閆敏，閆華林，李明

(1.解放軍第一O五醫(yī)院檢驗科，安徽 合肥　230031；2.安慶市第一人民醫(yī)院檢驗科，安徽 安慶　246004)

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幾種不同方法學(xué)檢測胃蛋白酶原I，II臨床應(yīng)用探討

閆敏1，閆華林2，李明2

(1.解放軍第一O五醫(yī)院檢驗科，安徽 合肥230031；2.安慶市第一人民醫(yī)院檢驗科，安徽 安慶246004)

摘要：目的使用化學(xué)發(fā)光法(CLIA)，流式熒光發(fā)光法(FFIA)，酶聯(lián)免疫法(ELISA)三種不同的方法檢測血清胃蛋白酶原I(PGI)、胃蛋白酶原II(PGII)，探討三種檢測方法用于胃癌輔助診斷的臨床價值。方法通過方法學(xué)比對與相關(guān)分析，比較三種方法的一致性與相關(guān)性。通過檢測確診為胃癌患者的臨床血清樣本，利用ROC曲線確定PGI與PGI/PGII(PGR)臨界值，評價三種方法的靈敏度與特異度。結(jié)果三種方法測試不同組別血清樣本中PGI、PGII，根據(jù)PGI、PGII結(jié)果計算PGR。發(fā)現(xiàn)胃癌組與非胃癌組間PGI、PGR兩個指標(biāo)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，PGII差異無統(tǒng)計學(xué)意義。方法學(xué)比對發(fā)現(xiàn)，不同方法學(xué)之間PGI、PGII相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)r為：0.9612～0.9789，不同方法學(xué)之間PGR相關(guān)系數(shù)為：0.8602～0.9109。對三種方法進行ROC曲線分析，確定ROC曲線最佳臨界值后，分析PGI、PGR組合用于胃癌診斷，化學(xué)發(fā)光法、流式熒光發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法靈敏度分別為67.6%，61.8%，58.8%，特異度分別為96.6%、94.7%、96.6%。結(jié)論化學(xué)發(fā)光法，流式熒光發(fā)光，酶聯(lián)免疫法檢測PGI、PGII存在較好的相關(guān)性。通過臨床評估，PGI結(jié)合PGR可以有效提高胃癌的診斷特異度與陽性預(yù)測值，具有較好的臨床價值。

關(guān)鍵詞：胃蛋白酶原A;胃蛋白酶原C;發(fā)光測定法;流式細(xì)胞術(shù);聚合酶鏈反應(yīng)

胃癌在全國居惡性腫瘤發(fā)病第2位，發(fā)病率為36.21/106[1]，是我國最常見惡性腫瘤之一。早期胃癌術(shù)后生存率可以達(dá)到80%以上，但目前缺乏簡便的早期篩查的方法，近年來利用腫瘤標(biāo)志物用于胃癌輔助診斷或早期篩查研究較多，其中利用胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)用于胃癌輔助診斷有較為明顯的優(yōu)勢[2～4]，PG為由375個氨基酸組成的胃蛋白酶的無活性前體，相對分子量為42kD，Samloff根據(jù)其生化性質(zhì)和免疫原性將其分成PGI與PGII2個亞群，PGI主要由胃黏膜細(xì)胞及頸黏液細(xì)胞分泌；PGII主要由全胃腺體及十二指腸Brunner腺分泌[5]。檢測胃蛋白酶原I、II常用方法有：酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光法(CLIA)、流式熒光發(fā)光法(FFIA)、時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)、光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法(LICA)以及乳膠增強免疫比濁法等[6-9]。本次研究利用化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法、流式熒光發(fā)光法三種不同方法檢測血清PGI、PGII，評價了三種方法的一致性與相關(guān)性，并通過臨床樣本評價了三種不同方法各自靈敏度與特異度。

1　材料和方法

1.1主要試劑及儀器胃蛋白酶原Ⅰ∕胃蛋白酶原Ⅱ聯(lián)合定量測定試劑盒(流式熒光發(fā)光法)由上海透景公司提供，配套使用儀器為Luminex多功能流式點陣儀(Luminex公司，型號Luminex200)；胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)由芬蘭Biohit公司提供，配套使用儀器為酶標(biāo)儀(鄭州安圖，型號：PHOMO)；胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法)由Abbott公司提供，配套儀器為Abbott全自動免疫分析儀(Abbott公司，型號：ARCHITECTi2000SR)。

