龐庭才++熊拯++胡上英+廖燕青

摘要：采用堿液提取法對銀葉樹果殼木質(zhì)素進(jìn)行提取分離，以單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法研究提取溫度、KOH濃度、料液比、提取時(shí)間對銀葉樹果殼木質(zhì)素提取效果的影響，并對所提取木質(zhì)素進(jìn)行紫外光譜分析和抗氧化性研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀葉樹果殼木質(zhì)素最佳提取工藝參數(shù)為：提取溫度60 ℃、KOH濃度0.5 mol/L、料液比1 g ∶ 55 mL、提取時(shí)間2 h，在此條件下木質(zhì)素得率達(dá)到10.78%。銀葉樹果殼木質(zhì)素濃度對羥基自由基、超氧陰離子自由基和對DPPH自由基均有明顯的清除作用，且清除率隨木質(zhì)素濃度增加而增大。

關(guān)鍵詞：銀葉樹果殼；木質(zhì)素；抗氧化性

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0385-04

收稿日期：2015-05-10

基金項(xiàng)目：廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究（編號：2013YB260；2013LX161）；欽州學(xué)院校級科研項(xiàng)目（編號：2014XJKY-58C）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號：201411607064）。

作者簡介：龐庭才（1985—），男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹参镉行С煞痔崛∨c分析。E-mail：pangtingcai@126.com。銀葉樹（Heritiera littoralis）屬梧桐科植物，是熱帶、亞熱帶海岸紅樹林中的喬木樹種，主要分布于我國廣東、廣西和臺灣等地區(qū)，是比較典型的水陸兩棲紅樹植物種類[1]。銀葉樹的根為板狀根，莖高而大，葉背銀白色，果實(shí)形狀奇特，為近心形或近橢圓形或扁圓形，果皮木質(zhì)化，外果皮堅(jiān)硬[2]。有關(guān)銀葉樹的研究主要集中在地理分布與形態(tài)特征[3-4]、生物化學(xué)與遺傳多樣性[5-6]、抗性生理[7-8]、育苗造林技術(shù)[9-10]、資源利用[11-12]等方面，而對于銀葉樹果殼的研究還比較少。目前銀葉樹果殼常常在果實(shí)被采摘之后當(dāng)作垃圾遺棄，這不僅造成資源的浪費(fèi)，還對環(huán)境造成了一定的危害。因此，為了高效利用銀葉樹資源，有必要開展銀葉樹果殼木質(zhì)素的研究。木質(zhì)素是一種在酸作用下難以水解、具有復(fù)雜空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚芳基化合物，主要存在于木質(zhì)化植物的細(xì)胞中，是工業(yè)上唯一能從可再生資源中獲取的芳香族化合物[13]，具有較高地利用價(jià)值。但是由于木質(zhì)素自身理化性質(zhì)不均一、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分離提取困難等因素，使得木質(zhì)素至今沒有被很好的利用。近年來，隨著研究的深入，從花生殼、核桃殼、造紙廢液中提取木質(zhì)素的研究開始增多[14-16]，但從銀葉樹果殼中提取木質(zhì)素的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究采用一般堿法提取銀葉樹果殼中的木質(zhì)素，并對所提取木質(zhì)素進(jìn)行紫外光譜分析和抗氧化性研究。通過對銀葉樹果殼木質(zhì)素的研究，為提高銀葉樹的綜合利用價(jià)值，進(jìn)一步開發(fā)和利用紅樹資源提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

銀葉樹果實(shí)外種殼，產(chǎn)自廣西防城港北侖河口紅樹林保護(hù)區(qū)。

試驗(yàn)用氫氧化鉀、鹽酸、乙醇等試劑均為AR，1，1-二苯基-2苦肼基為BR。主要儀器有紫外可見分光光度計(jì)（UV-3200），上海美譜達(dá)儀器有限公司；電子天平（EL204）梅特勒-托利多（上海）有限公司；高速離心機(jī)（H1850），湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-3000），上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ）]，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1樣品預(yù)處理銀葉樹果殼在60 ℃下干燥至恒質(zhì)量，粉碎，過80目篩。用甲苯與乙醇混合溶液（體積比為2 ∶ 1）浸提10 h后過濾，回收甲苯-乙醇溶劑，濾渣40 ℃烘干至恒質(zhì)量，得樣品備用。

