李玉華++趙奇++雷志華++鄧培淵

摘要：以河南省焦作市武陟縣主栽的地黃品種“金九”和航天搭載誘變后選育出的“HT-102”為材料進(jìn)行大田試驗(yàn)，研究不同地黃品種葉片中活性氧和抗氧化物質(zhì)的差異性。結(jié)果表明：相同生長(zhǎng)期中，HT-102葉片中的活性氧（ROS）水平、抗氧化物質(zhì)含量及SOD、POD抗氧化酶活性都顯著高于金九，差異達(dá)顯著水平（P<0.05）；205 d時(shí)2個(gè)品種葉片中的ROS水平、抗氧化物質(zhì)含量及抗氧化酶活性都顯著高于155 d的樣品，差異達(dá)顯著水平（P<0.05）；同一地黃品種葉片中ROS水平和抗氧化物質(zhì)含量及抗氧化酶活性呈顯著正相關(guān)。在205 d時(shí)，HT-102葉片干枯現(xiàn)象較金九嚴(yán)重。研究表明ROS水平、抗氧化物質(zhì)含量及抗氧化酶活性高低可作為地黃栽培品種的特征之一，能作為地黃種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的一個(gè)指標(biāo)，對(duì)于地黃品種的鑒定具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：地黃；活性氧；抗氧化物質(zhì)；抗氧化酶；脯氨酸

中圖分類(lèi)號(hào)： S567.23+9.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0377-04

收稿日期：2016-01-07

基金項(xiàng)目：河南省科技發(fā)展計(jì)劃 （編號(hào)：132300410355）。

作者簡(jiǎn)介：李玉華（1980—），女，河南濮陽(yáng)人，博士，講師，主要從事植物生理生態(tài)和分子生物學(xué)方面的研究。E-mail：2010liyuhua@163.com。地黃[Rehmannia glutinosa（Gaertn.）Libosch.]，玄參科地黃屬多年生草本植物，可全草入藥，但主要以塊根入藥，是我國(guó)一種大宗常用中藥材。地黃的主要化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜及其苷類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、糖類(lèi)和氨基酸等，地黃及其提取物具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、降血糖、抗衰老、抗腫瘤功效，而且對(duì)造血系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)都具有一定的生理藥理活性[1]，而上述生理、藥理活性均與地黃的抗氧化物質(zhì)密切相關(guān)，所以抗氧化物質(zhì)活性的測(cè)定對(duì)中藥材地黃的質(zhì)量評(píng)價(jià)有一定的指導(dǎo)意義。

許多研究表明，植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)通過(guò)多種途徑產(chǎn)生超氧陰離子（O-2 · ）、羥自由基（·OH）、單線態(tài)氧（ · O2）和過(guò)氧化氫（H2O2） 等活性氧（reactive oxygen species，ROS），影響細(xì)胞的正常代謝。當(dāng)植物生長(zhǎng)受到干旱、鹽漬、農(nóng)藥、病原菌等脅迫或衰老時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，在細(xì)胞內(nèi)造成嚴(yán)重的氧化脅迫[2]。而且，研究還發(fā)現(xiàn)ROS及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)是導(dǎo)致生物衰老和人體多種疾病的主要起因之一[3]。ROS具有很高的化學(xué)反應(yīng)活性，能氧化DNA、損傷蛋白質(zhì)，且使脂質(zhì)過(guò)氧化從而破壞細(xì)胞[4]。為了保護(hù)機(jī)體免受ROS的損害，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)形成了一套非常高效的非酶促/酶促抗氧化系統(tǒng)來(lái)清除ROS，從而減輕氧化脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害和氧化還原狀態(tài)的紊亂程度。非酶促抗氧化系統(tǒng)即抗氧化劑，包括谷胱甘肽（glutathione，GSH）和抗壞血酸（ascorbate，AsA）等[5-6]。酶促抗氧化系統(tǒng)即抗氧化酶，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）[7]。至今，很多學(xué)者對(duì)地黃中主要的酚類(lèi)、糖類(lèi)、苷類(lèi)等抗氧化物質(zhì)進(jìn)行了大量的研究工作[8-9]，而關(guān)于不同品種地黃葉片中的ROS和酶促及非酶促抗氧化物質(zhì)的研究較少。