1.2標(biāo)本來源2015年1月至2015年7月期間，安慶市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科共收集臨床血清樣本241例。其中通過胃鏡及病理組織確診為胃癌的樣本為34例(平均年齡55歲，男性17例，女性17例)，該組作為胃癌組；胃部良性疾病38例(含慢性胃炎32例、胃潰瘍組5例、胃部良性息肉1例；平均年齡58歲，男性26例，女性12例)，該組作為胃部良性疾病組；另外再取經(jīng)體檢無胃部疾病的健康體檢樣本169例(平均年齡40歲，男性73例，女性96例)，作為健康對照組。在分析PGI、PGII用于胃癌輔助診斷時，胃部良性疾病組與健康對照組合并成非胃癌組。

1.3方法采集受試者空腹靜脈血5mL，離心分離血清后置-20℃保存待測。檢測過程中嚴(yán)格按照三個不同方法學(xué)試劑說明書及儀器說明書要求進行操作，在測試過程均進行質(zhì)控，上海透景試劑采用上海透景提供的質(zhì)控品，芬蘭Biohit試劑使用試劑盒內(nèi)配套質(zhì)控品，Abbott試劑盒Abbott公司提供的PGI，PGII質(zhì)控品，要求質(zhì)控品測值均應(yīng)在其提供的參考范圍內(nèi)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法用MicrosoftExcel2010與IBMSPSS22進行圖形處理與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。使用對于正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)兩組間比較用獨立樣本t檢驗；多組間比較用方差分析；兩兩比較采用SNK-q檢驗方法。對偏態(tài)分布計量數(shù)據(jù)，兩組間比較用Mann-WhitneyU檢驗；多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。通過方法學(xué)比對比較三種方法測值的一致性，對不同方法學(xué)間進行相關(guān)分析。使用SPSS分析PGI、PGII以及PGR對胃癌診斷的ROC曲線，分析ROC曲線面積，并通過ROC曲線確定各個指標(biāo)最佳臨界值，通過確定的臨界值分析三種方法各自靈敏度，特異度，陽性預(yù)測值以及陰性預(yù)測值。所有檢驗均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三種方法檢測不同組別樣本結(jié)果分析經(jīng)三種不同方法對PGI、PGII以及PGR檢測結(jié)果統(tǒng)計見表1。

2.2三種方法學(xué)檢測結(jié)果分析對三種方法測試得到的PGI、PGII及PGR結(jié)果進行兩兩方法學(xué)比對，繪制散點圖，并擬合兩方法學(xué)之間的直線方程(圖1)，分析方法學(xué)間相關(guān)性(表1)。

表1　三種不同方法檢測結(jié)果統(tǒng)計分析

注：同方法學(xué)內(nèi)與胃癌對照組比較，aP<0.05，同方法學(xué)內(nèi)與胃部良性疾病組比較，bP<0.05。

注：圖(a)，化學(xué)發(fā)光法與流式熒光發(fā)光法PGI方法學(xué)比對散點圖；圖(b)，化學(xué)發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法PGI方法學(xué)比對散點圖；圖(c)，流式熒光發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法PGI方法學(xué)比對散點圖；圖(d)，化學(xué)發(fā)光法與流式熒光發(fā)光法PGII方法學(xué)比對散點圖；圖(e)，化學(xué)發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法PGII方法學(xué)比對散點圖；圖(f)，流式熒光發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法PGII方法學(xué)比對散點圖；圖(g)，化學(xué)發(fā)光法與流式熒光發(fā)光法PGR方法學(xué)比對散點圖；圖(h)，化學(xué)發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法PGR方法學(xué)比對散點圖；圖(i)，流式熒光發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法PGR方法學(xué)比對散點圖。

圖1　三種不同方法學(xué)檢測PG，PGI、PGII、PGR三個指標(biāo)不同方法學(xué)比較 表2　不同方法學(xué)間相關(guān)系數(shù)r統(tǒng)計

2.3ROC曲線分析及最佳臨界值確定以胃癌組作為陽性組，胃部良性疾病組與健康對照組作為陰性組。因PGII指標(biāo)在三個組別間測值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，僅繪制PGI、PGR在三個方法學(xué)中各自的ROC曲線，見圖2，并計算出各曲線下面積見表3。選擇ROC曲線上靠近左上方即約登指數(shù)最大的切點為最佳臨界值，分別計算出各個指標(biāo)在不同方法學(xué)下最佳臨界值，見表3。

