王　劍，趙　龍*

（1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院東崗院區(qū)，甘肅 蘭州 730000）

慢病毒介導(dǎo)的CRYAB基因沉默對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

王劍1，2，趙龍1，2*

（1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院東崗院區(qū)，甘肅 蘭州 730000）

目的 應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，通過體外實(shí)驗(yàn)探討CRYAB基因沉默對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖和遷移能力的影響。方法 構(gòu)建靶向CRYAB基因特異性shRNA慢病毒載體并轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞株，利用Real-time PCR和Western Blotting技術(shù)分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測其表達(dá)的變化。CCK-8法和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測沉默CRYAB基因后細(xì)胞的增殖能力，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果 Real-time PCR和Western Blotting結(jié)果均表明，成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA-CRYAB骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞株。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示shRNA-CRYAB病毒轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組相比細(xì)胞的增殖能力顯著降低（P〈0.05），尤其在第四、五、六和第七天表現(xiàn)更明顯；細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shRNA-CRYAB病毒轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組的克隆形成率分別為5.2%和26.0%，具有顯著性差異（P〈0.05）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shRNA-CRYAB病毒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移率明顯低于陰性對(duì)照組（P〈0.01）。結(jié)論 shRNA-CRYAB慢病毒干擾載體能有效抑制CRYAB基因在人骨肉瘤細(xì)胞MG-63中表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和遷移。

慢病毒；CRYAB基因；骨肉瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

骨肉瘤是原發(fā)于骨組織的最常見惡性腫瘤，其來源于間葉組織，好發(fā)于兒童與青少年［1-2］，惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，是一種致死率與致殘率極高的腫瘤，其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，且缺乏有效的防治措施。鑒于其多發(fā)于兒童及青少年，這一群體的預(yù)期存活期長，故需長期應(yīng)用化療藥物治療。而化療藥物對(duì)機(jī)體有毒副作用及腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物可產(chǎn)生抗藥性是嚴(yán)重制約長期化療的關(guān)鍵因素［3-4］。因此，研究維持骨肉瘤細(xì)胞惡性表型的分子機(jī)制，開發(fā)可增加骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的基因療法是提高療效的關(guān)鍵。

熱休克蛋白（Heat Shock Protein，HSPs）是一組高度保守的肽類蛋白質(zhì)，在保護(hù)細(xì)胞免受外界有害刺激方面發(fā)揮著重要作用［5］。近年來，小熱休克蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受到重視，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、分化、凋亡以及致瘤性等方面扮演著重要角色，研究［6］發(fā)現(xiàn)，小熱休克蛋白在腫瘤細(xì)胞中通常高表達(dá)。aB-晶狀體蛋白（CRYAB）是一種小熱休克蛋白，在非小細(xì)胞肺癌［7］、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌［8］和乳腺癌［9］中表達(dá)增高，也有研究報(bào)道，CRYAB在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，且對(duì)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移有顯著促進(jìn)作用［10］，然而目前關(guān)于CRYAB對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖及遷移能力的研究國內(nèi)還未見報(bào)道，CRYAB作為小熱休克蛋白的另一個(gè)重要成員，預(yù)示其存在潛在的應(yīng)用價(jià)值，本研究通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)沉默CRYAB基因后觀察其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG-63在體外對(duì)細(xì)胞增殖活性和遷移能力的影響，為骨肉瘤的基因靶向治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)介紹如下。

1　材料和方法

1.1材料

人骨肉瘤細(xì)胞MG-63購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；

DMEM、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和Opti-mem培養(yǎng)基購自Gibco公司；細(xì)胞裂解及蛋白抽提試劑購自Thermo公司；BCA蛋白含量檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Real-time PCR試劑盒購自Takara公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)公司；Western Blotting配膠試劑盒、SDS-PAGE上樣緩沖液購自碧云天公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Thermo公司；慢病毒載體購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司；CRYAB抗體購自Abcam公司；CRYAB引物購自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞MG-63用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化吹勻，然后將細(xì)胞懸液以1×106孔接種于6孔板，用相同條件進(jìn)行培養(yǎng)。1.2.2構(gòu)建慢病毒載體和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 慢病毒由上海吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)與合成。同時(shí)制備空載體作為對(duì)照，并將實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組和shRNA-CRYAB病毒轉(zhuǎn)染組。