1.2.2銀葉樹果殼中木質(zhì)素的提取稱取預(yù)處理后的銀葉樹果殼粉末1.0 g，按一定的料液比加入一定濃度的KOH溶液，在設(shè)定的水浴溫度條件下浸提一定時(shí)間，抽濾取濾液，用6 mol/L乙酸將濾液pH值調(diào)至5.5，減壓蒸餾得樣品濃縮液，加入濃縮液3倍體積的95%乙醇，混勻后靜置，待沉淀完全后，抽濾。濾液通過減壓蒸餾除去乙醇，用6 mol/L HCl 將樣液pH值調(diào)至1.5，靜置后過濾，所得濾渣用pH值為2的HCl溶液洗滌，低溫干燥，即得到堿木質(zhì)素[17]。

木質(zhì)素得率=木質(zhì)素產(chǎn)量原料質(zhì)量×100%。

（1）

1.2.3單因素試驗(yàn)提取溫度對木質(zhì)素得率的影響在提取時(shí)間1.5 h、料液比1 g ∶ 55 mL、KOH濃度0.5 mol/L條件下，研究不同溫度（40、50、60、70、80 ℃）對木質(zhì)素得率的影響。

1.2.3.1KOH濃度對木質(zhì)素得率影響在提取溫度60 ℃、提取時(shí)間1.5 h、料液比 1 g ∶ 55 mL條件下，研究不同KOH溶液濃度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L）對木質(zhì)素得率的影響。

1.2.3.2料液比對木質(zhì)素得率的影響在提取溫度60 ℃、提取時(shí)間1.5 h、KOH濃度0.5 mol/L條件下，研究不同料液比（1 ∶ 25、1 ∶ 35、1 ∶ 45、1 ∶ 55、1 ∶ 65，g/mL）對木質(zhì)素得率的影響。

1.2.3.3提取時(shí)間對木質(zhì)素提取得率的影響在提取溫度60 ℃、料液比1 g ∶ 55 mL、KOH濃度0.5 mol/L條件下，研究不同提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）對木質(zhì)素得率的影響。

1.2.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以銀葉樹果殼木質(zhì)素得率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)（表1），以確定最佳的銀葉樹果殼木質(zhì)素提取工藝參數(shù)。

1.2.5紫外光譜的測定取一定量提取所得木質(zhì)素樣品，溶于適量乙醇溶液中，以乙醇溶液為空白，用紫外可見分光光度計(jì)測其在200～400 nm范圍內(nèi)的吸收光譜。

1.2.6木質(zhì)素抗氧化性研究

1.2.6.1DPPH自由基的清除[18]稱取0.003 8 g的DPPH用無水乙醇溶解，定容至50 mL，搖勻得到濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液，放于冰箱內(nèi)備用。在具塞試管中分別加入 2 mL 濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的木質(zhì)素樣品溶液，再加入2 mL的DPPH溶液作為試驗(yàn)組，避光反應(yīng)30 min后在波長517 nm處測定其吸光度。以2 mL樣品溶液加入2 mL的無水乙醇作對照組，以2 mL的DPPH溶液加入2 mL蒸餾水中作為空白，計(jì)算對DPPH自由基的清除率。

清除率=D0-（Di-Di0）D0×100%。

式中：Di為試驗(yàn)組吸光度；Di0對照組吸光度；D0為空白吸光度；以無水乙醇作為參比。

1.2.6.2羥基自由基（·OH）的清除[19]稱取0.083 4 g FeSO4·7H2O溶于少量蒸餾水中，定容至50 mL，得到 6 mmol/L FeSO4 溶液；稱取0.041 4 g水楊酸溶于少量無水乙醇中，用無水乙醇準(zhǔn)確定容至50 mL，得到6 mmol/L的水楊酸-乙醇體系；用微量移液器量取166.7 μL 30%的H2O2用蒸餾水定容至50 mL容量瓶中，得到0.1%的H2O2。在 15 mL 的具塞試管中分別加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液，2 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，再分別加入2 mL濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL樣品溶液，最后加入 2 mL H2O2啟動反應(yīng)，37 ℃水浴反應(yīng)30 min后，以 4 000 r/min 速度離心 5 min，取上清液在510 nm處測定吸光度，以此作為試驗(yàn)組。以蒸餾水代替H2O2作為對照組，以蒸餾水代替樣品作為空白。

