在斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部異體移植胚胎細(xì)胞的嘗試

曹靜暉，魏雅嵐，嚴(yán)繼舟

(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院生物系，上海　201306)

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在斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部異體移植胚胎細(xì)胞的嘗試

曹靜暉，魏雅嵐，嚴(yán)繼舟

(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院生物系，上海201306)

摘要：為建立斑馬魚(yú)(Danio rerio)腦部細(xì)胞移植模型，先用紅色熒光染料標(biāo)記供體胚胎細(xì)胞，再移植細(xì)胞到AB品系和兩種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部。熒光顯微鏡和組織學(xué)切片觀(guān)察發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞沿組織或細(xì)胞間隙而不是通過(guò)血管向周?chē)M織擴(kuò)散，但細(xì)胞增殖分化不明顯。在細(xì)胞移植24 h后，腦部組織學(xué)結(jié)構(gòu)與對(duì)照組無(wú)明顯差別。帶有白血病基因的胚胎細(xì)胞在A(yíng)B仔魚(yú)的腦部沒(méi)有產(chǎn)生腫瘤樣增生和轉(zhuǎn)移。相比之下，正常胚胎細(xì)胞在白血病模型的仔魚(yú)腦部非白血病細(xì)胞聚集區(qū)出現(xiàn)較多增殖和遷移。這些結(jié)果提示腦局部微環(huán)境不支持移植細(xì)胞的增殖分化；細(xì)胞移植只能彌補(bǔ)局部細(xì)胞的空疏而不能用作細(xì)胞替代治療。

關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)(Danio rerio);胚胎細(xì)胞;細(xì)胞移植;腦;白血病

神經(jīng)退行性疾病是一類(lèi)以神經(jīng)元退行性病變或凋亡,從而導(dǎo)致腦功能和腦結(jié)構(gòu)的逐步喪失，個(gè)體行為異常乃至死亡為主要特征的疾病。隨著社會(huì)逐漸步入老齡化,神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率不斷攀升，目前尚無(wú)有效的治療措施。干細(xì)胞研究的迅速發(fā)展為這類(lèi)疾病的治療提供了新的研究途徑，多種干細(xì)胞治療神經(jīng)退行性疾病動(dòng)物的嘗試尚在進(jìn)展中[1]。

干細(xì)胞是機(jī)體在發(fā)展適應(yīng)過(guò)程中保留的一部分未分化的原始細(xì)胞，具有全部或部分分化能力。在一定條件下這些干細(xì)胞可以在體外持續(xù)性增殖和分化成多種功能的細(xì)胞或組織器官。臨床上可以用自身或他人的干細(xì)胞和干細(xì)胞衍生物替代、修復(fù)病變的神經(jīng)組織,以恢復(fù)其生理功能，即干細(xì)胞移植治療，為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法難以醫(yī)治的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了十分廣闊的臨床治療前景[2]。

斑馬魚(yú)(Daniorerio)和人類(lèi)的基因在關(guān)鍵區(qū)域存在100%的同源性，大約70%的人類(lèi)基因在斑馬魚(yú)體內(nèi)都對(duì)應(yīng)著至少一個(gè)同源基因，這使其成為研究人類(lèi)疾病的重要模式生物。使用斑馬魚(yú)作為研究對(duì)象還有許多優(yōu)勢(shì)，諸如繁殖快，飼養(yǎng)成本低廉；胚胎和仔魚(yú)半透明便于生物光信號(hào)可視化，可以在高分辨率的共聚焦顯微鏡下研究細(xì)胞在組織中的擴(kuò)散[3]。更為重要的是斑馬魚(yú)與脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)存在許多共同點(diǎn)，但更適合于異體細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)。斑馬魚(yú)的免疫系統(tǒng)只在受精4～6周后才能在形態(tài)和功能上發(fā)育成熟，因此異體移植實(shí)驗(yàn)在斑馬魚(yú)發(fā)育前期進(jìn)行時(shí)，不需要免疫抑制處理[4-5]。

