楊學(xué)山，祝 霞，李 潁，楊 婷，馬騰臻，韓舜愈（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

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葡萄酒泥酵母制備水溶性β-D-葡聚糖工藝優(yōu)化及其純化后抗氧化性分析

楊學(xué)山1，2，祝 霞2，3，李 潁2，3，楊 婷2，3，馬騰臻2，3，韓舜愈2，3
（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

以誘導(dǎo)自溶后的葡萄酒泥酵母細(xì)胞壁為試材，采用蛋白酶水解法，通過響應(yīng)面分析法確定制備水溶性β-D-葡聚糖的最佳工藝條件，將粗品經(jīng)Sephacryl S-400 HR凝膠柱層析純化后，對其抗氧化性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，酶解制備水溶性β-D-葡聚糖的最佳工藝條件為浸提溫度60 ℃、加酶量247 U/mL、pH 7.5、浸提時間1.5 h，得率為80.91%。凝膠柱層析純化后得到3 種組分，比例依次為組分Ⅰ 68.08%、組分Ⅱ 13.97%、組分Ⅲ 8.79%，其中組分Ⅰ分子質(zhì)量為100 065.18 D。純化后的水溶性β-D-葡聚糖清除ABTS+·、羥自由基、DPPH自由基、O2-·和螯合Fe2+的EC50值分別為2.035、6.352、16.773、5.238、1.061 mg/mL，具有良好的抗氧化活性。

葡萄酒泥酵母；可溶性β-葡聚糖；提取純化；抗氧化

葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量酵母細(xì)胞中含有豐富的多糖、氨基酸、維生素、酶及礦物質(zhì)，是開發(fā)生物活性物質(zhì)的優(yōu)良資源［1］。但在實(shí)際生產(chǎn)中酒泥酵母常被當(dāng)作飼料、肥料甚至垃圾處理，不僅未能充分體現(xiàn)其經(jīng)濟(jì)價值，而且形成了很大的環(huán)保壓力，已成為葡萄加工業(yè)亟需解決的行業(yè)性問題［2-3］。

β-D-葡聚糖約占酵母細(xì)胞壁干物質(zhì)含量的60%，具有抗腫瘤、抗輻射、抗氧化等功能［4-5］，可廣泛用于化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域［6-8］。研究［9-10］表明，酵母葡聚糖在水中的溶解度與其分子內(nèi)部的聚合度、分支度和化學(xué)修飾有關(guān)，直接提取的β-D-葡聚糖水溶性差，限制了其實(shí)際應(yīng)用。因此，探索安全、高效的增溶工藝，獲得大分子質(zhì)量的可溶性β-D-葡聚糖是促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化推廣的關(guān)鍵問題之一。目前已有通過化學(xué)修飾法制備可溶性β-D-葡聚糖的相關(guān)報道［11］，但存在潛在安全隱患；生物酶是通過特異性或非特異性地作用于葡萄糖苷鍵，將多糖裂解為聚合度較低的低聚糖以增強(qiáng)其溶解性的新方法［12］。王成龍等［13］采用葡聚糖酶降解不溶性葡聚糖，由于葡聚糖酶可專一作用于葡聚糖主鏈的β-1，3-D-糖苷鍵，很容易將多糖降解為分子質(zhì)量過低的低聚糖或寡糖，從而嚴(yán)重影響其生物活性，使獲得的水溶性多糖失去應(yīng)用價值。近年來，一些非專一性酶受到了重視，余奕珂等［14］采用來自于芽孢桿菌的Alcalase蛋白酶將酵母葡聚糖水解為分子質(zhì)量較大的可溶性低聚糖，且保持了多糖生物活性及功能。

