李　燕,周宙霖,盧　濤,李瑞欣

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利用HaCaT細(xì)胞構(gòu)建新型組織工程皮膚檢測(cè)模型

李燕1,2,周宙霖1,3,盧濤1,李瑞欣4

1.300162天津,武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院； 2.063000唐山,華北理工大學(xué)；3.510800廣州,武警8730部隊(duì)醫(yī)院；4.300161天津,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所

【摘要】目的構(gòu)建以人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT為種子細(xì)胞的組織工程皮膚模型。方法以絲素蛋白修飾聚酯聚酰胺無(wú)紡布為支架，以人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞，構(gòu)建檢測(cè)用的新型組織工程皮膚模型。選取10 種化學(xué)品作為檢測(cè)物質(zhì)，局部接觸皮膚模型表面15 min，應(yīng)用MTT 比色法測(cè)定細(xì)胞相對(duì)活力。結(jié)果3個(gè)不同批次的模型中，根據(jù)相對(duì)細(xì)胞活力值作為判定，構(gòu)建的新型檢測(cè)模型能夠判斷出8種化學(xué)品的刺激性，加入IL-1α試驗(yàn)后提高了模型的準(zhǔn)確性，準(zhǔn)確率達(dá)到75%。結(jié)論這個(gè)新的體外模型提供了有效的試驗(yàn)結(jié)果并證明了模型的可行性。同時(shí)它應(yīng)該使用更多數(shù)量的物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，并測(cè)試在不同的實(shí)驗(yàn)室以適當(dāng)評(píng)估重現(xiàn)性。

【關(guān)鍵詞】HaCaT細(xì)胞；組織工程皮膚；絲素蛋白；刺激性；化學(xué)品

皮膚刺激被定義為試驗(yàn)物質(zhì)作用于皮膚長(zhǎng)達(dá)4 h的可逆性損害，一般無(wú)免疫系統(tǒng)的參與?；瘜W(xué)品的潛在危害引起的急性皮膚刺激作為評(píng)估其基本毒理學(xué)方案的一部分[1]。在以往的研究中，對(duì)化學(xué)品潛在危害的評(píng)價(jià)進(jìn)行了皮膚刺激試驗(yàn)，其中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)最為多見(jiàn)，而對(duì)兔Draize皮膚刺激試驗(yàn)應(yīng)用最廣。盡管此法使研究者普遍接受，但是兔和人類(lèi)的刺激性之間的相關(guān)性還一直受到質(zhì)疑，主要差異是兔的皮膚反應(yīng)對(duì)于測(cè)試物有較高易感性，這可能是由于在人類(lèi)和兔之間皮膚結(jié)構(gòu)的差異[2]。因此，歐洲中心替代方法驗(yàn)證(ECVAM)科學(xué)咨詢委員會(huì)，成立了以確保替代方法符合科學(xué)的監(jiān)管部門(mén)。一些替代實(shí)驗(yàn)的開(kāi)發(fā)，來(lái)確定化學(xué)物質(zhì)對(duì)皮膚的刺激潛力，其中EpiSkin、EpiDerm和SkinEthic體外皮膚模型已經(jīng)成功替代兔子的Draize試驗(yàn)[3]。隨著2013-03歐盟全面禁止銷(xiāo)售用動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)檢測(cè)的化妝品，我國(guó)也開(kāi)始進(jìn)行體外模型的研究[4,5]。本實(shí)驗(yàn)嘗試構(gòu)建了一種新的組織工程皮膚模型作為檢測(cè)化學(xué)品刺激性的工具。

