董園園，劉秀明，姚　娜，趙利旦，李海燕

(吉林農業(yè)大學 生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長春 130118)

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紅花miR397a基因表達及對靶基因LAC2的調控作用

董園園，劉秀明，姚娜，趙利旦，李海燕

(吉林農業(yè)大學 生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長春 130118)

[摘要]【目的】 研究紅花miR397a前體基因及成熟基因在紅花不同組織中的表達水平，并對miR397a基因序列、靶基因及基因功能進行分析，為深入研究紅花抗逆機制提供參考?！痉椒ā?提取紅花籽粒、花瓣、莖、根、葉片等5個組織材料的總RNA，使用熒光定量PCR鑒定miR397a在不同組織中的表達水平；利用生物信息學方法分析紅花miR397a基因序列，用原生質體轉化方法驗證紅花miR397a調控的靶基因LAC2，并利用轉基因擬南芥表型研究miR397a基因的功能?！窘Y果】 miR397a前體基因和成熟基因均能在紅花不同組織中表達，且均以葉片組織中的表達量最高，分別是籽粒組織的2.5與1.9倍，差異達極顯著水平；miR397a序列在不同物種間高度保守，序列中僅存在 1～2個堿基的錯配或缺失；miR397a對LAC2基因有調控作用，miR397a的過表達可引起LAC2表達水平降低，紅花miR397a表達引起植物對NaCl的敏感性增加。【結論】 紅花miR397a在葉片組織中的表達量最高，基因序列保守，且紅花miR397a表達可增強植物對NaCl的敏感性。

[關鍵詞]紅花；miR397a；LAC2；轉錄后調控

microRNA(miRNA)是一類長度為18～24 nt的內源非編碼小分子RNA，來源于具有頸環(huán)結構的單鏈microRNA前體基因內部，經RNA內切酶Ⅱ加工后從前體基因上釋放并獲得成熟基因。microRNA在轉錄后水平上與靶mRNA形成RISC復合物，通過誘導mRNA的降解或抑制蛋白翻譯發(fā)揮轉錄調控功能[1]，從而參與植物的生長發(fā)育、開花時序、環(huán)境應激、組織特異性分化等生理活動[2]。miR397是一類高度保守的microRNA基因家族，在擬南芥及落葉松中均保守存在[3-4]，在水稻不同發(fā)育階段及不同組織中，miR397家族成員的基因表達水平差異明顯[5]。

漆酶(LAC)為藍銅氧化酶家族(Blue copper oxidase)成員，屬于氧化還原酶。最近在擬南芥花序研究中發(fā)現(xiàn)LAC為miR397的調控靶基因[4]。Zhang等[5]研究也發(fā)現(xiàn)，水稻miR397可通過對靶基因LAC的調控影響水稻花序數(shù)量及穗粒大小。有研究還發(fā)現(xiàn)，LAC除影響植物花序發(fā)育外，在植物中還參與干旱及鹽等逆境環(huán)境的應激調節(jié)，LAC的過表達可引起植物逆境耐受性提高[6-7]。

紅花(CarthamustinctoriusL.)又名草紅花，是中國及西亞地區(qū)廣泛種植的集經濟價值與藥用價值為一體的植物，紅花栽培品種具有適度抗逆性，在生長過程中能夠適應輕度的干旱及鹽堿等非生物脅迫[8-9]。紅花microRNA在植物生長發(fā)育、組織分化及環(huán)境適應等過程中也參與并執(zhí)行重要的調控作用，但是迄今為止，國內外尚未見與紅花microRNA逆境調控相關的報道。本研究在紅花microRNA表達譜中鑒定了miR397a基因，分析其在紅花不同組織中的表達，對其靶基因進行預測，并將miR397a過表達載體轉化擬南芥，進行NaCl脅迫研究，分析轉基因擬南芥的耐鹽性，進而為解析紅花抗逆作用機制提供參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗所用的材料品種為新疆裕民紅花(CarthamustinctoriousL.)，由中國山東菏澤潤康中醫(yī)學院提供。紅花種植在吉林農業(yè)大學人工氣候室內。培育基質用黑土、蛭石按體積比3∶7混合均勻。培養(yǎng)條件為光照16 h 室溫26 ℃、暗培養(yǎng)8 h 室溫20 ℃，相對濕度80%。收集生長期第6～8片復葉、盛花期花瓣、成熟期籽粒、根、莖5個組織樣本材料，液氮處理后儲存于―80 ℃冰箱備用。