本實(shí)驗(yàn)以誘導(dǎo)自溶后的葡萄酒泥酵母細(xì)胞壁為原料，采用響應(yīng)面分析法對酶法水解制備水溶性β-D-葡聚糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并將粗品經(jīng)Sephacryl S-400 HR凝膠柱層析純化后，系統(tǒng)研究其體外抗氧化作用，以期為降低酵母多糖生產(chǎn)成本、拓展應(yīng)用領(lǐng)域、促進(jìn)葡萄酒泥酵母的資源化開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒酵母泥 甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶 中國Biosharp公司；蘭色葡聚糖、Dextran標(biāo)準(zhǔn)品 美國Pharmacia公司；2，2′-聯(lián)氮基-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）、菲洛嗪、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH） 上海源葉生物科技有限公司；冰乙酸、異丙醇、無水乙醇、氯化鈉、乙酸鈉、蒽酮、乙二胺四乙酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TDZ5-WS湘儀離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海梅香儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C型pH計 上海雷磁有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水溶性β-D-葡聚糖提取工藝流程

葡萄酒泥→誘導(dǎo)自溶→除甘露聚糖→除脂質(zhì)→酶解→乙醇醇析（酶解液-乙醇體積比2∶1，12 h）→丙酮、乙醚洗滌（15 min，2 次）→透析→冷凍干燥→水溶性β-D-葡聚糖樣品

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 酵母自溶

參照本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法，稱取4 g葡萄酒泥酵母，溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% NaCl溶液、pH 4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液，47.5 ℃誘導(dǎo)自溶33 h。

1.3.2.2 除甘露聚糖

稱取2.5 g自溶后的酵母細(xì)胞壁，以料液比1∶23在124 ℃條件下（高溫滅菌鍋）熱水浸提5 h，離心后取沉淀。

1.3.2.3 除脂質(zhì)

將沉淀用蒸餾水洗滌2～3 次，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為4%的冰乙酸溶液，室溫條件下放置2 h，將離心后的沉淀用蒸餾水洗滌2 次，以料液比1∶2加入異丙醇，4 ℃靜置過夜，離心取沉淀。

1.3.2.4 酶解

向沉淀中加一定量酶液，在適當(dāng)pH值及溫度條件下酶解一定時間，85 ℃滅酶15 min，離心取上清液。

1.3.2.5 透析

向上清液加入無水乙醇醇析，丙酮、乙醚洗滌后沉淀用蒸餾水溶解，所得溶液依次用蒸餾水透析48 h、蒸餾水透析24 h，透析完成后，將透析袋（8 000～14 000 D）內(nèi)溶液進(jìn)行冷凍干燥，即得水溶性β-D-葡聚糖。

1.3.3 水解酶的篩選

以中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶3 種蛋白酶為水解酶，在其各自最適酶解條件（參照產(chǎn)品說明書）下水解3 h（表1），以水溶性β-D-葡聚糖得率為評價指標(biāo)，對3 種不同蛋白酶的酶解效果進(jìn)行評價，篩選水解效果較好的酶。

表1 不同酶的最適酶解條件Table 1 Optimale nzymatich ydrolysisc on diti on sf ord ifferente nzymes

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計

稱取1 g葡聚糖沉淀，分散到20 mL的磷酸緩沖溶液中，加入堿性蛋白酶進(jìn)行水解，分別考察浸提溫度（50、55、60、65、70 ℃）、浸提時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、加酶量（100、150、200、250、300 U/mL）和緩沖液pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對水溶性β-D-葡聚糖得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計原理，以水溶性β-D-葡聚糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝。

1.3.6 水溶性β-D-葡聚糖含量測定

1.3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參照文獻(xiàn)［15］的方法并修改，準(zhǔn)確配制葡萄糖質(zhì)量濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL，加入4 mL 0.2%蒽酮試劑，混合均勻后迅速冷卻，煮沸10 min后取出，迅速冷卻，室溫放置10 min。于620 nm波長條件下比色，記錄吸光度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=7.202 9x+0.001 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。