地黃的品種很多，但由于自然環(huán)境和生產(chǎn)措施的影響，經(jīng)有性雜交和塊根變異，形成了很多地黃栽培品種及其變種，不同品種間質(zhì)量也是參差不齊。金九（03-2）是河南省溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所采用雜交法經(jīng)多年選育而成的產(chǎn)量高、品質(zhì)好、綜合抗性突出的地黃品種[10]，現(xiàn)已成為當(dāng)?shù)氐倪m優(yōu)主栽品種。航天一號(hào)（HT-102）是地黃種子在2006年9月9日15：00 隨“實(shí)踐八號(hào)”育種衛(wèi)星進(jìn)入太空進(jìn)行誘變，再經(jīng)系統(tǒng)篩選、擴(kuò)繁獲得的高產(chǎn)品種[11]。本試驗(yàn)選用金九和 HT-102這 2個(gè)地黃品種，比較其葉片中ROS水平和抗氧化物質(zhì)的差異，從抗氧化角度分析不同品種地黃對(duì)相同生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)性，為其抗性機(jī)理的研究提供參考，進(jìn)而為地黃的栽培種植和品種選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)所用的金九和HT-102地黃品種購(gòu)自河南省焦作市溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，挑選長(zhǎng)度為3～4 cm、直徑相近、部位一致的地黃“種栽”（繁殖材料），于2014年4月20日種植于武陟農(nóng)科種業(yè)公司地黃試驗(yàn)田中，株距約10 cm，行距約 30 cm。在同樣環(huán)境的地塊，采用同樣栽培管理技術(shù)，用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)方法，重復(fù)3次。在地黃栽種后75 d （苗期）、155 d （膨大期）、205 d （收獲期）分別選10株長(zhǎng)勢(shì)均勻的植株，采摘同一位置的功能葉片進(jìn)行指標(biāo)測(cè)試。

1.2測(cè)定項(xiàng)目和方法

O-2 · 含量采用羥胺氧化法[12]測(cè)定；H2O2含量用 H2O2-Ti（SO4）2 反應(yīng)溶液比色法[13]測(cè)定；脯氨酸（Pro）含量采用茚三酮顯色法[13]測(cè)定；還原型抗壞血酸（AsA）含量采用鉬酸銨溶液比色法[12]測(cè)定；還原型谷胱甘肽（GSH）含量采用5，5′-二硫代-（2-硝基苯甲酸）溶液比色法[14]測(cè)定。SOD活性測(cè)定參照Stewart的方法[15]，以SOD抑制氮藍(lán)四唑光還原50%酶量作為1個(gè)酶活力單位（U）；CAT活性測(cè)定參照Abassi等的方法[16]；POD 活性測(cè)定用愈創(chuàng)木酚比色法[17]，以 1 min 內(nèi)D470 nm變化0.01為1個(gè)POD活性單位（U）；APX活性測(cè)定參照Nakano等的方法[18]；GR 活性測(cè)定參照Foyer等的方法[19]。酶提取液中總蛋白濃度用Bradford的方法[20]測(cè)得。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)3次重復(fù)，所有的數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1金九和HT-102葉片中ROS含量的差異