RNA提取試劑、microRNA反轉錄試劑盒TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit、microRNA熒光定量PCR試劑TaqMan small RNA assays、熒光定量PCR試劑(mRNA)、DNA Marker及核酸內切酶、T載體，均購自大連TaKaRa公司；反轉錄試劑盒(cDNA)，購自北京百泰克公司；DNA T4連接酶，購自NEB公司；質粒提取試劑盒Plasmid Midi Kit Ⅰ，購自OMEGA公司；膠回收試劑盒DNA Gel Extraction，購自AXYGEN公司；DH5α感受態(tài)細胞、pUC-T載體，均購自北京全式金生物技術公司；W5溶液配制參見Yoo等[10]方法；P1301載體及pSPYNE(R)載體由本實驗室提供。

1.2方法

1.2.1紅花不同組織總RNA提取及表達分析將葉片、花瓣、去種皮后的籽粒、莖、根分別于液氮中充分研磨，取100 mg植物材料置于無RNA酶的 1.5 mL離心管內，參照TRIzol試劑說明書進行總RNA提取。將獲得的RNA使用DEPC水溶解后，使用NanoDrop 2000在260 nm下測定總RNA的質量濃度，并使用含有EB的1%瓊脂糖凝膠電泳估測總RNA的完整性。參照百泰克RNA反轉錄試劑盒說明進行cDNA的反轉錄，分別合成紅花葉片、籽粒、花瓣、莖、根組織的cDNA。microRNA的反轉錄參照TaKaRa公司的說明書進行。使用Real-time PCR方法分析紅花不同組織樣本中成熟miR397a及miR397a前體基因的表達水平。設定18S為內參基因[11]，進行基因表達分析。

1.2.2引物的設計與合成參照miRBase 20.0數(shù)據庫及NCBI上紅花small RNA短序列SRA數(shù)據庫(GSM618276、GSM618277、GSM618278)獲得miR397a成熟基因序列及前體基因序列。合成兩端帶有BamHⅠ及HindⅢ的miR397a前體基因序列，用于植物表達載體的構建。根據基因序列設計引物miR397aPF、miR397aPR、miR397aVF、BastaVR(表1)。其中，miR397aPF、miR397aPR用于miR397a前體基因序列的擴增及檢測，miR397aVF、BastaVR用于植物表達載體的驗證。以上引物序列使用Primer 5.0軟件設計，并委托蘇州金唯智生物公司合成。

表 1　研究涉及的引物序列Table 1　Sequences of primer used in this study

1.2.3紅花miR397a基因序列分析及靶基因預測根據NCBI中紅花SRA短序列數(shù)據庫(GSM618276、GSM618277、GSM618278)信息獲知，紅花miR397a前體基因序列長度為107 bp，成熟序列長度為21 nt。整合miRBase 20.0數(shù)據庫中現(xiàn)有的miR397a基因資源及序列信息，使用ClustalX 2軟件，分別對紅花miR397a與其他13個不同植物物種miR397a前體及成熟序列進行多序列比對分析，并利用Neighbor-Joining方法構建系統(tǒng)進化樹。利用在線預測平臺(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/?fTnction=2)根據如下規(guī)則進行紅花miR397a的靶基因預測：(1) microRNA與靶基因間的錯配不得超過3個，G-T配對默認為0.5個錯配；(2) 在microRNA與靶基因復合體中不得有超過2處發(fā)生于相鄰位點的錯配；(3) 在microRNA與靶基因復合體中，從microRNA的5′端起第2～12個位點中，連續(xù)2個相鄰位點不能發(fā)生錯配，錯配總數(shù)不能高于2.5個；(4) microRNA與靶基因復合體的最低自由能(MFE)不應小于該microRNA與其最佳互補體結合時MFE的75%[12-14]。

1.2.4紅花miR397a小分子作用載體及表達載體的構建參考Qiu等[15]和Huang等[16]人工構建microRNA前體的方法，在miR397a前體基因序列5′端設計加入保護堿基和酶切位點BamHⅠ及Hind Ⅲ，使用基因序列合成的方法獲得miR397a前體基因。通過T載體連接后測序驗證，使用BamHⅠ及HindⅢ雙酶切并膠回收小分子片段，利用DNA T4連接酶將該片段插入P1301植物表達載體內，構建了P1301-miR397a重組載體。

以合成的miR397a前體基因為模板，使用帶有XbaⅠ及SacⅠ酶切位點的基因引物miR397aPF-2及miR397aPR-2進行PCR擴增，擴增條件為95 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性5 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。基因產物連接T載體并測序正確后，通過XbaⅠ及SacⅠ雙酶切并膠回收，小分子片段通過DNA T4連接酶連到小分子表達載體pSPYNE(R)內，獲得重組pSPYNE(R)-precusor miR397a表達載體。