1.3.6.2 樣品制備及測定

稱取固體樣品25 mg放入水解管中，加入2.7 mol/L的H2SO46.75 mL后封管，置于100 ℃沸水浴中水解3 h，冷卻至室溫，水解液轉(zhuǎn)入容量瓶定容備用。取樣液1 mL，按1.3.6.1節(jié)方法測吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算水溶性β-D-葡聚糖質(zhì)量濃度。

1.3.7 水溶性β-D-葡聚糖得率計算

1.3.8 水溶性β-D-葡聚糖凝膠柱層析

1.3.8.1 水溶性β-D-葡聚糖純化

取制備的水溶性β-D-葡聚糖樣品進(jìn)行凝膠柱層析，將其上樣到已平衡好的Sephacryl S-400 HR凝膠柱（1.0 cm×50 cm）上。其中，上樣量為10 mg，上樣體積為1 mL，用含0.5 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為2 mL/min，自動收集器收集洗脫液，每管餾分2 mL，采用紫外分光光度法進(jìn)行跟蹤檢測，收集合并主峰，測定水溶性β-D-葡聚糖含量［16］。

1.3.8.2 水溶性β-D-葡聚糖相對分子質(zhì)量測定

凝膠柱用0.5 mol/L的NaCl溶液平衡60 h后分別用3 mg蘭色葡聚糖和Dextran標(biāo)準(zhǔn)品（T500、T70、T40、T10）相繼上柱，測得外水體積V0和洗脫體積V，以分子質(zhì)量對數(shù)lgMw為縱坐標(biāo)，V/V0為橫坐標(biāo)繪圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將純化的水溶性β-D-葡聚糖上樣，分部收集流出液（1 mL/管）。水溶性β-D-葡聚糖采用蒽酮-硫酸法檢測糖峰，分別測定洗脫體積V1，依據(jù)V1/V0從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品分子質(zhì)量［17］。

1.3.9 水溶性β-D-葡聚糖體外抗氧化活性測定

1.3.9.1 抗氧化物制備

參照文獻(xiàn)［18］方法并修改，將分離制備的水溶性β-D-葡聚糖，采用活性炭脫色法去除其中的色素成分，100 ℃加熱濃縮、干燥后配制質(zhì)量濃度為1.1、1.6、2.1、2.6、 3.1、3.6、4.1 mg/mL的水溶性β-D-葡聚糖測定液，并配制相同質(zhì)量濃度的陽性對照VC和EDTA溶液。

1.3.9.2 ABTS+·清除能力測定

參照文獻(xiàn)［19］方法并修改。以VC作陽性對照，計算如式（2）所示：

式中：A0為ABTS工作液和乙醇的吸光度；A1為ABTS工作液和水溶性β-D-葡聚糖的吸光度。

1.3.9.3 羥自由基清除能力測定

參照文獻(xiàn)［20］。以VC為陽性對照，計算如式（3）所示：

式中：A0為空白對照吸光度；A1為水溶性β-D-葡聚糖存在條件下的吸光度；A2為只含水溶性β-D-葡聚糖的吸光度。

1.3.9.4 DPPH自由基清除能力測定

參照文獻(xiàn)［20］。以VC為陽性對照，計算如式（4）所示：

式中：A0為DPPH和磷酸鈉鹽緩沖液的吸光度；A1為DPPH和水溶性β-D-葡聚糖溶液的吸光度；A2為水溶性β-D-葡聚糖和磷酸鈉鹽緩沖液的吸光度。

參照［21］方法并修改。以VC為陽性對照，計算如式（5）所示：

式中：ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率；ΔA1為加入水溶性β-D-葡聚糖水解液后鄰苯三酚的氧化速率；A2為只含水溶性β-D-葡聚糖時的吸光度。

