陳小金，董志珍，趙祥平，王建華，劉　洋，王玉玲，陳本龍，肖　妍，王乃福，張俊哲（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)中心，天津　300467）

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基因3型豬戊型肝炎病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

陳小金，董志珍，趙祥平，王建華，劉洋，王玉玲，陳本龍，肖妍，王乃福，張俊哲
（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)中心，天津300467）

摘要：對(duì)GenBank中基因3型豬戊型肝炎病毒（HEV）代表毒株基因進(jìn)行序列分析，最終選定ORF3基因的部分序列為目的基因，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)特異性引物和探針，擴(kuò)增獲得目的片段，并構(gòu)建重組載體pUC-19-ORF3。梯度稀釋重組質(zhì)粒制備標(biāo)準(zhǔn)品，初步建立檢測(cè)基因3型HEV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。對(duì)建立的檢測(cè)方法進(jìn)行特異性、敏感性和重復(fù)性驗(yàn)證。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品濃度在108~102copies/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.996。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，其它幾種常見豬病病原體（豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒）未見典型擴(kuò)增曲線。敏感性試驗(yàn)證實(shí)本方法的最低檢測(cè)下限為101copies/μL。重復(fù)性試驗(yàn)表明該方法對(duì)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果的批內(nèi)和批間變異系數(shù)低于2%。用該方法抽檢59份進(jìn)境豬肉樣品，同時(shí)用普通RT-PCR方法對(duì)這些樣品進(jìn)行符合性試驗(yàn)，結(jié)果均為陰性。本研究所建立的檢測(cè)方法不僅適用于進(jìn)境豬肉樣品中基因3型HEV的監(jiān)控檢測(cè)，而且還可用于基因3型HEV的早期臨床診斷及分子流行病學(xué)調(diào)查。

關(guān)鍵詞：豬戊型肝炎病毒；TaqMan探針；熒光定量RT-PCR

戊型肝炎（Hepatitis E）由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起，臨床上主要表現(xiàn)為急性肝炎[1-2]。人感染后的病死率為1%~4%，孕婦病死率可達(dá)25%[1]，戊型肝炎病毒主要通過糞-口途徑、污染的水源，以及食用未煮熟的豬肉、野豬肉和鹿肉等制品傳播。盡管HEV只有一個(gè)血清型，但具有高度的遺傳多樣性。目前普遍認(rèn)可將HEV分為4個(gè)基因型：基因1型和2型主要感染人類，基因3型和4型可感染人和動(dòng)物[3-4]。

自1997年首次分離到豬源HEV之后，在世界范圍內(nèi)的不同物種（野豬、貓鼬和鹿）體內(nèi)都可檢測(cè)到HEV。幾乎所有發(fā)達(dá)國家的人和動(dòng)物體內(nèi)都已證實(shí)檢測(cè)到基因3型HEV。屠宰場(chǎng)工人和獸醫(yī)具有更高的血清陽性率[5]。鑒于目前HEV血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果，據(jù)估計(jì)全球人口的三分之一接觸過該病毒[6]?；?型和基因4型可以在除人外的靈長類和豬之間跨種傳播[7]。

豬肉是HEV通過食源性途徑傳播的主要來源。目前，檢測(cè)HEV的方法主要有免疫電鏡、免疫熒光、血清中和試驗(yàn)、ELISA方法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。這些方法雖各有優(yōu)點(diǎn)，但都不能滿足特定要求。熒光定量PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性好、高通量、操作簡(jiǎn)便省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可對(duì)待檢樣品進(jìn)行精確定量，可用于批量樣品中病原檢測(cè)。從首次發(fā)現(xiàn)戊型肝炎病毒到現(xiàn)在，各國的研究者建立了多種HEV的檢測(cè)方法，為HEV的深入研究提供了技術(shù)手段。我國的流行毒株主要為基因4型HEV，且現(xiàn)階段關(guān)于HEV檢測(cè)方法大部分是針對(duì)血清、糞便及肝臟樣本，缺乏針對(duì)肉制品中基因3型的HEV快速準(zhǔn)確敏感的檢測(cè)方法。本研究旨在建立一種針對(duì)基因3型HEV的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，用于進(jìn)境豬肉及其產(chǎn)品HEV的定量檢測(cè)。該方法的建立將有助于進(jìn)出境動(dòng)物源性食品檢驗(yàn)檢疫體系進(jìn)一步完善，進(jìn)而保證食品安全和公共衛(wèi)生安全。

1　材料與方法

1.1毒株、細(xì)胞系及臨床病料

試驗(yàn)中使用的病毒株，如豬輪狀病毒（Porcine rotsvirus，PoRV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病 毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome viruse，PRRSV）均為疫苗毒。59份豬肉樣品分別來自德國、西班牙、英國等，為2015年收集的歐盟國家進(jìn)境豬肉樣品。