斑馬魚(yú)胚胎和仔魚(yú)的異種移植模型已被廣泛用于研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)[6]。多種腫瘤細(xì)胞在移植到斑馬魚(yú)胚胎和仔魚(yú)體內(nèi)時(shí)，會(huì)增殖、形成囊塊、誘導(dǎo)血管生成，并擴(kuò)散；人類(lèi)黑色素瘤細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞移植到受精后2 d斑馬魚(yú)的卵黃囊時(shí)，會(huì)增殖擴(kuò)散并形成囊塊，并且在囊塊內(nèi)部斑馬魚(yú)的血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)被誘導(dǎo)生成[7]；人類(lèi)和鼠類(lèi)的腫瘤細(xì)胞在移植到受精后48 h的斑馬魚(yú)的腸下靜脈附近時(shí)，其所表達(dá)生血管成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子會(huì)誘導(dǎo)新的微脈管系統(tǒng)的快速形成[8]；乳腺癌細(xì)胞系移植到斑馬魚(yú)胚胎后，遷移到胚胎的尾部形成囊塊[9]；人類(lèi)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在移植到斑馬魚(yú)胚胎后，能增殖生成腫瘤，且這些腫瘤能誘導(dǎo)血管新生[10]；向發(fā)育中的斑馬魚(yú)移植具有擴(kuò)散性的黑色素瘤細(xì)胞，后者會(huì)分泌一種強(qiáng)力的胚胎類(lèi)似物，導(dǎo)致胚胎體軸的發(fā)育異常[11]。斑馬魚(yú)異種移植模型也被用來(lái)代替鼠類(lèi)模型，快速高效得評(píng)估人類(lèi)多能干細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞的功能[12]。不同于上述的異種移植，本實(shí)驗(yàn)將研究斑馬魚(yú)同種異體腦部移植胚胎細(xì)胞的可行性。通過(guò)建立斑馬魚(yú)腦部異體移植胚胎細(xì)胞的模型，為人類(lèi)神經(jīng)退行性病變的治療提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)試劑和儀器

乙醇95%，無(wú)水乙醇，二甲苯(上海高信化玻儀器有限公司)；Dextran,Texas Red?,10,000 MW(D1864，Life Technologies，美國(guó))；MicroInjectorTM(Tritech Research，美國(guó))；glass capillary (WorldPrecisionInstruments，美國(guó))；Sutter P-97 Pipette Puller(WorldPrecisionInstruments，美國(guó))；M-152Manipulator (NARISHIGE，日本)；CellTram?Air (Eppendorf，德國(guó))；MIC01056倒置顯微鏡(Carl Zeiss Jena，德國(guó))。

史密斯固定液配制：重鉻酸鉀875μL、甲醛100 μL、乙酸25 μL。

1.2試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)使用的三種不同品系的斑馬魚(yú)均來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，分別為野生型斑馬魚(yú)(AB系)，血管熒光型斑馬魚(yú)(FLK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP轉(zhuǎn)基因魚(yú))和MLL-AF9-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(AF9)。

1.3方法

1.3.1供體細(xì)胞的準(zhǔn)備

選取發(fā)育至1 k細(xì)胞期的胚胎細(xì)胞作為移植供體。按先前報(bào)道的方法收集魚(yú)卵[13]，然后固定在瓊脂糖凝膠槽中。待其發(fā)育至16細(xì)胞期，使用顯微注射儀，將熒光染料葡聚糖德克薩斯紅(可被激發(fā)出紅色熒光)注射到魚(yú)卵的卵黃囊中，用于追蹤胚胎細(xì)胞系。待其發(fā)育至1 k細(xì)胞期，供細(xì)胞移植使用。

1.3.2細(xì)胞受體的準(zhǔn)備

斑馬魚(yú)仔魚(yú)作為細(xì)胞移植受體，即斑馬魚(yú)卵受精后發(fā)育至48 h(48 hpf)，接受細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)。

1.3.3細(xì)胞移植設(shè)備的準(zhǔn)備

使用拉針儀將玻璃毛細(xì)管拉斷為兩根細(xì)胞移植用針，用鑷子為針尖開(kāi)口，口徑應(yīng)大于移植細(xì)胞的直徑，將針裝配到氣壓細(xì)胞移植設(shè)備上，并固定于顯微操作設(shè)備上，調(diào)整氣壓，使針孔內(nèi)外氣壓達(dá)到平衡。