1.3.9.6 Fe2+螯合能力測定

參照［20］方法并修改。以EDTA為陽性對照，計算如式（6）所示：

式中：A0為不含水溶性β-D-葡聚糖的吸光度；A1為在水溶性β-D-葡聚糖存在時的吸光度。

1.3.10 半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）計算

EC50是指清除率為50%時水溶性β-D-葡聚糖、VC或EDTA的質(zhì)量濃度，采用Logit回歸計算。EC50可作為評價抗氧化能力的重要參數(shù)，如某種物質(zhì)的EC50低于10 mg/mL，則表明其具有很好的抗氧化活性［22］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件進(jìn)行整理和圖表處理，SPSS 17.0進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解酶篩選結(jié)果

圖1 3 種酶對水溶性 β-D-葡聚糖酶解效果Fig.1 Comparison of extraction efficiencies of water-soluble β-D-glucan with three enzymes

由圖1可知，3 種蛋白酶中堿性蛋白酶對β-D-葡聚糖水溶化效果最好，在酶解時間為1.5 h時水溶性β-D-葡聚糖得率最大，達(dá)70.70%。胰蛋白酶和中性蛋白酶分別在1.5、2.0 h時達(dá)到最大52.66%和53.26%，均低于堿性蛋白酶。因此，選擇堿性蛋白酶為水溶性β-D-葡聚糖制備工藝優(yōu)化的最適用酶。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 浸提溫度對水溶性β-D-葡聚糖提取的影響

圖2 浸提溫度對水溶性 β-D-葡聚糖得率的影響Fig.2 Effect of temperature on the yield of water-soluble β-D-glucan

由圖2可知，浸提溫度為60 ℃時，水溶性β-D-葡聚糖得率最大，為71.76%，所以選擇60 ℃為制備水溶性β-D-葡聚糖的較佳溫度。當(dāng)溫度小于或大于60 ℃時，都會使得率降低，這是由于溫度較低，活化分子數(shù)較少，未達(dá)到酶促反應(yīng)的最適溫度，反應(yīng)不充分；溫度過高，會增加構(gòu)成酶本身蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子熱能，增加多重弱非共價鍵相互作用破裂的機(jī)會，最終導(dǎo)致酶的變性，導(dǎo)致水溶性β-D-葡聚糖得率下降［23］。

2.2.2 浸提時間對水溶性β-D-葡聚糖提取的影響

圖3 浸提時間對水溶性 β- D-葡聚糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of water-soluble β-D-glucan

由圖3可知，浸提時間不同，水溶性β-D-葡聚糖得率也有所不同。當(dāng)浸提時間為1.5 h時，水溶性β-D-葡聚糖得率最大，為71.01%，所以選擇1.5 h為制備水溶性β-D-葡聚糖的較佳時間。當(dāng)浸提時間小于1.5 h時，酶解過程不徹底，水溶性β-D-葡聚糖得率較低；若時間過長，會使葡聚糖降解，雜質(zhì)相應(yīng)的也被提取出來，也會導(dǎo)致得率降低［24］。

2.2.3 加酶量對水溶性β-D-葡聚糖提取的影響

圖4 加酶量對水溶性 β- D-葡聚糖得率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the yield of water-soluble β-D-glucan

由圖4可知，隨著加酶量的增加，水溶性β-D-葡聚糖得率呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢，在加酶量為250 U/mL時得率最大，為79.06%，因此選擇250 U/mL為制備水溶性β-D-葡聚糖的較佳加酶量。當(dāng)加酶量低于250 U/mL時，酶未能充分與底物接觸并發(fā)揮水解作用，水解不徹底，導(dǎo)致得率降低［23］；酶量過大，會大量作用于己經(jīng)水解的葡聚糖，產(chǎn)生二糖、單糖等，從而導(dǎo)致水溶性β-D-葡聚糖得率降低。

2.2.4 pH值對水溶性β-D-葡聚糖提取的影響

圖5 p H 值對水溶性 β-D-葡聚糖得率的影響Fig.5 Effect of pH on the yield of water-soluble β-D-glucan