圖2　PGI、PGR在各自方法學(xué)中ROC曲線表3　不同方法學(xué)下不同指標(biāo)ROC曲線

指標(biāo)ROC曲線下面積P值95%置信區(qū)間最佳臨界值化學(xué)發(fā)光法PGI0.8060.0000.718～0.89447.20化學(xué)發(fā)光法PGR0.8350.0000.744～0.9272.83流式熒光發(fā)光法PGI0.7930.0000.707～0.87855.85流式熒光發(fā)光法PGR0.8330.0000.741～0.9255.75酶聯(lián)免疫法PGI0.7970.0000.708～0.88648.81酶聯(lián)免疫法PGR0.8300.0000.735～0.9265.15

2.4不同方法學(xué)PG靈敏度與特異度分析通過ROC曲線確定最佳臨床診斷值，其中先分析PGI單指標(biāo)靈敏度與特異度數(shù)據(jù)，見表4。再利用PGI與PGR指標(biāo)串聯(lián)方式進行檢驗結(jié)果判斷(即PGI、PGR同時為陽性才判斷檢驗結(jié)果為陽性，否則為陰性)。對241例樣本結(jié)果進行分析統(tǒng)計，計算各個方法學(xué)對胃癌的診斷靈敏度與特異度，并計算各自陽性預(yù)測值與陰性預(yù)測值，見表5。

表4　三種不同方法檢測PG各自診斷靈敏度與特異度(使用PGI單指標(biāo))/%

表5　三種不同方法檢測PG各自診斷靈敏度與特異度(使用PGI、PGR組合指標(biāo))/%

3　討論

血清中胃蛋白酶原PG水平可以反映胃黏膜功能和組織學(xué)狀況，PG作為胃癌的腫瘤標(biāo)志物現(xiàn)已經(jīng)獲得廣泛研究與臨床應(yīng)用。相對單獨進行PGI檢測，PGI結(jié)合PGR，可以有效提高診斷特異度[9]。

目前有相當(dāng)多的檢測PG的方法，不同的方法有可能導(dǎo)致樣本測試結(jié)果產(chǎn)生較大差異[7]。本次研究采用了3種方法來檢測同一批臨床血清樣本中PGI、PGII，分析三種不同方法學(xué)之間的一致性與相關(guān)性，其中流式熒光發(fā)光法是較為創(chuàng)新的方法，可以一次測試實現(xiàn)PGI、PGII兩個指標(biāo)的同步測試。對三種不同方法檢測PGI、PGII進行兩兩方法學(xué)比對，相關(guān)系數(shù)r為0.961 2～0.978 9，提示三種不同方法學(xué)之間存在良好的相關(guān)性，PGR兩兩相關(guān)系數(shù)r為0.860 2～0.910 9。從圖形及數(shù)據(jù)來看，PGR方法學(xué)之間相關(guān)性明顯不及PGI、PGII。主要原因可能為不同方法學(xué)因采用抗體的差異以及方法學(xué)本身差異，導(dǎo)致同一樣本PGI、PGII結(jié)果存在差異，PGR結(jié)果取決于PGI、PGII結(jié)果，PGI、PGII結(jié)果差異疊加，會導(dǎo)致PGR離散程度增加，從而導(dǎo)致相關(guān)系數(shù)r下降。另外通過方法學(xué)比對，本研究觀察到化學(xué)發(fā)光法測試PGI與其它兩種方法存在明顯的差異，PGI酶聯(lián)免疫法與化學(xué)發(fā)光法，流式熒光發(fā)光法與化學(xué)發(fā)光法擬合直線方程分別為Y=1.344 4X+3.008 4，Y=1.343 6X+3.739 6。直線方程斜率提示，兩種方法學(xué)之間存在較大的系統(tǒng)差異。而流式熒光發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法擬合直線方程為Y=0.972 9X+1.665，斜率為0.972 9，在0.9～1.1之間，提示兩種方法學(xué)之間測值系統(tǒng)差異小。相對于PGI，PGII在三種不同方法學(xué)之間系統(tǒng)差異明顯要小，PGII酶聯(lián)免疫法與化學(xué)發(fā)光直線擬合方程為Y= 0.915 2X+0.689 5，流式熒光發(fā)光法與化學(xué)發(fā)光直線擬合方程為Y=0.938 7X+0.459 9，酶聯(lián)免疫法與流式熒光發(fā)光法擬合直線方程為Y=0.966 7X+0.343 9，PGII方法學(xué)兩兩擬合直線，斜率均在0.9～1.1之間。PGI之所以在不同方法學(xué)之間存在較大測值差異，推測主要原因是由于PGI、PGII目前無參考測量程序以及無約定的參考測量物質(zhì)，導(dǎo)致無法將結(jié)果通過合適的溯源途徑在計量學(xué)上至統(tǒng)一的國際單位。該現(xiàn)象的存在，將導(dǎo)致PGI在采用不同檢測方法的檢測實驗室無法實現(xiàn)檢驗結(jié)果互認(rèn)。