1.2.3Real-time PCR檢測mRNA水平CRYAB的表達(dá) 采用SYBR Green染料法，以GAPDH為內(nèi)參照。CRYAB mRNA上游引物序列：5’-CTTTGACCAGTTCTTCGGAG-3’，下游引物序列：5’-CCTCAATCACATCTCCCAAC-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物序列：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，下游引物序列：5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’。PCR反應(yīng)條件為：95℃30秒；95℃5秒；60℃34秒；95℃15秒，共40個(gè)循環(huán)。1.2.4Western Blotting檢測人骨肉瘤細(xì)胞 MG-63中CRYAB的表達(dá) SDS-PAGE電泳方法檢測蛋白的表達(dá)。用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。

1.2.5CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 取兩組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞配置成1×104/mL單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL，測定1～7天細(xì)胞增殖活性。調(diào)整細(xì)胞密度為5×103/mL，接種至6孔板，10天后，棄去培養(yǎng)液，固定、染色拍照，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，大于50個(gè)細(xì)胞集落為1個(gè)克隆，根據(jù)公式計(jì)算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數(shù)/5 000×100%。細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/mL。取細(xì)胞懸液200 μL加入小室中，下室中加入600 μL 含20%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，48小時(shí)后拍照，在光學(xué)顯微鏡下觀察，并隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用（x±s）表示，樣本數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P〈0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞MG-63的轉(zhuǎn)染效率測定

慢病毒轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞MG-63 72小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察可見細(xì)胞中CRYAB綠色熒光蛋白表達(dá)。熒光顯微鏡下隨機(jī)選取視野計(jì)算出人骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染效率，然后對(duì)同一視野進(jìn)行白光和熒光拍照（見圖1）。20 MOI值的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率＞80%，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，提示慢病毒轉(zhuǎn)染成功并穩(wěn)定表達(dá)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1　MG-63細(xì)胞中sh-CRYAB病毒轉(zhuǎn)染組白光和綠色熒光蛋白的表達(dá)（10×）

2.2Real-time PCR檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的CRYAB

病毒轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后，于轉(zhuǎn)染后72小時(shí)分別提取兩組細(xì)胞的mRNA，通過PCR驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果顯示，shRNACRYAB病毒轉(zhuǎn)染組mRNA水平比陰性對(duì)照組下降80%（P〈0.01），見圖2。

圖2　mRNA水平上MG-63細(xì)胞中CRYAB的表達(dá)

2.3Western Blotting檢測沉默后 MG-63細(xì)胞蛋白中CRYAB的表達(dá)

在病毒轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后72小時(shí)，提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western Blotting檢測CRYAB的表達(dá)。結(jié)果顯示，shRNACRYAB病毒轉(zhuǎn)染組CRYAB的蛋白表達(dá)相比于陰性對(duì)照組顯著降低、蛋白條帶明顯減弱（P〈0.01），見圖3。

圖3　Western Blotting檢測轉(zhuǎn)染后MG-63細(xì)胞蛋白中CRYAB的表達(dá)

2.4CCK-8法和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力

shRNA-CRYAB病毒轉(zhuǎn)染組較陰性對(duì)照組細(xì)胞吸光度值明顯減小，結(jié)果表示MG-63細(xì)胞的增殖能力在沉默CRYAB基因后明顯降低（P〈0.05），在第三、四、五和第六天表現(xiàn)更明顯，表明shRNA-CRYAB病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞較陰性對(duì)照組細(xì)胞生長速度減慢，并且在檢測的第六天這種生長抑制更為顯著（P〈0.01），進(jìn)一步說明shRNA干擾慢病毒抑制CRYAB在人骨肉瘤細(xì)胞MG-63表達(dá)后，能夠持續(xù)有效抑制細(xì)胞增殖（見圖4）。

圖4　CCK-8法檢測CRYAB基因沉默后MG-63細(xì)胞增殖

在shRNA-CRYAB病毒轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組接種6孔板10天后，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)多于50個(gè)的克隆。結(jié)果表明，shRNACRYAB病毒轉(zhuǎn)染組比陰性對(duì)照組的克隆形成能力明顯降低，根據(jù)公式計(jì)算克隆形成率分別為5.2%和26.0%，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05），見圖5。