1材料與方法

1.1材料DMEM低糖培養(yǎng)液、DMEM 高糖培養(yǎng)液(Hyclone公司)、胰酶采用美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清、蠶絲、十二烷基硫酸鈉(Sigma公司) 、氫氧化鉀(TCI公司) 、D-檸檬烯(TCI公司) 、庚醛(TCI公司) 、1-溴己烷(TCI公司) 、3，3-二硫代二丙酸(TCI公司) 、3-氯硝基苯(TCI公司) 、4-甲硫基苯甲醛(TCI公司) 、1-溴-4-氯丁烷(TCI公司)、苯氧乙酸烯丙酯(TCI公司) 、異丙醇(TCI公司) 。以上化學(xué)物質(zhì)根據(jù)歐洲中心替代方法驗(yàn)證 (European centre for the validation of alternative methods，ECVAM) 評(píng)價(jià)，從Episkin檢測(cè)性能的化學(xué)品中選取的10種[6], 均為化學(xué)純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)取人永生化角質(zhì)細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞( 天津長(zhǎng)征醫(yī)院研究所惠贈(zèng)) 用含血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，成纖維細(xì)胞用含血清的DMEM低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，放于37 ℃、5% CO2孵箱，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)貼壁生長(zhǎng)，胰酶消化傳代。取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞備用。

1.2.2組織工程皮膚模型的制備(1)從蠶絲中提取絲素蛋白[7-9]，來(lái)修飾聚酯聚酰胺無(wú)紡布，將其作為皮膚模型的生物支架，干燥、高溫滅菌后備用。(2)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以1×106個(gè)/ml接種于上述構(gòu)建完成的支架上，在24孔板中于37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)孵育3 d，然后在空氣-液體界面培養(yǎng)13 d，從而培養(yǎng)成組織皮膚模型。

1.2.3測(cè)試化學(xué)品根據(jù)ECVAM標(biāo)準(zhǔn)中的試驗(yàn)化學(xué)品選取10種化學(xué)品(5種非刺激性試劑，5種刺激性試劑)，參照Episkin模型的檢測(cè)方法進(jìn)行試驗(yàn)[6]：(1)液體或粘性化學(xué)(25 μl)溶液，然后施加到組織工程皮膚模型的表面上。固體的化學(xué)品(25 mg)加25 μl的蒸餾水或者用微抹刀小心施加并輕輕涂抹在皮膚模型表面，每種化學(xué)品涂布在一式三份的組織。(2)此外，3個(gè)陰性對(duì)照組加入25 μl的蒸餾水，在皮膚模型上加5%的十二烷基硫酸鈉作為陽(yáng)性對(duì)照。(3)接觸15 min后，小心地用PBS沖洗皮膚模型表面的試驗(yàn)化學(xué)品10次(盡可能除去剩余化學(xué)物質(zhì))。(4)將模型轉(zhuǎn)移至新的24孔板內(nèi)并每孔加入新鮮培養(yǎng)液1 ml，放入37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育42 h。(5)吸去培養(yǎng)液，加入0.5 ml的新配制的MTT溶液(1 mg/ml)，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)3 h。(6)PBS沖洗模型后，放入裝有0.3 ml異丙醇的玻璃管內(nèi)震蕩混勻，在室溫下靜置18 h。(7)每管200 μl萃取液移至96孔板中，以異丙醇作為空白對(duì)照，在570 nm的吸光度下測(cè)量OD值。(8)收集刺激試驗(yàn)后孵育42 h的條件培養(yǎng)液，檢測(cè)它所釋放的IL-1α的濃度，利用ELISA kit(北京四正柏)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1組織工程皮膚模型的形態(tài)學(xué)觀察構(gòu)建的組織工程皮膚經(jīng)歷13 d的氣-液面培養(yǎng)后，HE染色如圖1，結(jié)果顯示組織工程皮膚模型分層較多，細(xì)胞數(shù)量密集，能夠形成大約15個(gè)細(xì)胞層次的表皮結(jié)構(gòu)，與正常皮膚的細(xì)胞層次非常接近。

圖1　組織工程皮膚模型(HE，×400)