清除率=D0-（Di-Di0）D0×100%。

式中：Di為樣品組；Di0為對照組；D0為以蒸餾代替樣品的空白。

1.2.6.3超氧陰離子自由基（ O-2 · ）的清除[20]在25 ℃的恒溫水浴鍋中，將pH值 8.2的Tris-HCl緩沖液和45 mmol/L鄰苯三酚保溫20 min后，取4.5 mL pH值8.2的Tris-HCl 緩沖液，加 0.3 mL 45 mmol/L鄰苯三酚，振蕩器混勻，在 25 ℃ 水浴中反應(yīng)4 min，加入8 mol/L HCl終止反應(yīng)，在 325 nm 測吸光度，計(jì)算出鄰苯三酚的自氧化率V0。取 4.5 mL Tris-HCl緩沖液，加入不同濃度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL）的銀葉樹果殼木質(zhì)素溶液2 mL在25 ℃恒溫水浴中放置20 min后，加入 0.3 mL 的25 ℃預(yù)熱的鄰苯三酚溶液，振蕩混勻，在25 ℃水浴中反應(yīng)4 min，加入6 mol/L HCl終止反應(yīng)，在 325 nm 測吸光度，計(jì)算出加入樣品后鄰苯三酚的自氧化率V1。

清除率=[（V0-V1）/V0]×100%。

式中：V0為對照組；V1為樣品組。

2結(jié)果與討論

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取溫度對木質(zhì)素得率的影響在40～60 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，木質(zhì)素的得率呈明顯上升趨勢，在 60 ℃ 時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，得率反而有所下降（圖1）。其原因可能是當(dāng)溫度較低時(shí)，由于纖維素上木質(zhì)素結(jié)構(gòu)結(jié)合緊密，結(jié)構(gòu)破壞力大，使木質(zhì)素分離不徹底，部分木質(zhì)素還殘留在果殼纖維中[21]，所以木質(zhì)素的得率略低；當(dāng)提取溫度超過60 ℃時(shí)，會導(dǎo)致部分木質(zhì)素分解，從而影響了木質(zhì)素得率。因此，最佳提取溫度為60 ℃。

2.1.2KOH濃度對木質(zhì)素得率的影響隨著堿液濃度的增大，木質(zhì)素得率呈上升趨勢，堿液濃度為0.5 mol/L時(shí)木質(zhì)素

得率達(dá)到最大值，之后得率趨于平穩(wěn)（圖2）。結(jié)果表明，適宜的堿濃度可斷裂木質(zhì)素與糖聚物之間的酯鍵和醚鍵，而堿濃度較高時(shí)，木質(zhì)素可能發(fā)生氧化和自身縮合反應(yīng)造成損失。因此，最佳KOH濃度為0.5 mol/L。

2.1.3料液比對木質(zhì)素得率的影響料液比在1 g ∶ （25～55） mL之間，木質(zhì)素得率逐漸升高，料液比1 g ∶ 55 mL時(shí)得率達(dá)到最大值，之后隨著料液比的繼續(xù)增大，木質(zhì)素得率反而有所降低（圖3）。其原因可能是當(dāng)料液比較小時(shí)，隨著提取溶液的增加有利于木質(zhì)素的溶出；但當(dāng)料液比超過 1 g ∶ 55 mL 時(shí)，木質(zhì)素得率趨于平穩(wěn)，基本不再提高。因此，最佳料液比為 1 g ∶ 55 mL。

2.1.4提取時(shí)間對木質(zhì)素得率的影響隨著提取時(shí)間的增加，木質(zhì)素得率呈上升趨勢，當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，木質(zhì)素得率達(dá)到最大值，之后隨著提取時(shí)間繼續(xù)增加，得率反而有所降低（圖4）。其原因可能是在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長，木質(zhì)素與纖維素分離程度逐漸提高，使得木質(zhì)素得率也隨之增大；而當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2.0 h后，樣品中木質(zhì)素基本已經(jīng)全部溶出，之后隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長，木質(zhì)素得率也趨于平穩(wěn)。因此，最佳提取時(shí)間為2.0 h。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