由圖5可知，不同pH值處理對水溶性β-D-葡聚糖的制備也有較明顯影響。隨著pH值的升高，水溶性β-D-葡聚糖得率增大，pH值達(dá)到7.5時得率最大，為79.06%。隨后當(dāng)pH值升高到8.0時，葡聚糖得率有輕微下降。究其原因是由于不同pH值處理會影響水解酶的活性，當(dāng)pH值為7.5時，達(dá)到酶的最適pH值，水解效果最明顯，而當(dāng)pH值偏離最適pH值時，會對酶的空間結(jié)構(gòu)造成破壞，使酶活降低。但由于所用堿性蛋白酶的最適pH值范圍為7.0～8.0，因此，水溶性β-D-葡聚糖得率下降較少。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 回歸模型的確定

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken resp on se surfaceexperiments

利用Design-Expert 7.0軟件對表2進(jìn)行二次多項回歸擬合試驗(yàn)和方差分析，反映浸提溫度、浸提時間、加酶量和pH值對水溶性β-D-葡聚糖得率的影響，擬合所得多元二次回歸方程如下：

該方程決定系數(shù)R2=0.984 3，校正決定系數(shù)R=0.968 7，因此，可以充分描述獨(dú)立變量對水溶性β-D-葡聚糖得率的影響。該模型回歸方程P值小于0.000 1，模型極顯著，模型擬合程度良好。

2.3.2 回歸方程的方差分析

表3 回歸方程各項的方差分析Table3 Analysis of variancef ora llthe terms of the regressi on e quati on

由表3可以看出，水溶性β-D-葡聚糖得率方程的一次項X3顯著，二次項極顯著，說明各具體因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。交互項X1X2、X1X4及X3X4極顯著，說明X1和X2、X1和X4、X3和X4之間的交互作用很好，整個響應(yīng)面基于各因素間的交互作用構(gòu)成。另外，模型的變異系數(shù)為1.51%，證明回歸方程擬合程度較好，說明試驗(yàn)具有很高的可信性和準(zhǔn)確性。失擬項不顯著，說明試驗(yàn)的誤差很小。各因素的F值可以反映其對試驗(yàn)指標(biāo)的重要性。F值越大，對試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大。從方差分析表可知各因素對水溶性β-D-葡聚糖得率的影響程度大小順序?yàn)椋杭用噶浚窘釡囟龋窘釙r間＞pH值。

2.3.3 各因素之間交互作用的響應(yīng)面分析

圖6 各因素交互作用對水溶性 β-D-葡聚糖得率影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface plots showing the effect of temperature， time，enzyme dosage and pH on the yield of water-soluble β-D-glucan

由圖6及回歸方程方差分析可知，因素X1與X2、X1與X4、X3與X4交互作用顯著，而X1與X3、X2與X3及X2與X4之間的交互作用不顯著。

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由響應(yīng)面和等高線圖以及回歸方程分析可知，制備水溶性葡萄酒泥酵母β-D-葡聚糖最佳工藝條件為：浸提溫度59.82 ℃、浸提時間1.5 h、加酶量247.47 U/mL、pH 7.48。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件制備水溶性β-D-葡聚糖，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為浸提溫度60 ℃、浸提時間1.5 h、加酶量247 U/mL、pH 7.5。按上述條件進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證，重復(fù)3次實(shí)際測得的水溶性β-D-葡聚糖得率分別為80.28%、81.12%、81.33%，平均得率為80.91%，與理論預(yù)測值（79.86%）相比，其相對誤差約為1.31%。說明通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的回歸方程具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

2.4 分子質(zhì)量測定結(jié)果

2.4.1 水溶性β-D-葡聚糖純化

圖7 水溶性 β-D-葡聚糖 S ep ha cry l S-400 HR柱凝膠層析洗脫曲線Fig.7 Elution curve of water-soluble β-D-glucan on Sephacryl S-400 HR column