1.2.5紅花miR397a的原生質體轉化在細胞板中，按Yoo等[10]的方法制備紅花原生質體細胞后，每孔鋪上200 μL紅花原生質體細胞，細胞總數(shù)約 4×104個。每孔加入質量濃度為1 000 ng/μL的重組質粒pSPYNE(R)-precusor miR397a。每孔加入220 μL 體積分數(shù)4%的(PEG-4000)溶液，輕輕混勻后，室溫孵育15 min。再加入920 μL W5溶液稀釋，混勻后，150g離心90 s，去上清。使用880 μL W5溶液重新懸浮，150g離心90 s，去除殘留PEG。每孔使用100 μL W5溶液重新懸浮細胞，過夜培養(yǎng)。

1.2.6紅花miR397a的擬南芥轉化將轉化有P1301-miR397a重組載體的農桿菌4 000 r/min、20 ℃離心15 min，去掉上清液，590 nm條件下檢測懸浮液的OD值，最終OD值達到0.8～0.9即可。將適量的農桿菌懸浮液放到500 mL的燒杯中，將擬南芥的莖部和葉片基部都浸入到農桿菌懸浮液中，侵染7 min；將侵染后的營養(yǎng)缽平放，用塑料薄膜保濕過夜。侵染2周后收集全部種子。使用體積分數(shù)1%的草銨膦連續(xù)篩選T1、T2、T3代轉miR397a基因擬南芥植株，提取擬南芥葉片基因組， PCR擴增后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，進行陽性轉化苗的鑒定。分別使用含0，100，150，200 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基萌發(fā)轉基因擬南芥種子，分別統(tǒng)計7 d內轉基因株系及野生型擬南芥(對照)種子的發(fā)芽率，評估轉基因擬南芥對NaCl的耐受能力。

1.3數(shù)據處理及分析

不同組織miR397a表達水平及野生型擬南芥與轉基因擬南芥株系發(fā)芽率的差異，均采用t-test判斷是否具有統(tǒng)計學顯著性。

2結果與分析

2.1紅花miR397a在不同組織中的表達分析

miR397a(A)和miR397a前體(B)在紅花不同組織中表達的qRT-PCR分析見圖1。

圖 1　miR397a(A)和miR397a前體(B)在紅花不同組織中表達的qRT-PCR分析 *，**分別表示差異顯著(P<0.05)和差異極顯著水平(P<0.01)Fig.1　Expression of miR397a (A) and miR397a precursor (B) in different tissues of safflower * indicates significant difference (P<0.05),and ** indicates extremely significant difference (P<0.01)

由圖1可知，miR397a在葉片組織中的表達量較籽粒、花瓣、根、莖組織中高，且miR397a基因在葉片組織中的表達量是籽粒組織的2.5倍，差異表達具有極顯著性(P<0.01)(圖1-A)；miR397a前體基因在紅花不同組織中的表達分布趨勢與miR397a成熟基因一致，也是在葉片組織中表達量最高，是籽粒組織的1.9倍，差異也達顯著性水平(P<0.05)(圖1-B)。

2.2紅花miR397a基因序列的生物信息學分析

由圖2可知，紅花miR397a前體基因與擬南芥、水稻、楊樹、葡萄、大麥的miR397a前體基因親緣關系最近，歸為一類；與蘋果、油菜、芹葉擬南芥親緣關系較近；與玉米、亞麻、短柄草miR397a前體親緣關系較遠；與大豆、無油樟親緣關系最遠，最后才聚到一起。紅花miR397a成熟基因與擬南芥、芹葉擬南芥、大豆、短柄草、葡萄、油菜、水稻、楊樹miR397a的相似度達90%以上，且該基因在上述植物物種中高度保守，序列中僅存在1～2個堿基的錯配或缺失(圖3)。

圖 2不同植物物種中miR397a序列前體的系統(tǒng)進化樹

Fig.2Phylogenetic tree of miR397a precursor from different plant species

圖 3　不同植物物種中成熟miR397a序列的比對 * 一致性序列Fig.3　Sequence alignment of miR397a sequences from different plant species * Consensus sequence

2.3紅花miR397a的靶基因預測

用紅花miR397a序列及SRA數(shù)據庫內的紅花轉錄組數(shù)據(SRX101827)，進行microRNA對應調控的靶基因信息預測，結果共預測到7個靶基因(表2和表3)，其中靶基因unigene88135的基因功能注釋為漆酶基因LAC2。