1.2主要試劑及儀器

One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit、pUC19載體購自大連寶生物工程有限公司；Trizol IS購自Invitrogen公司；隨機(jī)引物和 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購于Promega公司；Axgen DNA Gel Extraction Kit 購自Axgen公司；PCR擴(kuò)增儀購自伯樂生物有限公司；紫外分光光度計(jì)購自Thermo公司；金屬恒溫連接儀購自Eppendorf公司；Roche LightCycler 480 II熒光定量PCR儀購自羅氏公司。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank登錄的10株基因3型HEV代表毒株基因序列，將不同毒株的ORF3基因進(jìn)行序列比對(duì)，篩選保守區(qū)域，并以其為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，預(yù)期擴(kuò)增目的片段長度分別為114 bp和140 bp。引物和探針均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性引物和探針序列見表1。

表1　引物和探針序列

1.4模板制備及病毒核酸的提取和反轉(zhuǎn)錄

實(shí)驗(yàn)所需模板由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

取250 μL疫苗毒，加入750 μL Trizol IS混勻，室溫靜置5 min；向EP管中加入200 μL氯仿，漩渦震蕩器上振蕩混勻30 s，靜置 10 min；之后將離心管置于4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min，吸取上清，加入600 μL的異丙醇，置于-20 ℃冰箱30 min；4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄掉上清，離心管中加新鮮配制的750 mL/L 乙醇1 mL，洗滌沉淀；4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀置于室溫干燥5~10 min；以30 μL DEPC水溶解，獲得RNA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定和制備

試驗(yàn)所需模板為人工合成。以合成的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL，具體如下：10 PCR緩 沖 液 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上、下游引物各（10 pmol/mL）1.0 μL，Ex Taq（5U/mL）0.2 μL，DNA模板2 μL，最后用滅菌去離子水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用 Axgen DNA Gel Extraction Kit回收，將目的片段克隆到 pUC19載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5-α中。搖菌篩選陽性質(zhì)粒，提取質(zhì)粒，并對(duì)重組陽性質(zhì)粒PCR鑒定、測(cè)序，篩選基因序列正確的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒濃度，根據(jù)公式換算質(zhì)粒濃度到copies/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6熒光定量 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過正交法對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)體系中的引物濃度、探針濃度和反應(yīng)條件等進(jìn)行篩選和優(yōu)化，最終確定的反應(yīng)體系為： buffer 10.0 μL，上、下游引物（10 pmol/mL）各1.0 μL，探針（2 pmol/mL）1.2 μL， 模 板1.0 μL，Taq酶 0.4μL，PrimeScript RT酶0.4 μL，加滅菌去離子水至總體積20 μL；最佳反應(yīng)條件為42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。10倍梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC19-ORF3，以系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板在LightCycler480II熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，獲得擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線，并依此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性、敏感性和重復(fù)性評(píng)價(jià)

1.7.1特異性試驗(yàn)。分別提取PRRSV、CSFV、 TGEV、PEDV、PoRV的RNA，以最佳反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件在羅氏LightCycler480II熒光定量PCR儀進(jìn)行操作，試驗(yàn)過程中同時(shí)設(shè)立陰性和陽性對(duì)照。

1.7.2敏感性試驗(yàn)。梯度稀釋已知濃度的重組質(zhì)粒（108~100copies/μL），吸取1.0 μL不同濃度質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行Real-time PCR，得出本研究所建立的檢測(cè)方法所能檢出的最低拷貝數(shù)。同時(shí)取上述相同體積質(zhì)粒作為模板進(jìn)行常規(guī)RT-PCR，以比較兩種方法的敏感性。

1.7.3重復(fù)性試驗(yàn)。選取3個(gè)已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品（106、105、104）作為批間和批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)的模板，進(jìn)行Real-time PCR，試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。上述3個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品分別設(shè)立3個(gè)重復(fù)，在同一反應(yīng)條件下同時(shí)檢測(cè)，通過分析試驗(yàn)所得的Ct值，進(jìn)而計(jì)算其批內(nèi)變異系數(shù)；將上述3個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品置-20 ℃保存，每次間隔1周連續(xù)檢測(cè)3次，通過分析試驗(yàn)所得的Ct值，計(jì)算其批間變異系數(shù)。

1.8樣品的檢測(cè)

將2015年的59份進(jìn)境豬肉樣品用液氮研磨，Trizol法提取樣品RNA，以最佳反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件進(jìn)行Real-time RT-PCR檢測(cè)。同時(shí)以上述樣品的RNA作為模板，進(jìn)行常規(guī)RT-PCR檢測(cè)，比較這2種方法檢測(cè)樣品的符合率。