通過三種不同方法檢測PGI、PGII并獲得PGR數(shù)據(jù)，三種方法的檢驗結(jié)果均表明在胃部良性疾病組、健康對照組兩個組別中PGI與PGR兩項指標(biāo)與胃癌組均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而PGII則在三個不同疾病組別中不存在組間差異(P>0.05)。這個結(jié)果表明PGII指標(biāo)在胃癌輔助診斷中臨床診斷價值不高。

考慮到不同方法學(xué)之間PGI存在系統(tǒng)差異，使用ROC曲線建立各自方法學(xué)PGI、PGR的最佳臨界值。化學(xué)發(fā)光法中確定PGI臨界值為47.20，PGR為2.83，流式熒光發(fā)光法PGI臨界值為55.85，PGR為5.75，酶聯(lián)免疫法PGI臨界值為48.81，PGR為5.15。本方法確定的臨界值與文獻(xiàn)報道的臨界值存在較大差異[12]，可能原因為：(1)入組樣本存在差異；(2)樣本量偏少；(3)入組人群與文獻(xiàn)中入組人群本身差異。通過確定的臨界值分析各個指標(biāo)的靈敏度與特異度。結(jié)果表明單獨以PGI作為臨界值時，特異度明顯較PGI、PGR兩個指標(biāo)要差。使用PGI、PGR在維持一定靈敏度的情況下能使特異度提高66.2%～84.1%提高至90%以上，同時提高了三種方法的陽性預(yù)測值。鑒于方法學(xué)間較高的相關(guān)性，三種方法學(xué)之間靈敏度與特異度上經(jīng)卡方檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，三種常見方法學(xué)檢測PGI、PGII存在較好的相關(guān)性，PGI在化學(xué)發(fā)光法中與另外兩種方法學(xué)之間存在系統(tǒng)測值差異。通過臨床評估，PGI結(jié)合PGR可以有效提高胃癌的診斷特異度與陽性預(yù)測值，具有較好的臨床價值。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.031

(收稿日期：2016-02-12，修回日期：2016-04-08)

Clinical application of three different methods to the detection of Pepsinogen I and Pepsinogen II

YAN Min1,YAN Hualin2,LI Ming2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,105HospitalofPLA,Hefei,Anhui230031,China;2.FirstPeople’sHospitalofAnqing,Anqing,Anhui246004,China)

Abstract:ObjectiveTo study the clinical value of gastric cancer auxiliary diagnosis of three kinds of detection methods,using the chemiluminescent immunoassay (CLIA) ,flow type fluorescent light emitting method (FFIA) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) to detect Pepsinogen I (PGI),Pepsinogen II (PGII).MethodsWith the method of comparison and correlation analysis,the consistency and correlation of the three methods are compared.The clinical serum samples of patients diagnosed with gastric cancer were tested and the critical values of PGI and PGI/PGII (PGR) were determined by using ROC curve to evaluate the sensitivity and specificity of the three methods.ResultsThe results of PGI and PGII in serum samples were tested by three different methods.And PGR was calculated according to the results of PGI and PGII.It was found that there were significant differences in the two indexes of PGI and PGR between gastric cancer group and non gastric cancer group,and there was no significant difference in PGII between the two groups.The comparative study found that the correlation coefficient between PGII and PGI was good,and the correlation coefficient r was in the range of 0.9612～0.9789,and the correlation coefficients of PGR among different methodology was in the range of 0.8602～0.9109.The sensitivities and specificities of CLIA,FFIA,ELISA were 67.6%,61.8%,58.8%,and 96.6%,94.7% and 96.6%,respectively.ConclusionsThere is good correlation among CLIA,FFIA,and ELISA detection of PGI,and PGII.Clinical evaluation indicates that PGI combined with PGR can effectively improve the diagnostic specificity and positive predictive value of gastric cancer,which has a good clinical value.

Key words:Pepsinogen A;Pepsinogen C;Luminescent Measurements;Flow Cytometry;Polymerase Chain Reaction