1.3.4細(xì)胞移植

在體視顯微鏡下，將受體仔魚(yú)固定在瓊脂糖凝膠槽上，使用細(xì)胞移植設(shè)備，抽取供體魚(yú)卵動(dòng)物極中的細(xì)胞，移植到受體幼魚(yú)的腦部，再在倒置顯微鏡下追蹤觀(guān)察斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部的熒光信號(hào)[14-18](圖1)。共成功進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)的斑馬魚(yú)仔魚(yú)62尾，并且存活至移植后24 h以上。

圖1　細(xì)胞移植示意圖

示供體細(xì)胞染色(a)、供體細(xì)胞吸取(b)和顯微注射三個(gè)階段(c)。

1.3.5斑馬魚(yú)仔魚(yú)石蠟切片

接受移植的斑馬魚(yú)仔魚(yú)放入1.5 mL離心管，移除多余水分，在1 mL史密斯固定液中固定12 h；實(shí)驗(yàn)仔魚(yú)固定好后，移除史密斯固定液，加入0.5 mL 30%～100%乙醇梯度脫水、二甲苯透明和包埋。包埋時(shí)，使斑馬魚(yú)仔魚(yú)側(cè)著躺平，使用石蠟切片機(jī)從斑馬魚(yú)仔魚(yú)的左側(cè)到右側(cè)連續(xù)切片切、蘇木精-伊紅(HE)染色和封片后對(duì)細(xì)胞移植部位進(jìn)行拍照[19]。

1.3.6斑馬魚(yú)仔魚(yú)細(xì)胞移植取樣時(shí)間及樣本數(shù)量的選擇

根據(jù)斑馬魚(yú)飼養(yǎng)光照晝夜時(shí)間，我們選擇在中午讓斑馬魚(yú)進(jìn)行交配產(chǎn)卵。收集供體胚胎發(fā)育至1 k細(xì)胞期進(jìn)行移植試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇在移植后1 h取樣進(jìn)行熒光或連續(xù)切片觀(guān)察細(xì)胞移植情況，以后每6 h繼續(xù)取樣觀(guān)察細(xì)胞的移植情況，連續(xù)3 d。對(duì)照和不同時(shí)間段移植的斑馬魚(yú)每組觀(guān)察至少有三尾活體樣本，中途死亡的需要補(bǔ)做移植試驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1腦部細(xì)胞移植的活體觀(guān)察

為了活體觀(guān)察腦部移植細(xì)胞與血管的關(guān)系，按圖1所示在Flk1-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)腦部移植Texas Red標(biāo)記的葡聚糖染色的胚胎細(xì)胞。在細(xì)胞移植后1 h，斑馬魚(yú)仔魚(yú)的腦部前端可以觀(guān)察到帶有紅色熒光信號(hào)的一團(tuán)移植細(xì)胞；在細(xì)胞移植后18 h，斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部前端的細(xì)胞團(tuán)已擴(kuò)散到斑馬魚(yú)的整個(gè)腦部，擴(kuò)散細(xì)胞的位置與腦部血管分布(綠色信號(hào))之間沒(méi)有明顯聯(lián)系。對(duì)照組顯示了血管在斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部的分布情況(圖2)。

圖2　接受細(xì)胞移植的FLK1斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部的熒光觀(guān)察

