張順聰 郭丹青 李永賢 唐永超 楊志東 梁德* 李大星 莫國業(yè) 馮蓬勃

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨科，廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510400

目前治療骨質(zhì)疏松的藥物主要作用為抑制骨吸收，但同時也會影響骨形成，甚至可能導(dǎo)致骨腫瘤[1]。因此為了減少骨量丟失，需要一種能夠誘導(dǎo)成骨細胞生成的治療方式。目前臨床運用的有甲狀旁腺素或新型的代謝藥物如鈣敏受體拮抗劑、Wnt通路抑制劑[2-3]，另外異黃酮是一種有前景的防治骨質(zhì)疏松藥物。淫羊藿苷是一種從中藥淫羊藿中分離出的活性黃酮糖苷，臨床常將淫羊藿用于治療腎、關(guān)節(jié)及肝臟等疾病。實驗表明淫羊藿苷可促進大鼠成骨骨髓間充質(zhì)細胞像向成骨細胞分化，并促進成骨細胞的成熟和礦化和抑制破骨細胞生成[4]。傳遞成骨細胞和破骨細胞相互作用的一個重要信號通道為骨保護素(Osteoproteyerin， OPG) /核因子NF-κB 受體激活因子配體(ReceptorActivator of NF-κB Li gand, RANKL)/核因子NF-κB受體激活因子(ReceptorActivator of NF-κB, RANK)，淫羊藿苷對人成骨樣細胞(MG-63)成骨分化，以及是否通過作用于OPG/RANKL影響成骨分化尚不明確。

1 材料和方法

1.1 細胞株

人骨肉瘤成骨樣細胞系(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC編號號GDC074)。

1.2 藥物

淫羊藿苷試劑(含量98%，上海純優(yōu)生物科技有限公司)，用DMEM培養(yǎng)基稀釋并分別配制成1 nmol/ml，10 nmol/L，100 nmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L，過濾分裝后備用。

1.3 試劑及儀器

無酚紅DMEM培養(yǎng)液；0.25%胰酶-EDTA;抗壞血酸，焦碳酸二乙酯(DEPC);TRIzol和胎牛血清(FBS,美國Gibico公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司)；引物(合成于life technology公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；OPG(Santa Cruz生物工程公司)、RANKL(Cell singnaling)、GAPDH抗體(Cell singnaling)；辣根過氫化物酶標(biāo)記的抗兔二抗(Cell singnaling)。細胞培養(yǎng)箱(SHELLAB公司)；超凈臺(美國Forma Scientific公司)，高速低溫離心機(Eppendorf公司5804R)；全波長多功能酶標(biāo)儀(上海公司MK3)；凝膠影像分析儀(美國Bio-Rad公司Gel Doc XR+)，梯度PCR儀(美國BIO-RAD公司T100)；實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司CFX96 Touch)；生物顯微鏡(德國Leica公司DM1000)；電子天平(賽多利斯公司BSA-623S-CW)；細胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板(美國Corning Costar公司)；10%FBS的1640培養(yǎng)基(美國gibco公司)；成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)公司)。

1.4 細胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)實驗

MG-63細胞培養(yǎng)(培養(yǎng)基、傳代、凍存和復(fù)蘇)按常規(guī)方法。MG-63細胞分別接種于6孔塑料培養(yǎng)板，隔兩天用PBS液進行細胞換液，細胞即將鋪滿培養(yǎng)板時進行細胞傳代，細胞傳第5代時用1 nmol/L，10 nmol/L,100 nmol/L,1 μmol/L,10 μmol/L淫羊藿苷各2ml進行干預(yù)，陰性對照組加入2 ml培養(yǎng)基，再各加入2 ml成骨誘導(dǎo)劑進行成骨誘導(dǎo)分化。

1.5 RT-PCR檢測

干預(yù)后3、6天提取細胞RNA進行檢測，用TRIZOL法提取細胞總RNA，配制10 μl的反應(yīng)體系在梯度PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄。PCR法檢測第3天MYC、CDK7細胞增殖相關(guān)基因的表達，第6天檢測RUNX2、COL1A1、OPG、RANKL的表達，同時以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 引物設(shè)計Table 1 The design of primers

PCR條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94℃ 45 s，退火60 ℃ 45 s，延伸72℃ 1 min，共40個循環(huán)，于72 ℃延伸10 min。

1.6 蛋白表達檢測

干預(yù)6天后進行細胞總蛋白提取，采用Western blot檢測OPG、RANKL、RUNX2、COL1A1蛋白質(zhì)表達。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

不同濃度淫羊藿苷干預(yù)后OPG、RANKL、RUNX2、COL1A1、CDK7、MYC mRNA表達結(jié)果見圖1，蛋白表達量見圖2。對成骨分化相關(guān)基因，10 nmol、1 μmol干預(yù)的MG-63 RUNX2基因表達量較1 nmol及10 μmol的高(P<0.05)，與100 nmol及空白對照組沒有明顯差別(P>0.05)，10 μmol的RUNX2加而升高，10 μmol的表達量較其余各組有明顯升高(P<0.05)，其蛋白表達也更多；RANKL的基因表達量極低，且在各組之間均無明顯差異(P>0.05)，但100 nmol時趨于更多，10 nmol時趨于更少，而RANKL的蛋白表達無條帶；OPG的表達在1 μmol濃度時較100 nmol、10 μmol明顯增高(P<0.05)，與1 nmol、10 nmol及空白組沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但1 μmol濃度時OPG表達量有增多趨勢；與細胞增殖相關(guān)的MYC的表達各組之間均沒有差異(P>0.05)，而CDK7的表達均較空白組降低(P<0.05)。

圖1 不同濃度淫羊藿苷干預(yù)后各基因表達量注：*與對照組相比P<0.05；#與10μmol/L組相比P<0.05；**與1μmol/L組相比P<0.05Fig.1 The mRNA expression ofRUNX2,COL1A1,OPG and RANKL in MG-63 cells were determined by real-time PCR after treatment with different concentrations of Icariin for 6 days, and CDK7 and MYC for 3days.*Compared with the control group,P<0.05;# Compared with the treatment at 10 μmol/L, P<0.05;**Compared with the treatment at 1 μmol/L, P<0.05.

