王志鵬鄧 耿（清華大學化學系，北京00084；Department of Chemistry，TexasA&M University，Texas 77840，USA）

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基于輔因子化學本質及功能的分類與討論

王志鵬1，2鄧 耿1，*
（1清華大學化學系，北京100084；2Department of Chemistry，TexasA&M University，Texas 77840，USA）

摘要：輔因子是蛋白質或酶結構的重要組成部分，在許多酶的功能中發(fā)揮重要乃至關鍵作用。在科研和教學中，現(xiàn)有的輔因子概念及其分類系統(tǒng)不夠清晰準確。本文從化學本質和功能上將輔因子分為催化型、載體型和底物型3類，并以若干典型的輔因子為例討論輔因子的特異性及再生性等問題。

關鍵詞：輔因子；輔酶；輔基；分類

1 引言

絕大多數(shù)酶都是蛋白質。在蛋白酶的化學結構中，除了氨基酸組成的多肽鏈外，還有很多非蛋白結構，包括金屬離子、有機小分子、金屬有機/無機配合物等，人們將其統(tǒng)稱為輔因子（cofactor）。這些非蛋白結構與無活性的蛋白酶前體（即原酶，apoenzyme）結合構成全酶（holoenzyme），共同完成酶的正常生理功能［1］。相關的酶促反應在生物體系中廣泛存在，尤其在合成與代謝有機分子的生物機制中發(fā)揮關鍵作用。值得注意的是，除了輔因子之外，全酶中的非蛋白結構還可能是反應底物、參與調節(jié)的信號分子、氨基酸側鏈的表達后修飾或是其他衍生化結構，但只有輔因子能直接參與酶催化反應。

輔因子概念最早在20世紀前期被提出，統(tǒng)稱除蛋白骨架外的所有非蛋白結構，因此在許多早期文獻中，變構調節(jié)的作用位點也被歸入輔因子結合位點中［2］。隨著對酶及蛋白結構研究的深入，人們逐漸認識到輔因子應當是參與酶促反應的必需組分，因此將輔因子的概念進一步嚴格化。1997年，國際純粹與應用化學聯(lián)合會給出了輔因子的推薦定義［3］，將其表述為“保持酶活性所必需的有機分子或離子”，并指出，“輔因子結合沒有功能活性的原酶，組成有活性的合酶”。2010年，F(xiàn)ischer等［4］進一步提出，輔因子不僅在功能上為活性酶分子所必需，在結構上也應結合到酶催化反應的活性中心。因此，從功能上看，輔因子的作用是“全或無”，而修飾基團的作用是“多或少”。即沒有輔因子，酶無法發(fā)揮其作用；而沒有修飾基團，只是酶或者相應蛋白的活性高低不同。從結構上看，輔因子直接參與催化反應區(qū)域（無論其作為催化劑還是底物），而其他非蛋白結構是局部修飾蛋白、以改變空間結構等方式間接改變酶促反應的催化區(qū)域。因此，某些為了穩(wěn)定蛋白結構而存在的金屬離子或者在變構作用中修飾上的磷酸基團等，都不能被視為輔因子。

輔因子的分類也經歷了一個發(fā)展歷程。傳統(tǒng)觀點認為，輔因子可以根據(jù)其與對應蛋白質結合的緊密程度分為輔酶和輔基。其中，結合緊密、不可通過透析除去者為輔基（prosthetic group）；而結合松散、可以通過透析或超濾除去者為輔酶（coenzyme）［5］?？紤]到輔酶常常是一些金屬有機配合物或者有機小分子，也有人認為輔因子是特指無機離子或者配合物，輔酶是指有機金屬化合物，輔基則是指與酶緊密結合甚至以共價鍵結合的輔酶［6］。在很多場合，人們甚至直接用“輔酶”一詞泛指非底物的非蛋白質結構。由于非蛋白化合物的結構多樣性，以上幾種分類方法都過于簡單，除了區(qū)分輔因子與蛋白結合的牢固程度外［5，7］，并不能反映輔因子作用的化學本質。隨著生物化學和生物有機化學的發(fā)展，現(xiàn)在科學界已經可以對大部分輔因子的化學本質與作用機理進行深入描述，從這一角度對輔因子的功能及其分類進行討論，將更符合其內在邏輯和學科發(fā)展趨勢［8］。例如，歐洲生物信息學中心建立了輔因子數(shù)據(jù)庫［9］，并在此基礎上對輔因子的結構和功能分類進行了系統(tǒng)研究。本文基于輔因子功能角度，提出了有益教學和研究參考的輔因子分類方法。