2.2化學(xué)品檢測(cè)根據(jù)歐盟分類(lèi)方案，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了10種化學(xué)品的刺激試驗(yàn)，其中5種刺激物和5種非刺激物，每一種化學(xué)品分為3組，其中包括陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照(表1)，以平均細(xì)胞相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)作為評(píng)判化學(xué)品刺激性的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)Episkin檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)用于檢測(cè)驗(yàn)收的必須具備以下條件，陰性對(duì)照組的OD57O值必須為0.6～0.9，陽(yáng)性對(duì)照(50%SDS)的細(xì)胞活力百分比為0%～20%，而化學(xué)品刺激性潛能的預(yù)測(cè)是基于相同的預(yù)測(cè)模型的細(xì)胞相對(duì)活力的結(jié)果：如果細(xì)胞相對(duì)活力<50%時(shí)，化學(xué)品被判斷為刺激物，標(biāo)記為I，細(xì)胞相對(duì)活力>50%時(shí)，化學(xué)品分類(lèi)為非刺激物，標(biāo)記為NI。IL-1α≥60 pg時(shí)，化學(xué)品判斷為刺激性，標(biāo)記為I，IL-1α<60 pg時(shí)，化學(xué)品判斷為非刺激性，標(biāo)記為NI。在10種化學(xué)物質(zhì)中，十二烷基硫酸鈉、氫氧化鉀、D-檸檬烯、庚醛、1-溴己烷為刺激物(I)，3，3-二硫代二丙酸、3-氯硝基苯、4-甲硫基苯甲醛、1-溴-4-氯丁烷、苯氧乙酸烯丙酯為非刺激物(NI)。每個(gè)測(cè)試物進(jìn)行三組不同批次的獨(dú)立操作，其中D-檸檬烯，4-甲硫基苯甲醛與實(shí)際結(jié)果不同。刺激物D-檸檬烯錯(cuò)誤判斷為非刺激性的，而非刺激物4-甲硫基苯甲醛判斷為刺激性的。而IL-1α作為皮膚受到刺激產(chǎn)生炎性反應(yīng)后所釋放的關(guān)鍵細(xì)胞因子。為了對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估，對(duì)條件培養(yǎng)液進(jìn)行了IL-1α的釋放檢測(cè)。在試驗(yàn)結(jié)果，1-溴己烷被判斷為非刺激性，4-甲硫基苯甲醛被判斷為非刺激性，其他化學(xué)品的檢測(cè)與MTT分析結(jié)果一致,總體準(zhǔn)確度為75%。

表1　皮膚刺激性測(cè)試細(xì)胞活力判斷　±s)

注：I=irritant(刺激性), NI=non-irritant(非刺激性)

3討論

皮膚刺激試驗(yàn)早期多進(jìn)行人4 h斑貼試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，由于其違反倫理學(xué)等原因現(xiàn)已經(jīng)很少使用。體外模型的制備無(wú)疑成了研究的重點(diǎn)。根據(jù)ECVAM性能標(biāo)準(zhǔn)[10，11]，皮膚模型必須有一個(gè)合適的屏障功能，以用于皮膚刺激試驗(yàn)，也就是說(shuō)，它的角質(zhì)層和脂質(zhì)組合物應(yīng)足以抵抗的細(xì)胞毒性標(biāo)志物的化學(xué)品如SLS或Triton X-100的迅速滲透。本實(shí)驗(yàn)選用IC50的測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)屏障功能。

為了成功構(gòu)建組織工程皮膚模型，支架和種子細(xì)胞的來(lái)源成了重要研究?jī)?nèi)容。本實(shí)驗(yàn)的絲素蛋白作為支架組成，其具有良好的生物相容性和吸附作用，能使在體外培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)良好并且維持其特定的功能。根據(jù)絲素蛋白可控的降解性定制一定的年限，從而不僅保證了細(xì)胞的生長(zhǎng)空間同時(shí)也使材料的耗損降到最低[7-9，12，13]。HaCaT細(xì)胞株來(lái)自人的正常皮膚，經(jīng)過(guò)人乳頭瘤病毒轉(zhuǎn)染形成的永生化角質(zhì)形成細(xì)胞[14]。近年來(lái)，HaCaT細(xì)胞常用于為化學(xué)品毒性和光毒性的檢測(cè)[15，16]，從中可以看出與原代細(xì)胞相比，不受來(lái)源和批次的影響。