圖2 不同濃度淫羊藿苷干預(yù)后各蛋白表達量Fig.2 The protein expression ofRUNX2,COL1A1,OPG and RANKL in MG-63 cells were determined by wetern-blot after treatment with different concentrations of Icariin for 6 days.

3 討論

近幾年多項實驗已經(jīng)表明淫羊藿苷在促進細胞成骨分化中具有重要作用[5-7]，Luo等人[5]研究發(fā)現(xiàn)10-5mol/L的淫羊藿苷能恢復(fù)體外老年去卵巢大鼠因雌激素減少和老齡所致的骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨分化減少的能力，主要是通過影響雌激素信號通路；Ma等人[6]發(fā)現(xiàn)10-5mol/L的淫羊藿苷比10-8mol/L的地塞米松更能明顯促進大鼠成骨細胞的堿性磷酸酶活性和鈣鹽沉積；Song[7]進行實驗發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可誘導(dǎo)MC3T3-E1細胞ERK和JNK的生成，而抑制MAPK信號通路可減少淫羊藿的促成骨效應(yīng)，同時也抑制ERK和JNK的表達，說明其作用可能與MAPK信號通路相關(guān)。但大多數(shù)文獻還是以動物細胞為研究對象，本研究針對人成骨樣細胞MG-63受淫羊藿苷影響的表現(xiàn)特點，可能更接近人的成骨分化特征。

RUNX2和COL1A1是成骨分化的兩個主要標(biāo)志基因之一，10 μmol的淫羊藿苷能促進COL1A1基因和蛋白的表達，而RUNX2的mRNA表達在10 μmol最低，而蛋白含量在10 μmol最高，這與其它研究動物細胞的結(jié)果[6]不完全一致，這可能是淫羊藿苷作用于MG-63細胞的RUNX2的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。CDK7與MYC均是細胞增殖中的重要標(biāo)志基因，尤其是CDK7，與對照組相比，淫羊藿苷明顯抑制CDK7的表達，說明淫羊藿苷減少MG-63的細胞增殖，促進其進入細胞分化階段，Song等[7]研究也表明淫羊藿苷能降低MC3T3-E1細胞CDK4的表達而促進細胞分化。

OPG/RANKL/RANK 系統(tǒng)在成骨與破骨細胞的相互平衡中起重要作用，OPG與RANKL能競爭性的結(jié)合RANK受體，而減少破骨細胞的生成。OPG、RANKL都是由成骨細胞系分泌的[8]，本實驗以MG-63為研究對象，因其是體外研究成骨細胞功能具有代表性的細胞系。實驗發(fā)現(xiàn)，MG-63中RANKL的RNA和蛋白表達量都極低，甚至包括在空白組，Gori等[8]認為在成骨分化過程中，RANKL的表達量會下降約5倍，而OPG的表達會上升7倍，RANKL表達量受明顯抑制可能是原因之一；另外，Mori等[9]研究發(fā)現(xiàn)RANKL在MG-63、U2OS、HOB、SAOS-2、HOS等所有人成骨肉瘤中的表達量都極低，而Mogi等[10]發(fā)現(xiàn)OPG-RANKL復(fù)合體只在U2OS細胞中檢測得到，在MG-63、HOB、SAOS-2、HOS細胞中都無法檢測，這也可能是RANKL蛋白無法檢測出的另一原因，但也有文獻報道[11-12]MG-63可檢測出表達量較高的RANKL，這些差異可能與細胞在體外培養(yǎng)的具有異質(zhì)性，某些特性改變有關(guān)。雖然結(jié)果顯示RANKL的mRNA表達量低，但淫羊藿苷濃度10nmol時其表達趨于更受抑制，Wang等[12]報道另一種異黃酮類葛根素1 μmol能明顯抑制MG-63中RANKL的表達，同時淫羊藿苷能降低SW1353人軟骨肉瘤細胞中RANKL的表達量[13]。

OPG/RANKL的比例增高可抑制破骨分化，Wang等[14]實驗結(jié)果表明MG-63細胞中OPG的表達是受雌激素受體α(Estrogen receptor α，ERα)調(diào)節(jié)的，Luo等[5]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可上調(diào)MG-63中ERα，但并沒有文獻報道淫羊藿苷對OPG/RANKL表達的直接影響，本實驗中不同濃度的淫羊藿苷干預(yù)后的OPG、RANKL表達量與對照組相比均無明顯差異，這說明很可能淫羊藿苷不通過上調(diào)OPG/RANKL來促進成骨分化，本實驗未來將進一步研究其作用機制。

因此，本實驗研究發(fā)現(xiàn)10 μmol/L的淫羊藿苷可明顯促進COL1A1的表達量，從而促進成骨細胞的生成，但并不通過作用于OPG/RANKL系統(tǒng)起效。