2　結(jié)果

2.1引物的特異性

以設(shè)計(jì)的兩組特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 分得到大小為114 bp和140 bp的目的片段，與預(yù)期相符（圖1）。將獲得的目的片段與載體pUC19 連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒pUC19-ORF3的測(cè)序結(jié)果顯示，試驗(yàn)所擴(kuò)增的目的片段與親本HEV基因序列的一致性為100 % 。

2.2Real-time PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)試劑盒說明小量提取陽性重組質(zhì)粒，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)得質(zhì)粒DNA的濃度為340 ng/ μL， 經(jīng)過計(jì)算得出其拷貝數(shù)為 1.0 1011copies/μL，對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋， 選擇108~102copies/ μL 的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

圖1　HEV引物特異性的PCR 鑒定

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品依最佳反應(yīng)條件進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，結(jié)果呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。擴(kuò)增曲線（圖2）分析表明，曲線1、2、3、4、5、6、7、NTC分別為模板濃度108、107、106、105、104、103、102、101copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品動(dòng)力學(xué)曲線；質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從108~102copies/μL的Ct值分別 為 12.00、15.55、14.20、18.96、22.57、25.57、29.79 和 32.89。標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）分析表明，斜率為-3.491，x軸截距為39.930，直線方程為y = -3.491x + 39.930，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999，擴(kuò)增效率為0.934。

2.3特異性

采用Real-time RT-PCR檢測(cè)PoRV、PRRSV、CSFV、TGEV、PEDV的RNA， 結(jié)果均為陰性，其特異性擴(kuò)增曲線見圖4 。

圖2　標(biāo)準(zhǔn)品的動(dòng)力學(xué)曲線

圖3　標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4　特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4重復(fù)性

采用Real-time PCR 對(duì)106、105、104copies/ μL的標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)及批間重復(fù)試驗(yàn)，批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.59%、0.20%、0.20%；批間變異系數(shù)分別為1.23%、0.87%、0.58%（表2）。以上結(jié)果表明3個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)所得Ct值的批間和批內(nèi)的變異系數(shù)均小于2%， 表明本研究所建立的方法具有很好的穩(wěn)定性。

表2　HEV熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

2.5敏感性

以 108~100copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個(gè)濃度1.0 μL進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和常規(guī)RT-PCR。Real-time RT-PCR對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)下限為101copies/μL，而常規(guī)PCR的檢測(cè)下限為103copies/ μL（表3），表明Real-time RT-PCR比常規(guī)RT-PCR敏感約100倍。

表3　HEV敏感性試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

2.6樣品的檢測(cè)

抽檢來自英國、德國、西班牙等歐盟國家的豬肉樣品61份，應(yīng)用Real-time PCR、常規(guī)RT-PCR對(duì)病料進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在59份待檢樣品中，Real-time PCR檢出0份陽性，常規(guī)RT-PCR 檢出0份陽性。檢測(cè)結(jié)果（表4）表明，本試驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)RT-PCR方法的符合率為100%。

表4　樣品檢測(cè)結(jié)果

3　討論

過去幾年進(jìn)行的流行病學(xué)和病毒學(xué)研究已清楚地表明，戊型肝炎是一種新出現(xiàn)的人畜共患病。豬是HEV主要?jiǎng)游锼拗?，由于其與全球豬肉食品鏈有較大的相關(guān)性，未來的公共健康問題備受關(guān)注。HEV可以通過食物傳播。人類通過攝入具有感染性的肉制品從而感染HEV。在日本，對(duì)10例暴發(fā)性戊型肝炎患者風(fēng)險(xiǎn)因素和分子特征分析表明，這些患者發(fā)病前2~8周有食用燒烤或未煮熟的豬肝的歷史，同時(shí)發(fā)現(xiàn)臨床樣本HEV RNA序列與市場(chǎng)上出售豬肝或農(nóng)場(chǎng)豬樣本中HEV基因序列相同或相似[8]。在豬肝或豬肉中確認(rèn)有HEV的存在，且豬肝、腸中的HEV具有傳染性，更加凸顯了食用的實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)。除了被感染的動(dòng)物肉，被含有HEV豬糞、動(dòng)物或人類排泄物污染的水灌溉土地，可能導(dǎo)致其他食品被污染，如徑流流域和沿海流域的農(nóng)產(chǎn)品或貝類[9]，最終引起食用者發(fā)病，從而進(jìn)一步提高公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。歐洲國家學(xué)者的研究表明，目前歐洲的HEV流行毒株以基因3型為主，且豬為戊型肝炎病毒的主要宿主[10-11]。尤其值得注意的是，2014年底英國每日郵報(bào)報(bào)道稱，在英國超市約四分之一的豬肉中檢出HEV陽性，這對(duì)所有進(jìn)口國的食品安全和公共衛(wèi)生造成威脅。綜上所述，加強(qiáng)豬戊型肝炎病毒的檢測(cè)與監(jiān)控是非常有必要的，建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)于戊型肝炎的防控有重要意義。