本實(shí)驗(yàn)在檢測(cè)模型時(shí)選用了ECVAM性能標(biāo)準(zhǔn)中的MTT和細(xì)胞炎性反應(yīng)因子進(jìn)行測(cè)定，以細(xì)胞活力值為標(biāo)準(zhǔn)。MTT結(jié)果表明，十二烷基硫酸鈉、氫氧化鉀、庚醛、1-溴己烷、3，3-二硫代二丙酸、3-氯硝基苯、1-溴-4-氯丁烷、苯氧乙酸烯丙酯與歐盟實(shí)際分類(lèi)一致，而D-檸檬烯、4-甲硫基苯甲醛得到了錯(cuò)誤地判斷，刺激性的D-檸檬烯判斷為非刺激性的，非刺激性的4-甲硫基苯甲醛判斷為刺激性的。而結(jié)合IL-1α試驗(yàn)提高模型的準(zhǔn)確度，其中4-甲硫基苯甲醛在MTT分析出現(xiàn)錯(cuò)誤的判斷，但MTT和IL-1α試驗(yàn)中的4-甲硫基苯甲醛得到了正確的判斷，從而準(zhǔn)確率達(dá)到了75%。

與Episkin皮膚模型的評(píng)價(jià)結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)的組織工程模型敏感性較低，準(zhǔn)確性也與其有一定的差距?？赡芘c本實(shí)驗(yàn)測(cè)試的化學(xué)品種類(lèi)較少且不同組之間的檢測(cè)結(jié)果也有較大的差異有關(guān)，下一步還將對(duì)本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的模型進(jìn)行改進(jìn)。同時(shí)還將開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室內(nèi)評(píng)價(jià)、實(shí)驗(yàn)室間評(píng)價(jià)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)、實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)四個(gè)階段的研究, 來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證該組織工程皮膚用于化學(xué)品刺激性檢測(cè)的可靠性。

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(2015-11-22收稿2016-02-29修回)

(責(zé)任編輯郭青)

基金項(xiàng)目：天津市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(14JCYBJC29200)

作者簡(jiǎn)介：李燕，碩士研究生。 通訊作者：盧濤，E-mail:48144051@qq.com；李瑞欣，E-mail:liruixinxin@163.com

【中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)】R758.29

Construction of a new tissue engineering skin detection model using HaCaT cells

LI Yan1,2, ZHOU Zhoulin1,3, LU Tao1,and LI Ruixin4.

1.Department of Dermatology, The Armed Police Hospital of Tianjin, Tianjin 300162, China; 2.North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China;3.Hospital of Chinese People’s Armed Police Force 8730 Army, Guangzhou 510800, China;4.Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300161, China

【Abstract】ObjectiveTo construct human immortalized keratinocytes HaCaT as seed cells for tissue engineering skin model.MethodsA novel tissue engineered skin model was constructed for the detection of human immortalized keratinocytes and fibroblasts as seed cells. 10 kinds of chemicals were selected as test materials, the surface of local contact skin model was 15 min, and the relative viability of cells was measured by MTT colorimetry.ResultsThree different batches of the model, based on the relative values of cell viability as a decision, the new detection model constructed could determine eight kinds of harsh chemicals,after addition of IL-1α experiment improved the accuracy of the model, the accuracy rate was 75%.ConclusionsThis new model provides an effective in vitro test results and prove the feasibility of the model. At the same time it should use a greater number of substances for further validation and tests in different lab oratories to properly assess reproducibility.

【Key words】HaCaT cells; tissue-engineered skin; fibroin; irritant; chemicals