張和平，宗玉霞，王李輝

(河南省平頂山市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 平頂山 467000)

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不同凝集方法對畜間布魯氏菌檢測的影響

張和平，宗玉霞，王李輝

(河南省平頂山市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 平頂山 467000)

摘要：為探求適合不同檢驗(yàn)需求的布氏菌病的檢測方法，在實(shí)驗(yàn)條件完全相同的情況下，將198份布氏菌試管凝集試驗(yàn)陽性血清，同時進(jìn)行三種不同試管凝集試驗(yàn)和微量凝集試驗(yàn)。結(jié)果顯示4種檢驗(yàn)方法穩(wěn)定性均較好，建議根據(jù)環(huán)境條件和樣本數(shù)量選擇相應(yīng)的檢測方法，運(yùn)用于畜間布氏菌病監(jiān)測和診斷?？纱蠓忍岣邫z測效率。

關(guān)鍵詞：布魯氏桿菌；試管凝集試驗(yàn)；微量凝集試驗(yàn)

布魯氏桿菌病(簡稱布病)是由布魯氏桿菌屬的細(xì)菌侵入機(jī)體，引起的人獸共患的乙類傳染病[1]。布魯氏桿菌病常用的血清學(xué)方法包括平板凝集試驗(yàn)、虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、抗球蛋白試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。平頂山市畜間布病監(jiān)測過程中，初次篩選采用虎紅平板凝集試驗(yàn)，然后檢出的陽性樣品利用試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行最終定性。試管凝集試驗(yàn)以其特異性和敏感性用以布病的確診，然而由于活畜交易頻度、數(shù)量的增加和檢疫、監(jiān)測過程中樣本數(shù)量龐大，進(jìn)行大量樣本檢測時費(fèi)時、費(fèi)力等因素，需找到適合不同要求的檢測方法進(jìn)行確診。現(xiàn)對試管凝集試驗(yàn)的三種不同方法和微量法進(jìn)行了比較研究，以期尋找到適合不同檢驗(yàn)需求的快速、特異、敏感、簡易及便于推廣應(yīng)用的布病診斷方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品采集

樣品來源于平頂山五縣六區(qū)(葉縣、魯山、寶豐、舞鋼、郟縣、石龍區(qū)、新華區(qū)、衛(wèi)東區(qū)、高新區(qū)、新城區(qū)和湛河區(qū)等)監(jiān)測過程中的198份羊血清陽性樣品。

1.1.2器材與試劑

布病試管凝集試驗(yàn)抗原(哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司)；陽性血清(哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司)；陰性血清(哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司)；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1傳統(tǒng)試管凝集試驗(yàn)(SAT)

每份被檢血清準(zhǔn)備5支小試管，用吸管在第1管加入2.3mL稀釋液，第2管不加，第3管、第4管、第5管各加入稀釋液0.5mL，用1mL吸管吸取被檢血清0.2mL加入第一管中，并混勻后吸取0.5mL加入第2管中和第三管中，充分混勻第三管，從第3管中取0.5mL加入第4管，以此類推至第5管，從第5管吸取0.5mL棄去。然后，第1管不加抗原，在2管～5管中各加入20倍稀釋的試管凝集抗原0.5mL，每管反應(yīng)體積均為1mL。血清稀釋度從1管～5管為1∶12.5、1∶25、1∶50、1∶100和1∶200，同時設(shè)置陰性血清對照和陽性血清對照，配制比濁管，混勻后37℃孵育24h[2]。

1.2.2改良的試管凝集試驗(yàn)

每份被檢血清用4支試管盛裝，標(biāo)記檢驗(yàn)編號后用移液器在第1管加1.15mL稀釋液，第2～4管各加人0.5mL稀釋液。取被檢血清0.1mL加入第1管中，充分混勻后吸棄0.25mL。從第1管中吸取0.5mL加入到第2管中，混勻后再從第2管吸取0.5mL加至第3管中，倍比稀釋至第4管，從第4管棄去0.5mL，稀釋完畢。將0.5mL抗原(1∶20)加入已稀釋好的各血清試管中，并振搖均勻，同時設(shè)置陰性血清對照和陽性血清對照，配制比濁管，混勻后37℃孵育24h[3]。

1.2.3水浴法試管凝集試驗(yàn)

每份被檢血清用4支試管盛裝，標(biāo)記檢驗(yàn)編號后用移液器在第1管加1.15mL稀釋液，第2～4管各加人0.5mL稀釋液。取被檢血清0.1mL加入第1管中，充分混勻后吸棄0.25mL。從第1管中吸取0.5mL加入到第2管中，混勻均勻后再從第2管吸取0.5mL加至第3管中，如此倍比稀釋至第4管，從第4管棄去0.5mL，稀釋完畢。將0.5mL抗原(1∶20)加入已稀釋好的各血清試管中，并振搖均勻，同時設(shè)置陰性血清對照和陽性血清對照，配制比濁管，加抗原后充分混勻，52℃3～5min水浴，振蕩2～4次，1500r/min離心機(jī)中離心5min，判定結(jié)果同常規(guī)SAT法[4]。