植物在線粒體中進(jìn)行有氧呼吸和葉綠體中進(jìn)行光合電子傳遞過(guò)程中，都會(huì)產(chǎn)生 O-2 · 。O-2 · 是活性氧的一種，是生物體內(nèi)生理生化反應(yīng)的中間產(chǎn)物，能促進(jìn)脂肪氧化，促使生物體衰老。由表1可知：2種地黃葉片中O-2 · 的含量都隨著生長(zhǎng)發(fā)育期的推進(jìn)而升高，且在相同生長(zhǎng)期內(nèi)，HT-102葉片中的O-2 · 含量都較金九高。金九葉片中O-2 · 的含量，在生長(zhǎng)期 155 d 和75 d時(shí)差異不顯著；但O-2 · 的含量在205 d時(shí)比 155 d 時(shí)升高了2.33倍，差異達(dá)到極顯著。HT-102葉片中O-2 · 的含量，在155 d時(shí)比75 d時(shí)升高了24.4%，在205 d時(shí)比在155 d時(shí)升高了2.31倍，差異達(dá)到極顯著。而且，在 205 d 時(shí)，HT-102葉片中O-2 · 的含量比金九高19.7%，差異也達(dá)到極顯著。

H2O2并不是一種很活躍的ROS，但有時(shí)它卻可引發(fā) ·OH 的產(chǎn)生而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。由表1可知：金九葉片中H2O2含量在205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了69.2%，差異達(dá)到極顯著；HT-102葉片中H2O2含量在205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了76.4%，差異也達(dá)到極顯著。HT-102和金九葉片中H2O2含量在75 d時(shí)與155 d時(shí)差異不顯著，但到收獲期205 d時(shí)，H2O2含量與155 d時(shí)相比，差異已達(dá)到極顯著水平，且HT-102比金九葉片中H2O2 含量高16.9%。由表2可知，隨著地黃生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，逐漸升高的ROS含量也會(huì)激活地黃細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)。

2.2金九和HT-102葉片中抗氧化物質(zhì)含量的差異

AsA和GSH是2個(gè)重要的防御氧化脅迫的非酶復(fù)合物[21]，它們能夠緩和生物體內(nèi)的多種氧化應(yīng)激，保護(hù)組織細(xì)胞免受內(nèi)源性ROS的損傷。由表3可知：AsA和GSH的含量在2種地黃葉片中呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，隨著生長(zhǎng)期的推進(jìn)，AsA的含量升高更顯著。金九葉片中AsA含量在205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了189.0%，HT-102葉片中AsA含量在205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了141.2%，差異達(dá)到極顯著水平；且在205 d時(shí)，HT-102葉片中AsA含量比金九高 32.8%。而對(duì)于GSH的水平，金九在205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了26.1%，在155 d 時(shí)比75 d時(shí)升高了23.9%，差異達(dá)到顯著水平。但對(duì)于HT-102來(lái)說(shuō)，其葉片中GSH水平在205 d時(shí)比155 d只上升了9.6%，差異不顯著；而在155 d時(shí)比75 d時(shí)升高了37.0%，差異達(dá)到極顯著水平。

在逆境（旱、熱、鹽堿、冷、凍等）條件下，許多植物體內(nèi)Pro大量積累。積累的Pro作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還能穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)、維持酶的活性、降低細(xì)胞酸性以及調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原勢(shì)等[22]。Pro能作為單態(tài)氧的淬滅劑和·OH的清除劑，所以它在植物的抗衰老過(guò)程中也起著重要的作用。由表3可知：金九Pro水平在205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了 94.4%，HT-102的Pro水平在205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了81.0%。而且，HT-102比金九葉片中Pro含量在205 d時(shí)和155 d時(shí)都高，差異達(dá)到極顯著；這也說(shuō)明：在地黃生長(zhǎng)發(fā)育后期，HT-102比金九葉片中產(chǎn)生了更多的ROS。因此，HT-102葉片中積累較多的Pro來(lái)提高代謝能力。在生長(zhǎng)過(guò)程中，HT-102和金九2個(gè)地黃品種出苗率之間沒(méi)有明顯差異，但到了生長(zhǎng)末期，HT-102和金九相比，葉片干枯和死苗現(xiàn)象嚴(yán)重很多。