由圖7可知，不溶性β-D-葡聚糖經(jīng)酶解后形成了片段不均一的水溶性糖成分，水解產(chǎn)物分為3類，分子質(zhì)量較大的多糖組成的組分Ⅰ、分子質(zhì)量較小的低聚糖組成的組分Ⅲ，以及分子質(zhì)量介于兩者之間的寡聚糖組成的組分Ⅱ。經(jīng)蒽酮-硫酸法測定水溶性β-D-葡聚糖中各組分比例依次為組分Ⅰ 68.08%，組分Ⅱ13.97%，組分Ⅲ 8.79%。

2.4.2 分子質(zhì)量計算結(jié)果

經(jīng)Sephacryl S-400 HR凝膠層析，根據(jù)V/V0和標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量求得方程y=-0.632 7x+6.714 9，R2=0.991 7。以葡萄酒泥水溶性β-D-葡聚糖的洗脫體積V1/V0，最終得水溶性β-D-葡聚糖（組分Ⅰ）的分子質(zhì)量為100 065.18 D。

2.5 水溶性β-D-葡聚糖體外抗氧化活性測定結(jié)果

2.5.1 水溶性β-D-葡聚糖對ABTS+·清除能力

由圖8可知，水溶性β-D-葡聚糖清除ABTS+·能力存在質(zhì)量濃度相關(guān)性。在0～4.1 mg/mL范圍內(nèi)清除率增加趨勢較穩(wěn)定；而VC在0～1.1 mg/mL范圍內(nèi)對其清除率迅速增加，1.1～4.1 mg/mL范圍內(nèi)增加趨勢相當(dāng)緩慢。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到4.1 mg/mL時，水溶性β-D-葡聚糖和VC 對ABTS+·清除率分別為73.16%、98.92%，EC50分別為2.035、0.467 mg/mL。

圖8 水溶性 β- D-葡聚糖及 V C 對 A B TS +·的清除作用Fig.8 Scavenging effects of water-soluble β-D-glucan and VC against ABTS+·

2.5.2 水溶性β-D-葡聚糖對羥自由基清除能力

圖9 水溶性 β-D-葡聚糖及 V C 對羥自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effects of water-soluble β-D-glucan and VC against hydroxyl radical

由圖9可知，水溶性β-D-葡聚糖具有一定的羥自由基清除能力，清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大。在0～3.1 mg/mL時，水溶性β-D-葡聚糖對羥自由基清除率增加緩慢，3.1～4.1 mg/mL范圍內(nèi)出現(xiàn)較明顯的上升；而VC在0～1.1 mg/mL范圍時，清除率增加明顯，之后趨勢變緩。當(dāng)二者質(zhì)量濃度達(dá)到4.1 mg/mL時，水溶性β-D-葡聚糖和VC對羥自由基清除率分別為36.49%、99.02%，EC50分別為6.352、0.603 mg/mL。

2.5.3 水溶性β-D-葡聚糖對DPPH自由基清除能力

圖10 水溶性 β- D-葡聚糖及 V C 對 D PP H自由基的清除作用Fig.10 Scavenging effects of water-soluble β-D-glucan and VC against DPPH radical

由圖10可知，水溶性β-D-葡聚糖對DPPH自由基的清除能力在整個測試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)變化不明顯。當(dāng)質(zhì)量濃度由1.1 mg/mL升高至4.1 mg/mL時，水溶性β-D-葡聚糖對DPPH自由基清除率由7.42%升高至21.51%，比陽性對照VC（98.89%）低77.38%。水溶性β-D-葡聚糖和VC清除DPPH自由基的EC50分別為16.773、0.440 mg/mL。

圖11 水溶性 β-D-葡聚糖及 V C 對 O ˉ·的清除作用2Fig.11 Scavenging effects of water-soluble β-D-glucan and VC against O

2.5.5 水溶性β-D-葡聚糖對Fe2+螯合能力

圖12 水溶性 β-D-葡聚糖及 E D T A對 F e2+的螯合作用Fig.12 Fe2+ Chelating effects of water-soluble β-D-glucan and EDTA