2.2細(xì)胞移植的組織學(xué)觀(guān)察

為了明確細(xì)胞移植后的腦部組織學(xué)變化，對(duì)上述細(xì)胞移植的斑馬魚(yú)腦組織進(jìn)行組織學(xué)切片和HE染色觀(guān)察。在細(xì)胞移植后1 h，與對(duì)照組相比，接受細(xì)胞移植的斑馬魚(yú)仔魚(yú)在腦部的腦間隙和腦室中發(fā)現(xiàn)了移植細(xì)胞，而在對(duì)照組的腦間隙和腦室中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何細(xì)胞。移植細(xì)胞與周?chē)ＤX細(xì)胞相比，正常腦細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)偏噬堿性，而移植細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)偏噬酸性。在HE染色后，正常腦部細(xì)胞偏藍(lán)，而移植細(xì)胞偏紅，且移植細(xì)胞的核質(zhì)比較大。在細(xì)胞移植6 h后，移植細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)擴(kuò)散現(xiàn)象，周?chē)ＤX部組織中開(kāi)始出現(xiàn)移植細(xì)胞，其仍保持細(xì)胞質(zhì)偏紅的特征。在細(xì)胞移植18 h后，部分接受移植的斑馬魚(yú)仔魚(yú)的腦室中還殘留著少量移植細(xì)胞，在周?chē)５哪X部組織中也能找到一些移植細(xì)胞，它們的特征并未發(fā)生明顯改變。在細(xì)胞移植后24 h后，腦室中已找不到移植細(xì)胞，在腦室周?chē)慕M織中仍能發(fā)現(xiàn)部分移植細(xì)胞，這些移植細(xì)胞仍保持著原有特征，在組織結(jié)構(gòu)上，接受細(xì)胞移植的斑馬魚(yú)仔魚(yú)和對(duì)照組中的斑馬魚(yú)仔魚(yú)已無(wú)區(qū)別(圖3)值得注意的是，整張切片沒(méi)有發(fā)現(xiàn)炎性浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)，說(shuō)明移植細(xì)胞的減少并非免疫排斥。

2.3正常仔魚(yú)移植AF9細(xì)胞的熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果

為了檢驗(yàn)癌細(xì)胞移植后的浸潤(rùn)性，將人類(lèi)白血病融合基因MLL-AF9-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的胚胎細(xì)胞染色后注射到正常AB斑馬魚(yú)(圖4)。在細(xì)胞移植后1 h，斑馬魚(yú)仔魚(yú)的腦部前端可以觀(guān)察到帶有紅色熒光信號(hào)的兩團(tuán)移植細(xì)胞；在細(xì)胞移植后18 h，斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部前端只能觀(guān)察到少量移植細(xì)胞；在細(xì)胞移植后24 h，斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部前端移植細(xì)胞的信號(hào)幾乎消失了。

2.4 AF9-GFP仔魚(yú)移植正常細(xì)胞的熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果

隨后又檢測(cè)了正常AB魚(yú)胚胎細(xì)胞移植到MLL-AF9轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)后的生長(zhǎng)情況(圖5)。對(duì)照組(0 hpt)顯示了細(xì)胞移植前MLL-AF9基因在斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部的表達(dá)位置。在細(xì)胞移植后1 h，斑馬魚(yú)仔魚(yú)的腦部前端可以觀(guān)察到帶有紅色熒光信號(hào)的一片移植細(xì)胞；在細(xì)胞移植后18 h，斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部前端能觀(guān)察到少量聚集的細(xì)胞；在細(xì)胞移植后24 h，聚集的細(xì)胞團(tuán)變大，移植細(xì)胞出現(xiàn)了少許增殖現(xiàn)象。移植細(xì)胞與MLL-AF9細(xì)胞不在同一區(qū)域。

圖4　AF9供體細(xì)胞移植到AB受體幼魚(yú)腦部的熒光觀(guān)察

hpf表示hours post fertilization，hpt表示hours post transplant，0 hpt為對(duì)照，沒(méi)有移植的正常AB仔魚(yú)。

圖5　AB供體細(xì)胞移植到AF9受體仔魚(yú)腦部的熒光觀(guān)察

3討論

本實(shí)驗(yàn)的目的是想利用斑馬魚(yú)為模型研究干細(xì)胞移植治療腦神經(jīng)細(xì)胞退化的可行性。為此首先檢驗(yàn)了干細(xì)胞移植后的致癌性，其次是移植細(xì)胞增生分化和細(xì)胞替代治療的能力。