圖5　克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測CRYAB基因沉默后MG-63細(xì)胞增殖

2.5Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力

在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，shRNA-CRYAB病毒轉(zhuǎn)染組平均穿膜細(xì)胞數(shù)量為（98.5±3.0）個(gè)；陰性對(duì)照組平均穿膜數(shù)量為（390.0± 3.9）個(gè)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，shRNA-CRYAB病毒轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組相比其細(xì)胞穿膜數(shù)量減少（P〈0.01）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染shRNA-CRYAB后，MG-63細(xì)胞的遷移能力明顯下降，見圖6。

圖6　Transwell檢測CRYAB基因沉默后MG-63細(xì)胞遷移能力（10×）

3　討論

熱休克蛋白是一類在生物進(jìn)化中高度保守、廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)。近年熱休克蛋白在免疫中的作用已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一［11］。最近研究資料［12］顯示，CRYAB與多種腫瘤發(fā)生與發(fā)展相關(guān)，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎臟腫瘤、口腔鱗癌、食管癌、肝癌、乳腺基底細(xì)胞樣癌以及乳腺原位導(dǎo)管癌中表達(dá)高于其在正常對(duì)照組織中的表達(dá)，患者CRYAB高表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，且其可作為判斷多種腫瘤預(yù)后的獨(dú)立因素。在食管癌中的研究顯示，CRYAB可以阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞，即影響細(xì)胞凋亡過程，從而有利于腫瘤形成［13］。

3.1熱休克蛋白CRYAB在其他腫瘤中的表達(dá)

CRYAB作為熱休克蛋白的一種，與惡性腫瘤密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)其可參與控制腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡，在腫瘤發(fā)生中充當(dāng)分子伴侶，使細(xì)胞維持增生狀態(tài)免于凋亡［14-16］。CRYAB是小熱休克蛋白家族中非常重要的一員。研究證實(shí)，CRYAB在多種人類腫瘤組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁及正常組織，且其表達(dá)程度與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。Aoyama等在神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤與正常腦組織標(biāo)本的對(duì)比研究中發(fā)現(xiàn)，CRYAB在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常組織［17］。

RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）能抑制腫瘤細(xì)胞中某些癌基因的表達(dá)，同時(shí)也能抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的，具有高效性、特異性和低毒性的特點(diǎn)。因此運(yùn)用RNAi技術(shù)，人工合成短發(fā)夾環(huán)RNA（shRNA），通過重組慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)將外源基因有效地整合到宿主染色體上，特異性、穩(wěn)定地沉默CRYAB基因在骨肉瘤細(xì)胞MG-63中的表達(dá)。

3.2熱休克蛋白CRYAB對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖、遷移能力的影響

有研究發(fā)現(xiàn)［16］，在肝癌細(xì)胞系HCCLM3細(xì)胞CRYAB表達(dá)下調(diào)后，Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞侵襲能力明顯下降；HCCLM3-vshCRYAB組和HCCLM3-Mock區(qū)別明顯。Hep3BCRYAB穿膜能力明顯高于Hep3B細(xì)胞，這與本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)，shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，人骨肉瘤細(xì)胞MG-63中CRYAB mRNA和蛋白表達(dá)量明顯減少，驗(yàn)證了慢病毒載體良好的干擾效果。通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，shRNA-CRYAB病毒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖能力較陰性對(duì)照組明顯下降；在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，shRNA-CRYAB病毒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移能力顯著下降。由此可見，CRYAB慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染后的人骨肉瘤MG-63細(xì)胞，其增殖、遷移能力明顯下降，表明CRYAB基因在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。這可為進(jìn)一步探究CRYAB基因與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供依據(jù)，可作為骨肉瘤治療的一個(gè)新的重要靶點(diǎn)，為骨肉瘤的治療提供新的思路和方向。

3.3前景與展望

當(dāng)前，雖然CRYAB作為一種重要的促癌基因，但是關(guān)于CRYAB詳細(xì)的分子促癌作用機(jī)制及其相關(guān)信號(hào)通路的研究尚不深入，如CRYAB在骨肉瘤發(fā)生及發(fā)展中的具體功能？CRYAB可能通過與哪些信號(hào)通路的共同作用促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展？其詳盡的機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

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（*通訊作者：趙龍）■

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1671-1246（2016）16-0143-04