1.2.4微量法凝集試驗(yàn)(MAT)

使用96孔一次性U型反應(yīng)板，每1列為1份樣本。A1～A12行各孔中用微量移液器加入96uL稀釋液，其余各孔加入50uL。分別加待檢血清4uL加入到A1～A12行各孔中。移液器調(diào)50uL，從A行開始，同時將12份標(biāo)本倍比稀釋到H行，棄去50uL。每孔中加入50uL稀釋好的布魯氏菌凝集抗原，輕輕震蕩混勻后，加蓋板，放入溫箱。反應(yīng)溫度和時間與SAT相同。最終稀釋度從A行到H行為1∶50～1∶6400。結(jié)果判定，在黑色背景下進(jìn)行觀察，以50%凝集的最高稀釋度作為終點(diǎn)。

2結(jié)果

表1　陽性布病血清的不同檢測方法結(jié)果比較

由表1可以看出，與常規(guī)SAT方法相比，改良SAT法提高了布魯氏菌陽性血清的檢出率。水浴法和MAT法檢出陽性血清的能力低于SAT法，符合率分別為89.64%和95.85%，利用SPSS 13.0對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)P>0.05，可見水浴法和MAT法兩種檢測方法與常規(guī)SAT法相比差異不顯著。

3討論

近年來布病疫情呈現(xiàn)回升的趨勢[5-6]，危害十分嚴(yán)重。監(jiān)測檢驗(yàn)在布病的綜合性防控措施中起著重要作用。血清學(xué)檢驗(yàn)是布魯氏桿菌病診斷的常用方法，但是隨著實(shí)驗(yàn)室的基本操作儀器的更新?lián)Q代和檢測數(shù)量的增加，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法需要進(jìn)一步改進(jìn)。

研究表明常規(guī)SAT和改良SAT法檢測的陽性符合率達(dá)到101.55%，這說明改良的SAT法的穩(wěn)定性及檢出率均較好。由于使用微量移液器代替吸管，同時改良加樣方案，可以使加液和加樣更加精確，從而減小誤差。用移液器還可以避免因血清亮較少無法進(jìn)行試驗(yàn)等問題，同時移液器可以隨時更換吸頭，可以避免洗滌、消毒和干燥等一系列繁瑣的操作，減少勞動強(qiáng)度，提高工作效率。水浴法SAT的陽性檢測值比上述兩種方法較少，但是同常規(guī)SAT法相比，其符合率達(dá)到89.64%，表明水浴法可以用于布病的檢驗(yàn)檢疫中。與上述兩種SAT法相比，水浴法可以節(jié)省很多時間，并且可以節(jié)省購買恒溫箱的開支。MAT法檢測陽性血清的能力MAT的優(yōu)點(diǎn)在于使用精密的微量移液器，在檢測樣本數(shù)量較大時可以大大提高檢測效率。

通過對198份陽性血清的檢測，表明改良SAT、水浴法SAT法和MAT法均非常穩(wěn)定，建議在畜間布病的監(jiān)測、檢驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)條件允許下使用改良SAT法代替常規(guī)SAT，以提高檢測的準(zhǔn)確率。日常監(jiān)測過程中檢測樣本數(shù)量較大時，可選擇MAT法以減少繁瑣步驟和工作量。而在時間緊急和一些基層獸醫(yī)站或野外田間操作時可以使用水浴SAT法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2013:3.

[2] GB15988-1995，布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則[S].

[3] GB/T18646-2002，動物布魯氏菌病診斷技術(shù)[S].

[4] 張雙宅,趙冬,劉維華，等.布氏菌凝集試驗(yàn)試管法和微量法的比較[J].中國地方病防治雜志,2008,23(3):174-175.

[5] 王曉晶.布病“抬頭”，農(nóng)業(yè)部迅速行動布控-對癥下藥嚴(yán)防疫情蔓延暴發(fā)[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2010(4)：10-11.

[6] 張華菊，宗玉霞，王李輝，等.平頂山市羊布病流行病學(xué)調(diào)查和防控策略[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2015(484):105-107.

收稿日期:2016-02-17修回日期：2016-05-17

作者簡介：張和平(1965-)，男，本科，高級獸醫(yī)師。

doi:10.19369/j.cnki.2095-9737.2016.07.005

中圖分類號：S855

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-9737(2016)07-0008-01