由圖12可知，水溶性β-D-葡聚糖具有較強(qiáng)的Fe2+螯合能力。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到4.1 mg/mL時，水溶性β-D-葡聚糖對Fe2+螯合率為89.85%，EDTA螯合率為95.61%，EC50分別為1.061、0.232 mg/mL。

3 結(jié) 論

以誘導(dǎo)自溶后的葡萄酒泥酵母細(xì)胞壁為試材，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了酶解制備水溶性β-D-葡聚糖的提取工藝條件。結(jié)果顯示，在酶解溫度60 ℃、加酶量247 U/mL、pH 7.5的條件下酶解1.5 h制備得水溶性β-D-葡聚糖得率最大，達(dá)80.91%。經(jīng)Sephacryl S-400 HR凝膠柱層析純化后，水溶性β-D-葡聚糖中3 種組分比例依次為組分Ⅰ68.08%，組分Ⅱ 13.97%，組分Ⅲ 8.79%，其中組分Ⅰ分子質(zhì)量為100 065.18 D。

體外抗氧化活性研究結(jié)果表明，水溶性β-D-葡聚糖對不同的自由基均有抗氧化作用。對清除ABTS+·、羥自由基、DPPH自由基、O·和螯合Fe2+的EC50分別為2.035、6.352、16.773、5.238 mg/mL和1.061 mg/mL，尤其對ABTS+·、O·的清除及螯合Fe2+作用尤為顯著。因此，從葡萄酒泥酵母中制備純化的水溶性β-D-葡聚糖是一種良好的天然抗氧化劑，可以應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)。

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Purification and Antioxidant Activities of Water-Soluble β-D-Glucan from Waste Wine Yeast

YANG Xueshan1，2， ZHU Xia2，3， LI Ying2，3， YANG Ting2，3， MA Tengzhen2，3， HAN Shunyu2，3
（1.College of Life Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；2.Key Laboratory of Viticulture and Oenology， Gansu Province， Lanzhou 730070， China；3.College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

An enzymatic method was used to prepare water-soluble β-D-glucan from the autolyzed cell wall of waste wine yeast.Single factor method and response surface methodology were applied to optimize the extraction conditions.The watersoluble β-D-glucan was purified by Sephacryl S-400 HR gel column chromatography to investigate its antioxidant activities.The optimum conditions for β-D-glucan extraction were determined as follows： temperature， 60 ℃； enzyme dosage， 247 U/mL；pH， 7.5； and time， 1.5 h.Under these conditions， the yield of water-soluble β-D-glucan was 80.91%.Three components designated asⅠ， Ⅱ and Ⅲ were eluted from the chromatographic column， the contents of which were 68.08%， 13.97% and 8.79%， respectively.The relative molecular weight of componentⅠ was 100 065.18 D.Antioxidant activity studies showed that the purifed water-soluble β-D-glucan had good antioxidant activities with EC50values for scavenging， 2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate （ABTS+·）， hydroxyl radical， 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH） radical and superoxide anion radical and chelating Fe2+of 2.035， 6.352， 16.773， 5.238 and 1.061 mg/mL， respectively.

wine yeast； water-soluble β-D-glucan； extraction and purification； antioxidant activities

10.7506/spkx1002-6630-201614005

TS261.9

A

1002-6630（2016）14-0024-08

楊學(xué)山， 祝霞， 李潁， 等.葡萄酒泥酵母制備水溶性β-D-葡聚糖工藝優(yōu)化及其純化后抗氧化性分析［J］.食品科學(xué)， 2016，

37（14）: 24-31.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614005. http://www.spkx.net.cn

YANG Xueshan， ZHU Xia， LI Ying， et al.Purification and antioxidant activities of water-soluble β-D-glucan from waste wine yeast［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 24-31.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614005. http://www.spkx.net.cn

2015-11-25

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目（GNSW-2013-21）

楊學(xué)山（1977—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與生物產(chǎn)品開發(fā)。E-mail：yangxs@gsau.edu.cn