2.3金九和HT-102葉片中抗氧化酶活性的差異

由表4可見(jiàn)，SOD、POD和CAT 活性在2種地黃葉片中都隨著生長(zhǎng)發(fā)育期的推進(jìn)而升高。對(duì)SOD活性來(lái)說(shuō)，金九葉片在205 d時(shí)和155 d時(shí)相比上升了72.3%，HT-102葉片在205 d時(shí)和155 d時(shí)相比上升了77.6%。而且，HT-102葉片中SOD活性在205 d、155 d和75 d時(shí)都比金九高，差異達(dá)到極顯著。POD活性和SOD活性有相似的變化趨勢(shì)，但2種地黃葉片中POD的活性增強(qiáng)較SOD劇烈。POD活性顯著增強(qiáng)表現(xiàn)在：金九葉片在205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了6.78倍，HT-102葉片在205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了4.67倍，差異都達(dá)到極顯著水平。然而，CAT活性整體上與SOD和POD卻表現(xiàn)出不同的變化特性。在2種地黃葉片中，CAT活性在205 d、155 d和75 d時(shí)差異都達(dá)到極顯著水平。但是在205 d時(shí)，金九葉片中CAT活性卻比HT-102的高。這很可能是地黃在衰老過(guò)程中，HT-102葉片中積累了更多的ROS，從而造成了對(duì)生物大分子蛋白質(zhì)、酶等更嚴(yán)重的損傷，損傷導(dǎo)致了蛋白質(zhì)解離、酶變性失活，這也和表1的結(jié)果相吻合。

由表5可見(jiàn)，APX和GR 2種酶活性在金九和HT-102地黃生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，整體上表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，而且在生長(zhǎng)的75 d、155 d和205 d時(shí)差異都達(dá)到極顯著水平。GR活性變化具體表現(xiàn)在：金九葉片在155 d時(shí)比75 d時(shí)升高了1.56倍，在205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了73.91%；HT-102葉片在155 d時(shí)比75 d時(shí)升高了1.25倍，205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了37.04%，差異都達(dá)到極顯著水平。對(duì)于APX活性來(lái)說(shuō)，金九葉片在155 d時(shí)比75 d時(shí)升高了76.19%，在205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了1.31倍；HT-102葉片在155 d時(shí)比 75 d 時(shí)升高了93.71%，205 d時(shí)比155 d時(shí)升高了75.45%。而且，在205 d收獲期時(shí)，金九葉片中GR和APX活性都比HT-102的高。這也很可能是地黃在衰老過(guò)程中，HT-102葉片中積累了更多的ROS，從而造成了GR和APX酶變性失活。這也和表1的結(jié)果相符合。

3討論與結(jié)論

近年來(lái)，很多研究表明植物葉片的衰老與ROS引起的損傷有關(guān)。地黃在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生一定量的ROS，而且，隨著生長(zhǎng)發(fā)育期的推進(jìn)，直到衰老期，產(chǎn)生過(guò)量的ROS遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了其自身抗氧化系統(tǒng)的清除能力。本研究中，2個(gè)品種地黃在收獲期葉片中積累了很高水平的 O-2 · 和H2O2，且HT-102 葉片中 O-2 · 和H2O2 水平都高于金九。這些ROS在細(xì)胞內(nèi)會(huì)引起一系列反應(yīng)，如膜損傷、細(xì)胞器功能破壞、代謝反應(yīng)減緩、電解質(zhì)滲漏等，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而且，在生長(zhǎng)后期，HT-102 植株葉片的干枯現(xiàn)象較金九嚴(yán)重，這很可能和HT-102 葉片中ROS水平較高有關(guān)。

