[16]。對菱形藻HE06而言，當(dāng)葡萄糖濃度大于0.9時，其生物量并不隨葡萄糖濃度的增加而增加[17]。對于某些種類的微藻，高濃度葡萄糖可在相當(dāng)長一段時期內(nèi)阻礙微藻細(xì)胞生長，此時微藻進(jìn)行分批或連續(xù)培養(yǎng)更有優(yōu)勢[15，18]。微藻能夠以甘油作為僅有碳源，供給能量促進(jìn)微藻的生長，但當(dāng)甘油作為唯一氮源時微藻的光合作用會受到甘油的抑制，從而影響微藻生長[19]。在菱形藻HE06的培養(yǎng)中，碳源加入后其進(jìn)入穩(wěn)定期均延長至15 d，這與葡萄糖濃度或甘油的加入有關(guān)[20]。在混合碳源的優(yōu)化下，均能較好促進(jìn)生物量生長及EPA的積累，比單獨(dú)添加效果更明顯。可見，通過異養(yǎng)獲得EPA產(chǎn)物時，采用多種碳源正交更有利于EPA產(chǎn)物積累，促進(jìn)碳源的利用并節(jié)省培養(yǎng)成本。

影響微藻生長及產(chǎn)物積累的因素多種多樣，對微藻生長發(fā)育的阻礙或促進(jìn)也有所差異。氮源、維生素、碳源對微藻的生物量及產(chǎn)物積累具有明顯作用，對已知藻種進(jìn)行氮源、維生素、碳源的正交優(yōu)化更有利于微藻的生長及產(chǎn)物積累。

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