影響銀葉樹果殼木質(zhì)素得率的因素主次為：KOH濃度

（B）>提取溫度（A）>料液比（C）>提取時(shí)間（D）。提取木質(zhì)素的最佳工藝參數(shù)為：A2B2C3D2，即提取溫度為60 ℃、KOH濃度為0.5 mol/L、料液比為1 g ∶ 65 mL、提取時(shí)間為 2.0 h。在此條件下對最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)得到的木質(zhì)素平均得率分別是10.68%、10.79%、10.80%、10.90%、10.74%（表2）。因此，銀葉樹果殼木質(zhì)素得率為10.78%，說明該木質(zhì)素提取工藝穩(wěn)定可行。

2.3紫外吸收波譜分析

在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，測得本試驗(yàn)所提取的木質(zhì)素的紫外吸收光譜（圖5）。在216 nm處產(chǎn)生最大吸收峰，這些是苯環(huán)物質(zhì)典型的特征吸收峰，說明所提取得到的木質(zhì)素為芳香族化合物。由紫外光譜分析表明，所提取的木質(zhì)素含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，具有較好的化學(xué)活性。

2.4抗氧化性研究結(jié)果

2.4.1對DPPH自由基的清除效果銀葉樹果殼木質(zhì)素對 DPPH 自由基具有明顯的清除作用，DPPH的清除率隨著木質(zhì)素濃度的提高而升高，當(dāng)銀葉樹果殼木質(zhì)素濃度達(dá)到 0.25 mg/mL 時(shí)，對DPPH自由基的清除率可達(dá)到80.6%（圖6），說明銀葉樹果殼木質(zhì)素具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

2.4.2對羥基自由基（·OH）的清除效果銀葉樹果殼木質(zhì)素對羥基自由基（·OH）具有明顯的清除作用，羥基自由基（·OH）的清除率隨著木質(zhì)素濃度的提高而升高，當(dāng)銀葉樹果殼木質(zhì)素濃度為0.5 mg/mL時(shí)，對羥基自由基（·OH）的清除率為26.8%，當(dāng)濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)到 83.7%（圖7），說明銀葉樹果殼木質(zhì)素具有較強(qiáng)的羥基自由基（·OH）清除能力。

2.4.3對超氧陰離子（ O-2 · ）的清除效果銀葉樹果殼木質(zhì)素對超氧陰離子自由基（ O-2 · ）具有明顯的清除作用，超氧陰離子自由基（ O-2 · ）的清除率隨著木質(zhì)素濃度的提高而升高，當(dāng)銀葉樹果殼木質(zhì)素濃度為0.1 mg/mL時(shí)，對超氧陰離子自由基（ O-2 · ）的清除率為45.1%，當(dāng)濃度達(dá)到 0.9 mg/mL 時(shí)，清除率可達(dá)到89.8%（圖8），說明銀葉樹果殼木質(zhì)素具有較強(qiáng)的超氧陰離子自由基（ O-2 · ）清除能力。

3結(jié)論

（1）經(jīng)正交試驗(yàn)分析，得到最佳提取工藝條件：提取溫度為60 ℃、KOH濃度為0.5 mol/L、料液比1 g ∶ 65 mL、提取時(shí)間為2 h，在此條件下木質(zhì)素得率達(dá)到10.78%。各因素對木質(zhì)素得率的影響順序?yàn)椋篕OH濃度>提取溫度>料液比>提取時(shí)間。

（2）紫外光譜分析表明，在216 nm附近有較強(qiáng)的吸收帶，所提取的木質(zhì)素含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，具有較好的化學(xué)活性。

（3）抗氧化性研究表明，對DPPH自由基、羥基自由基（·OH）、對超氧陰離子自由基（ O-2 · ）的清除率隨著銀葉樹果殼木質(zhì)素的濃度提高而提高，清除率最高分別為80.6%、83.7%、89.8%。

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