表 2　紅花miR397a的靶基因預測Table 2　Target prediction of miR397a

表 3　紅花miR397a對靶基因的調控預測Table 3　Prediction of target regulation by miR397a

2.4紅花miR397a對靶基因的轉錄后調控

為研究miR397a對靶基因的調控作用，將帶有miR397a前體基因的表達載體P35S-precursor通過PEG-4000介導，轉化紅花原生質體細胞，檢測細胞內miR397a基因及紅花葉片原生質體中unigene88135基因的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)在轉化miR397a前體表達載體的原生質體內，miR397a表達水平顯著升高，t檢驗顯示該差異具有統(tǒng)計意義(P=0.03)。同時檢測unigene88135的表達水平發(fā)現(xiàn)，在轉化miR397a前體表達載體后，unigene88135的表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計意義(P=0.02)(圖4)，說明miR397a在轉錄過程中對unigene88135具有轉錄后抑制的調控作用。

圖 4　紅花miR397a的表達(A)及對靶基因的調控(B)分析Fig.4　Expression of miR397a (A) and target gene regulation (B)

2.5轉miR397a基因擬南芥的鑒定

對重組載體P1301-miR397a進行BamHⅠ及Hind Ⅲ雙酶切鑒定，結果(圖5-A)顯示，酶切產物的核酸片段長度大小為107 bp，與預期結果大小一致，表明重組表達載體構建成功。將含有重組質粒P1301-miR397a的農桿菌轉化模式植物擬南芥，利用Bar基因篩選標記及基因組PCR鑒定方法，經過T1、T2代擬南芥篩選鑒定，獲得遺傳穩(wěn)定的T3代轉基因擬南芥，并以T3代擬南芥基因組為模板，獲得了含miR397a基因的核酸擴增產物，片段大小為763 bp(圖5-B)，與預期設計相符，顯示已經成功獲得轉miR397a基因的擬南芥。

圖 5轉miR397a基因擬南芥的鑒定

A．重組質粒經BamHⅠ及Hind Ⅲ酶切后產物；M.DNA DL 2000 Marker;1.質粒；2.酶切產物;

B.轉miR397a的T3代擬南芥基因組；M.DNA DL 2000 Marker;N.陰性對照;P.陽性對照,1～5.不同轉基因植株的基因擴增產物

Fig.5PCR results of T3 transgenicArabidopsis

A.Products of recombinant plasmid digested byBamHⅠ andHind Ⅲ;M.DNA DL 2000 Marker;1.Plasmid;2.Restriction enzyme digestion product；B.PCR validation of transgenicArabidopsis;M.DNA DL 2000 Marker;N.Negative control;P.Positive control,1-5.PCR products of transgenicArabidopsis

2.6紅花miR397a的功能分析

通過轉miR397a擬南芥種子的萌發(fā)試驗，判斷過表達miR397a擬南芥的發(fā)芽率。由T3代轉基因擬南芥幼苗在NaCl脅迫下的發(fā)芽率可知，萌發(fā)試驗7 d后，野生型擬南芥及轉miR397a基因擬南芥在無NaCl條件下發(fā)芽率接近，二者間無顯著差異(圖6-A)。100及150 mmol/L NaCl濃度下，轉基因擬南芥發(fā)芽率與野生型擬南芥(對照)相比發(fā)芽率呈降低趨勢，但差異未達顯著性水平(圖6-B，6-C)。200 mmol/L NaCl濃度下，野生型擬南芥發(fā)芽率平均為69.5%，轉基因株系L1、L2發(fā)芽率平均為59%及56%，差異達顯著水平(P<0.05)(圖6-D)。上述結果表明，miR397a過表達可增強擬南芥種子在萌發(fā)過程中的NaCl敏感性。

3討論

紅花作為古老的中藥植物及油料作物，喜溫耐旱，花瓣中蘊含豐富的羥基黃色素A、羥基黃色素B和蘆丁醇等黃酮類活性成分，具有活血化瘀、抑制血小板凝集、消炎等藥用價值[17-19]。植物microRNA研究有利于在轉錄后水平深入挖掘基因表達調控及抗逆分子機制，但紅花microRNA的已知信息資源目前并不豐富，miRBase數(shù)據庫尚未收錄紅花相關信息，且紅花microRNA的鑒定與功能研究才剛剛展開。

圖 6　不同NaCl質量濃度下轉miR397a擬南芥的發(fā)芽率統(tǒng)計Fig.6　Germination rates of Arabidopsis under NaCl