2 輔因子的功能及其分類概述

輔因子的結構和功能極高的多樣性與其參與酶促反應的化學本質有著密切關系。一般而言，酶的催化作用只能針對一種或者一類結構非常類似的底物進行；而為了催化一類反應常常需要特定的輔因子參與。但輔因子并不一定是特異性的，因為不同的酶可以使用同一種輔因子，例如乙醇脫氫酶使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）為輔酶，而乙醛脫氫酶同樣也使用NAD+為輔酶。事實上，輔因子不僅可以以同樣的催化機理催化不同類型的反應，還可以以不同的催化機理催化不同的反應，甚至還可以作為不同化合物的合成原料參與酶促反應。根據(jù)輔因子自身化學結構與其在酶催化循環(huán)中的作用，我們認為輔因子可以從功能上分為3類，如圖1所示。

第一類輔因子作為反應的催化劑核心，位于酶的活性中心，是酶催化機理實現(xiàn)的必要條件，是催化反應所必需的部分，因此相當于催化劑本身，我們稱之為催化型輔因子（catalysis-type cofactor）。這類輔因子實質上是彌補了氨基酸結構的局限性，在反應（催化循環(huán)）后恢復原始狀態(tài)。常見的含有金屬輔基以及一些參與催化過程的輔酶屬于此類。為保證催化中心的穩(wěn)定性，第一類輔因子通常都與蛋白酶的蛋白骨架通過共價鍵直接相連。

第二類輔因子常常作為某些被廣泛使用為電子、原子或原子團的載體，反應（催化循環(huán)）后不能直接恢復原始狀態(tài)，但可以通過原反應的逆反應或其他類似簡單反應實現(xiàn)恢復，因此相當于一個特定基團的載體，我們稱之為載體型輔因子（carrier-type cofactor）。這類輔因子的另一個重要特征是一般不與酶進行共價鍵連接，酶的每一個催化循環(huán)中使用一個分子并將其轉化為其對應產物。該對應產物可以作為其他逆過程酶的輔因子參與并轉化回原來的輔因子。

第三類輔因子作為某些特定生物活性小分子合成的原料，在反應后被消耗，不能直接通過一步逆反應恢復，需要進行復雜的代謝過程而實現(xiàn)重新合成，因此相當于酶促反應的底物，我們稱之為底物型輔因子（substrate-type cofactor）。需要說明的是，同一種輔因子可能同時屬于上述3類輔因子的一種或者多種，這是輔因子的多功能性決定的。表1中，我們總結了常見的輔因子及其主要功能和分類。

圖1 常見的輔因子分類

3 催化型輔因子——磷酸吡哆醛類［23］

磷酸吡哆醛（PLP）即維生素B6，是一類非常重要且廣泛存在的輔酶（圖2a）。其關鍵反應位點是吡啶-4-醛基，可以與酶活性位點的氨基以亞胺形式相連，在催化過程中與底物的氨基反應形成底物亞胺（圖2b），而吡啶共軛體系的作用是穩(wěn)定底物-PLP亞胺的α-碳負離子形式。因此，PLP的主要催化方式是通過與底物氨基形成亞胺，進一步活化α-H以穩(wěn)定α-碳負離子，其可以催化的反應多種多樣。PLP最直接的功能是氨基酸消旋酶（racemase）的主要輔酶，通過奪取氨基酸的α-H，使得氨基酸經過負離子中間體而消旋化（圖2c）。PLP也是大多數(shù)脫羧酶的輔酶，可穩(wěn)定氨基酸的脫羧反應中間體α-碳負離子（圖2d）。此外，通過與氨基酸α-H的交換，底物-PLP亞胺可以水解產生吡哆胺而催化生物轉氨反應（圖2e）。PLP的例子說明，同一種反應機理可以被用到不同酶的不同催化過程中。

4 載體型輔因子——輔酶NAD類［24］

輔酶NAD類包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）（圖3a），它們具有糖基化煙酰胺（維生素B3）的結構。其中，吡啶環(huán)電子中心是其主要的催化位點（圖3b）。在被H－還原后，氧化型的NAD+將轉化為還原型的NADH。從其作用機理上看，NAD+參與可逆的氧化還原反應是其最典型的反應。例如NAD+作為乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase）的輔酶，其作用機理如圖3c所示。其反應產物NADH是另外一些還原酶的輔酶，例如提供H－還原碳-碳雙鍵等等，在維生素E以及萜類化合物的合成中都有涉及。

表1 常見的輔因子及其功能分類［2，4］

表1 常見的輔因子及其功能分類［2，4］（續(xù)）

NAD+參與的第二類反應是“掩蔽的氧化還原反應”（masked redox reaction）。在這類反應中，酶通過NAD+參與的氧化-還原兩步反應，實現(xiàn)對產物的立體控制或區(qū)域選擇。例如UDP-葡萄糖-4-差向異構酶（UDP-glucose-4-epimerase）催化UDP-葡萄糖的4位羥基異構化反應時，就利用NAD+將醇氧化為酮得到前手性中心，再通過控制還原過程實現(xiàn)異構化（圖4a）。與之類似，3-脫氫奎尼酸合成酶（3-dehydroquinate synthase）催化機理的關鍵步驟是脫除磷酸基團得到烯醇負離子，但是正常情況下，用堿脫除α-H相對比較困難。如果選擇利用其相鄰碳原子上的羥基，則可以通過將羥基氧化為羰基以增強其α-H的酸性而更容易被脫除，而后續(xù)步驟保持不變（圖4b）。