己證實(shí)地黃葉片具有很強(qiáng)的抗氧化活性[23]。SOD的主要功能是催化 O-2 · 發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2和O2，從而消除 O-2 · 對(duì)細(xì)胞的損害[24]。正常情況下，SOD活性穩(wěn)定，植物產(chǎn)生和消除 O-2 · 的能力處于動(dòng)態(tài)平衡。但當(dāng)植物衰老或遇到逆境時(shí)，體內(nèi) O-2 · 水平升高，SOD的活性也上升[25]，從而對(duì)植物起到保護(hù)作用。另外，SOD活性強(qiáng)，也間接說(shuō)明了葉片細(xì)胞內(nèi)具有高水平的 O-2 · ，本研究中對(duì) O-2 · 的直接測(cè)定也證明了這一點(diǎn)（表1）。SOD雖然可以清除 O-2 · ，但同時(shí)又有H2O2 的形成。植物體中H2O2 的清除需要依賴(lài)CAT和POD這2種保護(hù)酶的共同作用。細(xì)胞中高濃度的H2O2 主要靠CAT清除，從而盡可能使H2O2 控制在較低水平[26]。但是，在各種逆境脅迫或者植物體衰老的條件下，過(guò)多的H2O2 積累會(huì)造成CAT 活性下降甚至變性失活已被大多數(shù)的研究所證實(shí)。本研究中HT-102 地黃在衰老期葉片中較高的H2O2 水平和較低的CAT活性，與沈文飚、祁春苗等人的研究結(jié)果[27-28]一致。本研究中，POD活性在地黃衰老期大大升高，一方面要清除細(xì)胞內(nèi)的H2O2，另一方面可能它參與了葉綠素的降解[29]、活性氧的產(chǎn)生，并引發(fā)膜脂過(guò)氧化，是植物衰老到一定階段的產(chǎn)物。HT-102 葉片中較高的POD活性也說(shuō)明它較金九更早進(jìn)入了衰老期，葉片膜脂過(guò)氧化更嚴(yán)重。

APX和GR是AsA-GSH循環(huán)中清除H2O2的關(guān)鍵酶。APX通過(guò)把AsA轉(zhuǎn)變成脫氫抗壞血酸而清除 H2O2，AsA的再生由依賴(lài)GSH的脫氫抗壞血酸還原酶催化[30]。本研究中，APX和GR活性在2種地黃葉片中都隨著生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的推進(jìn)而升高（表5），這些酶活性的升高也導(dǎo)致了AsA和GSH的積累（表3）。因?yàn)樵诘攸S生長(zhǎng)過(guò)程中，為了防治黃斑病、輪紋病、枯萎病及其他常見(jiàn)的病毒病而噴施多種農(nóng)藥后，在一定時(shí)期內(nèi)對(duì)地黃葉片造成傷害。以上抗氧化酶活性升高，是為了減輕病害、農(nóng)藥及衰老等因素對(duì)地黃細(xì)胞的傷害?？寡趸富钚缘纳呖赡苁侵参矬w內(nèi)新合成或激活了編碼這些抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[31]，進(jìn)而增強(qiáng)了地黃的抗性。但是，在地黃生長(zhǎng)末期，葉綠素的降解快于合成、葉片逐漸黃化、RNA水解、蛋白質(zhì)也迅速降解，ROS水平超出防御機(jī)制所受范圍，細(xì)胞處于氧化脅迫狀態(tài)，進(jìn)而會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化以及酶失活，最終激活程序性細(xì)胞死亡。HT-102 地黃葉片中高水平的 O-2 · 和H2O2 與其葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象較早以及后期葉片干枯現(xiàn)象更嚴(yán)重有直接的關(guān)系。

總之，地黃不同品種ROS和抗氧化物質(zhì)的差別反映了地黃種質(zhì)資源在抵抗外界脅迫和適應(yīng)環(huán)境方面的遺傳多樣性。ROS含量高無(wú)疑不利于光合產(chǎn)物的積累和次生代謝產(chǎn)物的合成[32-33]，但不同品種產(chǎn)量的高低除與抗氧化物質(zhì)水平高低有關(guān)外，還與其他遺傳因素和栽培條件有關(guān)。葉片早衰是影響地黃和其他農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一，因此ROS和抗氧化物質(zhì)含量的高低只是地黃栽培育種的參考指標(biāo)之一。本研究為今后揭示地黃衰老的分子機(jī)制，以及在生產(chǎn)實(shí)踐中延緩地黃的衰老進(jìn)程，并進(jìn)一步提高地黃的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的理論價(jià)值。

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