本研究通過SRA數(shù)據庫注釋的miR397a基因信息，利用熒光定量PCR方法鑒定了紅花不同組織中miR397a的表達水平，發(fā)現(xiàn)相較于花瓣、根、籽粒、莖等組織，miR397a在葉片組織中高表達，說明該基因表達可能與葉片組織的特異功能調控有關。對該基因的序列分析表明，紅花miR397a與擬南芥、芹葉擬南芥、大豆、短柄草、葡萄、油菜、水稻、楊樹的miR397a相似度達90%，同源性最高，為高度保守的基因序列。而miR397a前體與其他物種也具有高度同源性，相似度均在57%以上，表明該基因在進化歷程中高度保守，這與Ninova等[20]關于“microRNA在進化中高度保守”的研究結論一致。

microRNA作為一類非編碼小RNA，廣泛參與了真核生物的細胞分裂、組織發(fā)育、逆境響應、信號轉導等過程[21]，microRNA功能的行使往往通過對靶基因的降解或抑制蛋白翻譯實現(xiàn)[22]。Jung等[23]報道，miR172通過調控靶基因TOE3實現(xiàn)對擬南芥花序發(fā)育的調控。Vazquez等[21]報道，miR163可通過調節(jié)SMAT基因表達來影響擬南芥對外界病原體的防御作用。在擬南芥和水稻上的研究表明，LAC為miR397的靶向調控基因[23]。Lu等[24]在楊樹miR397a基因鑒定及靶基因研究中發(fā)現(xiàn)，ptr-miR397a過表達可調控漆酶基因表達水平下降，甚至使漆酶蛋白活性下降40%，使楊樹木質素含量發(fā)生改變。紅花miR397a的靶基因預測使用了紅花轉錄組數(shù)據，預測miR397a可能調控的7個靶基因，揭示microRNA對靶基因的調控存在多個對應關系。漆酶LAC2基因為miR397a的候選靶基因之一，在植物中與氧化還原反應及鹽調控有關[6-7]，推斷miR397a可能參與紅花的氧化還原反應過程，還可能參與紅花的耐鹽脅迫過程。本研究結果證實，紅花miR397a過表達導致LAC2基因表達水平降低；通過轉miR397a擬南芥株系的表型發(fā)現(xiàn)，轉基因擬南芥對NaCl的敏感性提高，表現(xiàn)為NaCl耐受性降低，明確紅花miR397a參與鹽脅迫耐受過程的調控。

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DOI：網絡出版時間:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.025

[收稿日期]2014-12-10

[基金項目]國家高新技術研究發(fā)展計劃(863)項目“油體生物反應器研制及產品開發(fā)”(2011AA100606)；國家自然科學基金項目“干旱條件下Gma-miR169對大豆蒸騰作用的調控機制研究”(31101091)

[作者簡介]董園園(1985-)，女，吉林長春人，講師，博士，主要從事分子生物學研究。E-mail：yydong@aliyun.com [通信作者]李海燕(1972-)，女，吉林舒蘭人，教授，博士生導師，主要從事植物基因工程研究。E-mail：hyli99@163.com

[中圖分類號]Q789

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)07-0173-08

Expression of safflower miR397a gene and its role inLAC2 regulation

DONG Yuanyuan,LIU Xiuming,YAO Na,ZHAO Lidan,LI Haiyan

(MinistryofEducationEngineeringResearchCenterofBioreactorandPharmaceuticalDevelopment,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

Abstract:【Objective】 This study analyzed the expression levels of precursor of miR397a and mature miR397a gene in different safflower tissues,identified the sequence of miR397a, predicted its target genes and explored its function.【Method】 Total RNA was extracted from 5 issues including seed,petal,leaf,stem and root of safflower and qRT-PCR was employed to analyze the gene expression levels.Sequence analysis and target genes prediction were conducted by bioinformatics methods.Protoplast transformation method was employed to validate target gene regulated by safflower miR397a.At last,transgenic Arabidopsis was used to discuss function of miR397a gene.【Result】 The expressions of miR397a precursor and mature miR397a were higher in safflower leaf than in other tissues.Their expressions in leaf were 2.5 and 1.9 times higher than in seed with extremely significant difference.The miR397a was highly conservative in different plants with only one or two bases mismatching or missing.Gene miR397a played role in LAC2 regulation.Over expression of miR397a could decrease LAC2 expression level and miR397a expression could increase plant sensibility to NaCl.【Conclusion】 Conserved miR397a expresses the highest in leaf,and it could increase plant sensibility to NaCl.

Key words:Carthamus tinctorius L.;miR397a;LAC2;post-transcriptional regulation

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