圖2 PLP通過與氨基酸的氨基結合形成亞胺而實現(xiàn)催化的3類反應

NAD+參與的第三類反應與其可以形成穩(wěn)定的碳正離子有關。當NAD+中的糖環(huán)采取半縮醛式構象時，2-位上的環(huán)外O―C共價鍵可以發(fā)生異裂得到碳正離子，并通過與環(huán)內氧原子共軛形成氧鎓離子以穩(wěn)定自身。在組蛋白去乙?；福℉DAC）［25］中，NAD+解離得到的碳正離子進攻乙?；难踉?，經過多步轉化最終實現(xiàn)脫乙酰化（圖4c）。此外，如表1中提到在組氨酸降解代謝中，NAD+在尿刊酶（urocanase）催化下作為親電中心接受咪唑環(huán)親核進攻，最終導致穩(wěn)定的咪唑環(huán)系被羥基化而破壞［26］（圖4d）。由此可見，NAD+實際上催化的反應多種多樣，參與氧化酶的催化過程和間接的氧化催化都體現(xiàn)了載體型輔因子的特點；同時，它還保留了糖環(huán)衍生物的特點。

圖3 NAD+的結構與基本氧化催化機理

5 底物型輔因子——SAM類［27］

SAM的結構如圖5a所示，中心锍離子的S―C鍵可以異裂而轉移碳正離子，主要作為很多重要生物活性分子合成的甲基化試劑，或在自由基-SAM酶體系中作為自由基引發(fā)劑。SAM可以參與多類生物合成反應，如圖5所示。第一類反應是最直接的，通過轉移碳正離子實現(xiàn)甲基化（圖5a）。第二類反應是利用甲硫氨酸產生的γ-碳正離子進行的反應。例如利用羧基進攻該γ-碳正離子得到α-氨基丁內酰胺，而α-氨基丁內酰胺是進一步合成細菌群體效應信號分子（quorum sensor）的一種原料（圖5b）。再如在α-氨基環(huán)丙基羧酸（ACC）的生物合成中，SAM在ACC合成酶的催化下轉化為ACC（圖5c）。利用甲硫氨酸γ-碳正離子還可以合成一些重要的寡聚物或者高聚物。例如，SAM可以由氨基進攻γ-碳正離子形成寡聚氨基酸，而后者是合成重要的鐵螯合劑（siderophore）類化合物的原料（圖5d）。此外，SAM也可以首先在SAM脫羧酶催化下脫羧，然后再發(fā)生氨基進攻γ-碳正離子聚合形成多胺類化合物（圖5e）。SAM的第三類反應發(fā)生在核糖環(huán)系，例如在氟乙酸的生物合成過程中，第一步是氟離子進攻核糖-5-碳正離子而解離甲硫氨酸，含氟的糖環(huán)經過多步重排反應最終形成氟乙酸（圖5f）。

6 結論

本文對輔因子、輔酶、輔基等概念進行總結，基于輔因子的化學本質將其分為催化型輔因子、載體型輔因子和底物型輔因子3類；對已知的大多數(shù)輔因子都進行了歸類總結，并進一步結合若干實例探討了輔酶催化機理與催化反應多樣性等問題。隨著新的非蛋白結構的不斷發(fā)現(xiàn)，以及人們對現(xiàn)有輔因子的深入研究［28］，相信本文的分類系統(tǒng)能夠對教學及實際應用提供幫助。

感謝康奈爾大學博士生王淼參與討論和提出的建議。

圖4 以NAD+為輔酶的一些酶促過程

圖5 SAM作為反應底物參與的幾類典型反應

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中圖分類號：O6；G64

doi:10.3866/PKU.DXHX20160439www.dxhx.pku.edu.cn

*通訊作者，Email:dengg13@mails.tsinghua.edu.cn

Discussion and Classification of Cofactors Based on Their Chemical Essences and Functions

WANGA.Zhipeng1，2DENG Geng1，*
（1Department of Chemistry，Tsinghua University，Beijing 100086，P.R.China；
2Department of Chemistry，Texas A&M University，Texas 77840，USA）

Abstract:Cofactors are vital parts of proteins and enzymes，which play remarkably significant roles in the functional realization of enzyme catalyzing processes.However，in current study system of cofactors，the definition and classification are not clear enough.In this article，we suggest to divide the various cofactors into three major groups:catalysis-type cofactors，carrier-type cofactors，and substrate-type cofactors according to their chemical essences and catalytic mechanisms，followed by the discussion of several typical cofactor examples to demonstrate the specificity and regeneration of cofactors.

Key Words:Cofactor；Coenzyme；Prosthetic group；Classification