許多報(bào)道顯示人類(lèi)腫瘤細(xì)胞移植入斑馬魚(yú)胚胎、仔魚(yú)或肝臟都表現(xiàn)出侵潤(rùn)和微轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[20]；斑馬魚(yú)胚胎移植人類(lèi)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞和其中的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后，在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的促進(jìn)下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞沿斑馬魚(yú)胚胎的血管快速擴(kuò)散，并表現(xiàn)出強(qiáng)烈的侵潤(rùn)性[21]；膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以在斑馬魚(yú)胚胎中存活、增殖并誘導(dǎo)血管分支的形成[22]。

MLL-AF9是一種白血病基因，MLL-AF9在人類(lèi)CD34+細(xì)胞中表達(dá)會(huì)引起嚴(yán)重的淋巴系白血病、髓系白血病或混合型白血病。本次實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)人類(lèi)MLL-AF9-GFP基因的斑馬魚(yú)的胚胎細(xì)胞移植到正常AB品系斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部，同時(shí)也將正常AB品系斑馬魚(yú)的胚胎細(xì)胞移植到MLL-AF9-GFP轉(zhuǎn)基因的斑馬魚(yú)仔魚(yú)的腦部，以此觀(guān)察帶有白血病基因的細(xì)胞在正常斑馬魚(yú)體內(nèi)的致病性和正常的斑馬魚(yú)細(xì)胞治療白血病基因表達(dá)細(xì)胞的可能性。細(xì)胞移植結(jié)果顯示帶有白血病的細(xì)胞在正常斑馬魚(yú)仔魚(yú)的腦部沒(méi)有增殖的跡象，移植細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，無(wú)法像癌細(xì)胞一樣形成囊塊；相反移植到MLL-AF9-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)仔魚(yú)的腦部的正常胚胎細(xì)胞表現(xiàn)出有限增殖。雖然移植細(xì)胞團(tuán)逐漸增大，但遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)基因細(xì)胞團(tuán)。這些結(jié)果不僅證實(shí)微環(huán)境對(duì)于白血病干細(xì)胞的影響較大[23]，也提示移植的胚胎細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分屬兩個(gè)不同微環(huán)境，而斑馬魚(yú)體內(nèi)微環(huán)境更適合于正常細(xì)胞移植和生成。

MLL-AF9轉(zhuǎn)基因魚(yú)細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)說(shuō)明斑馬魚(yú)有很強(qiáng)抗癌變和抗外源細(xì)胞整合的能力。許多報(bào)道也發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞和多種干細(xì)胞及少部分腫瘤細(xì)胞，移植到斑馬魚(yú)胚胎和仔魚(yú)后只能增殖和擴(kuò)散，無(wú)法形成囊塊，也很少整合到斑馬魚(yú)組織。人類(lèi)成纖維細(xì)胞移植到受精后2 d斑馬魚(yú)的卵黃囊時(shí)，會(huì)發(fā)生遷移，但不會(huì)增殖擴(kuò)散并形成囊塊[7]；人類(lèi)脂肪干細(xì)胞在移植到斑馬魚(yú)胚胎時(shí)，不僅能夠存活和增殖，而且在短時(shí)間內(nèi)保持其未分化的狀態(tài)[24]；人類(lèi)嚴(yán)重髓性白血病細(xì)胞和胚細(xì)胞移植到受精后48 h的斑馬魚(yú)體內(nèi)時(shí)，會(huì)停留在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)日，且不影響斑馬魚(yú)的發(fā)育[25]；人類(lèi)黑色素瘤細(xì)胞在移植到斑馬魚(yú)囊胚期胚胎時(shí)，存活并擴(kuò)散，但黑色素瘤細(xì)胞并沒(méi)有形成腫瘤或整合入宿主器官，而是分散在細(xì)胞間隙中，傾向于分布在正常的皮膚微環(huán)境[26]；人類(lèi)胚胎干細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞異種移植到斑馬魚(yú)胚胎后，只能形成不穩(wěn)定的管脈系統(tǒng)，不能整合入斑馬魚(yú)的血管[27]；人類(lèi)纖維細(xì)胞移植入斑馬魚(yú)胚胎后，遷移并增殖，但沒(méi)有整合入宿主的組織[28]。