熒光定量PCR具有靈敏度高、重復(fù)性好和準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)時(shí)間更短，檢測(cè)結(jié)果的假陽性低，無需進(jìn)行電泳從而減少實(shí)驗(yàn)室污染。熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法能夠?qū)崿F(xiàn)擴(kuò)增與檢測(cè)同步完成，操作更簡(jiǎn)便，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)、病原體檢測(cè)、病毒載量測(cè)定和食品衛(wèi)生檢疫等方面。通常情況下，對(duì)于序列差異比較大的基因片段，在進(jìn)行目的片段擴(kuò)增的過程中，可根據(jù)基因序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。簡(jiǎn)并引物中每個(gè)單獨(dú)引物的有效濃度較低，難以估算簡(jiǎn)并引物的Tm值，同時(shí)對(duì)于簡(jiǎn)并引物中二級(jí)結(jié)構(gòu)和因簡(jiǎn)并而引起的引物間相互作用也很難進(jìn)行分析[12-13]。HEV基因組具有異質(zhì)性，這一特性不僅體現(xiàn)在不同基因型之間，還體現(xiàn)在同一基因型不同毒株之間。HEV基因組中ORF2和ORF3基因的GC含量相對(duì)較高，這使得引物和探針設(shè)計(jì)比較困難。本試驗(yàn)過程中曾分別針對(duì)HEV的ORF2和ORF3基因設(shè)計(jì)特異性引物，也嘗試過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，篩選到ORF3上設(shè)計(jì)的兩套引物，并依此設(shè)計(jì)兩條特異性探針，最終確定最佳引物為HEV-F和HEV-R2，探針為HEV-P2。文中所建立的TaqMan熒光定量檢測(cè)方法以O(shè)RF3的保守區(qū)為靶基因，無需使用簡(jiǎn)并引物或探針，靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)基因3型豬HEV的檢測(cè)下限可達(dá)10個(gè)拷貝，這比常規(guī)巢式PCR測(cè)定法的檢測(cè)下限低[14]。

本研究的主要目的是建立豬肉及其制品中基因3型HEV的TaqMan 熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本文建立的TaqMan熒光定量RTPCR測(cè)定法是一種可以用于檢測(cè)進(jìn)境豬肉樣品中HEV的有效方法。但是由于目前收集的樣品數(shù)量有限，目前尚未檢出陽性樣品。將來計(jì)劃將該方法用于檢測(cè)基因3型HEV動(dòng)物臨床樣本，從而進(jìn)一步驗(yàn)證其有效性。本研究為將來檢測(cè)試劑盒的研制奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。同時(shí)該方法還可用于分子流行病學(xué)調(diào)查、病毒的致病機(jī)理和病毒在機(jī)體內(nèi)的分布等方面的定量研究。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Establishment of TaqMan Fluorescence Quantitative RT-PCR Assay for Swine Hepatitis E Virus Detection

Chen Xiaojin，Dong Zhizhen， Zhao Xiangping，Wang Jianhua，Liu Yang，Wang Yuling，CHen Benlong，Xiao Yan，Wang Naifu，Zhang Junzhe
（Animal and Plant and Foodstuffs Inspection Center，Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300456）

Abstract：Primers and probe were designed based on the ORF3 gene sequences of genotype 3 Hepatitis E virus （HEV）available in GenBank. A recombinant plasmid pUC19-ORF3 containing the target gene was constructed as a standard control，then a real-time PCR assay for the detection of HEV was established. The specificity，sensitivity and reproducibility of the assay were evaluated and compared with conventional RT-PCR. Results showed that the real-time RT-PCR assay was highly specific with a broad linear detection range from 102copies/μL to 108copies/μL，and the correlation coefficient of the assay was 0.996. The sensitivity for HEV was 101copies/μL. The specificity analyses using cDNA of porcine reproductive and respiratory syndrome virus， classical swine fever virus，transmissible gastroenteritis virus of swine，porcine rotovirus and porcine epidemic diarrhea virus as the templates that the amplifications from these viruses were negative while the amplification from HEV were positive. Inter- and intra-assay variables of CV were less than 2%. 59 samples detected by the real-time PCR and RT-PCR were negtive with HEV. The coincidence of the realtime PCR was 100% with RT-PCR for the samples. The results showed that the method established in this study was suitable for detecting the genotype 3 HEV of imported pork samples. This assay also provided an effective method for rapidly diagnosis，vaccine quality control and molecular epidemiological investigation of HEV.

Key words：Hepatitis E virus of swine；TaqMan probe；fluorescence quantitative RT-PCR

中圖分類號(hào)：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-944X（2016）07-0072-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.07.023