不同于上面人類(lèi)細(xì)胞的異種移植實(shí)驗(yàn)，我們采用的是同種異體移植，即注射斑馬魚(yú)發(fā)育至1 k細(xì)胞期的胚胎細(xì)胞到受精后48 h的斑馬魚(yú)頭部。移植的胚胎細(xì)胞表現(xiàn)出了擴(kuò)散的現(xiàn)象，且其擴(kuò)散位置與血管分布沒(méi)有明顯關(guān)系；移植的胚胎細(xì)胞一直保持其原有特征，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的分化現(xiàn)象和致瘤性。移植后表現(xiàn)出的低增殖少分化的現(xiàn)象也可能預(yù)示移植的胚胎細(xì)胞中含有胚胎干細(xì)胞功能的數(shù)量太少。有研究指出在發(fā)育至4細(xì)胞期后，斑馬魚(yú)胚胎中只有部分細(xì)胞表達(dá)胚細(xì)胞信號(hào)[29]。但加大細(xì)胞移植量移植24 h后，其腦部結(jié)構(gòu)形態(tài)和對(duì)照組并無(wú)區(qū)別，說(shuō)明微環(huán)境不適應(yīng)應(yīng)該是決定因素。

總之，斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞注射到斑馬魚(yú)仔魚(yú)腦部后會(huì)沿著組織間隙遷移并擴(kuò)散到周?chē)哪X部組織中。雖然不能肯定移植細(xì)胞的最終去向，但推測(cè)這些胚胎細(xì)胞可能大部分凋亡，少量整合入正常的組織。我們認(rèn)為腦部細(xì)胞移植只能彌補(bǔ)少量的細(xì)胞空缺，并不能替代治療已有的細(xì)胞(包括不正常細(xì)胞)。腦細(xì)胞移植的效果取決于局部微環(huán)境改善，也就是說(shuō)，治療神經(jīng)退行性病變通過(guò)注射干細(xì)胞代謝物刺激神經(jīng)再生應(yīng)該更有前途。但斑馬魚(yú)的腦部環(huán)境畢竟與人類(lèi)不同，我們的推測(cè)有待進(jìn)一步的臨床檢驗(yàn)。

致謝：感謝上海海洋大學(xué)海洋生物系統(tǒng)和神經(jīng)研究所范純新和張慧對(duì)于本實(shí)驗(yàn)圖片拍攝方面的指導(dǎo)，感謝呂愷倫和高思琪在顯微注射和石蠟切片技術(shù)方面的指導(dǎo)。

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(責(zé)任編輯：鄧薇)

收稿日期：2015-09-28；

修訂日期：2016-04-07

第一作者簡(jiǎn)介：曹靜暉(1992-)，理學(xué)學(xué)士，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)樗飳W(xué)。E-mail:ccjjhh001@sina.com 通訊作者：嚴(yán)繼舟。Email:jyan2@shou.edu.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6907-(2016)04-0003-06

Trials on embryo cell allotransplantations in Danio rerio larval brain

CAO Jing-hui,WEI Ya-lan,YAN Ji-zhou

(DepartmentofBiology,CollegeofFisheriesandLifeSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract：To establish a brain cell transplant model,here Danio rerio embryo cells were labeled with red fluorescent dye and separately transplanted into the larval brains of AB line and two different transgenic D.rerio.Fluorescence microscopic and histological observations showed the transplanted cells were migrated along interstitial/intercellular space instead of blood vessels,revealing little proliferation and differentiation.24 hours after transplantation,the brain histological structure looked similar to the control.The transplanted embryo cells from the leukemia transgenic fish did not display any neoplasm proliferation and metastasis in AB larvae.In comparison,the transplant cells from AB lines showed a bit more proliferation and migration at the region far from leukemia cell aggregate in the brain of leukemia transgenic fish.These results suggested that the brain microenvironment was not suitable for the growth of the cell transplants,thereby cell transplant cannot replace the existing cells but fill a few cell sparsities.

Key words：Danio rerio;embryo cell;cell transplant;brain;leukemia

資助項(xiàng)目：上海海洋大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(A-0218-12-0001-003)；上海海洋大學(xué)斑馬魚(yú)再生技術(shù)啟動(dòng)基金(A-2400-12-0007)