林茂銳，周　旋，李明友，黃基偉，劉桂治，曹東林

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84株沙門菌耐藥特征及分子分型結(jié)果分析

林茂銳，周旋，李明友，黃基偉，劉桂治，曹東林

目的分析廣東省第二人民醫(yī)院2012-2014年臨床常見(jiàn)沙門菌耐藥特性及分子分型特征。方法對(duì)分離的84株沙門菌進(jìn)行血清分型、藥物敏感試驗(yàn)。選取不同菌株來(lái)源、血清型和耐藥譜的51株沙門菌，按照美國(guó)PulseNet標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型。應(yīng)用BioNumerics軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析，確定菌株間的相關(guān)性。結(jié)果84株菌分為20種血清型，沙門菌前3位血清型構(gòu)成比從高到低分別為：鼠傷寒沙門菌占42.86%(36/84)、腸炎沙門菌占15.48%(13/84)、斯坦利沙門菌占8.33%(7/84)。本次分離沙門菌對(duì)頭孢類抗生素敏感率達(dá)84.21%以上，對(duì)于環(huán)丙沙星與氯霉素的敏感性在66.67%以上，對(duì)于甲氧芐啶與慶大霉素的敏感性在50.88%以上，但仍存在多株多重耐藥現(xiàn)象。51株沙門菌經(jīng)過(guò)聚類分析可分為 42個(gè)PFGE型，表現(xiàn)為較大的遺傳多樣性。結(jié)論臨床治療時(shí)，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)臨床，合理使用抗生素，以提高治療效果。沙門菌耐藥譜與 PFGE分型無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。

沙門菌；耐藥性；脈沖場(chǎng)凝膠電泳

Supported by the Guangdong Province Medical Science and Technology Research Fund (No.C2012036) and 2013 Annual Guangdong Provincial Finance Technology Development and Application of Special Fund Project (No.Guangdong[2013]401)

沙門氏菌是一種人獸共患的腸道病原菌，至今已有2 523種血清型被發(fā)現(xiàn)[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，1985年以來(lái)，在世界范圍內(nèi)，由沙門氏菌引起的已確診的人類患病人數(shù)呈上升趨勢(shì)，在一些歐洲國(guó)家已增加5倍以上[2-3]。WHO對(duì)沙門菌感染十分重視，早在2000年就成立世界范圍的全球沙門菌監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，廣東省疾病預(yù)防控制中心(CDC)從 2007年起加入全球沙門菌監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，全方位監(jiān)測(cè)本地區(qū)臨床常見(jiàn)菌株類型的分布與傳播，及其對(duì)常用抗菌藥物的敏感程度。我院作為廣東省疾病預(yù)防控制中心的監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院，共監(jiān)測(cè)了3 200余人次。我們收集分析了本院2012年到2014年檢測(cè)出的84株沙門菌的菌株，進(jìn)行耐藥性分析和脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型，為臨床合理使用抗生素，提高治療效果，控制耐藥菌株產(chǎn)生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源按照廣東省CDC沙門菌監(jiān)測(cè)對(duì)象標(biāo)準(zhǔn)，選擇24 h內(nèi)連續(xù)腹瀉3次及以上，且糞便性狀異常者；或出現(xiàn)發(fā)熱，體溫38 ℃以上，伴有頭痛、寒戰(zhàn)、全身乏力等癥狀者；或出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、腹痛，糞便性狀異常者，可為稀便、水樣便、黏液便、膿血便及血便。凡符合以上兩條及以上者，為標(biāo)本留取對(duì)象。2012年1月至2014年12月廣東省第二人民醫(yī)院門診及住院患者糞便標(biāo)本中分離出沙門菌84株。

1.2試劑和儀器血瓊脂平板由梅里埃(上海)生物制品有限公司提供,SBG(磺胺增菌肉湯)、XLD(木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽)培養(yǎng)基和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基由廣州迪景微生物科技有限公司提供，沙門菌屬血清診斷試劑盒購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司，美國(guó)BD公司Phoenix100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀及配套試劑。Seakem Gold瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Cambrex公司；XbaⅠ酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司；CHEF Mapper脈沖場(chǎng)電泳儀和美國(guó)Bio-Rad公司Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng)；Dade Microscan濁度儀購(gòu)自美國(guó)Dade Behring公司。

1.3分離培養(yǎng)及鑒定采集新鮮糞便標(biāo)本，保存于Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中并送至實(shí)驗(yàn)室，接種于SBG磺胺增菌肉湯，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)種于XLD和沙門菌顯色培養(yǎng)基，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取可疑菌落用血清凝集法做初步生化鑒定，結(jié)果符合者送廣東省CDC，復(fù)核APl20E生化鑒定及血清分型。

1.4藥物敏感試驗(yàn)挑取初步生化鑒定符合單菌落，按照美國(guó)BD公司Phoenix100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀操作規(guī)程對(duì)菌落進(jìn)行藥敏鑒定。結(jié)果判定參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute．CLSI)出版的藥物敏感試驗(yàn)指南(2012版)。

1.5PFGE實(shí)驗(yàn)參照美國(guó)PulseNet的沙門菌PFGE的標(biāo)準(zhǔn)操作方法，見(jiàn)文獻(xiàn)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用BioNumerics 4.0軟件處理電泳圖像，聚類分析選擇組間非加權(quán)的幾何平均數(shù)(unweighted pair group method using arithmetic averages，UPGMA)方法，采用基于條帶比較的Dice系數(shù)衡量PFGE帶型之間的相似度，相似度為100%者視為同一PFGE型。

2　結(jié)　果

2.1檢測(cè)情況在收集檢測(cè)的84份沙門菌株中，男女比例差別不大(1.1∶1)，而在季節(jié)分布上以每年的7—10月份為高發(fā)期(見(jiàn)圖1)，人群年齡分布上以5歲以下嬰幼兒為主，占67.86%(57/84)，其次中老年人群比例稍高，大于50歲人群比例為14.29%(12/84)。

圖1　2012—2014年各月份沙門菌檢出率Fig.1　Detection rate of Salmonella in different month in 2012—2014

2.2血清分型結(jié)果對(duì)所有沙門菌進(jìn)行血清分型，84株菌分為20種血清型。沙門菌前3位血清型構(gòu)成比從高到低分別為：鼠傷寒沙門菌占42.86%(36/84)、腸炎沙門菌占15.48%(13/84)、斯坦利沙門菌占8.33%(7/84)。另外羅森沙門菌、韋太夫雷登沙門菌分別為8.33%(7/84)和4.76%(4/84)，見(jiàn)表1。

2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果本次分離沙門菌對(duì)頭孢類抗生素(頭孢他啶、頭孢吡肟和頭孢噻肟)敏感率達(dá)84.21%以上。對(duì)于環(huán)丙沙星與氯霉素的敏感性在66.67%以上，對(duì)于甲氧芐啶與慶大霉素的敏感性50.88%以上。對(duì)于ACSSuT耐藥譜中的幾種抗生素，出現(xiàn)氨芐西林(AMP)、鏈霉素(STR)、磺胺甲二唑(SMX)和四環(huán)素(TCY)多重耐藥，耐藥率在50%～75%之間，而其中的氯霉素(CHL)仍然相對(duì)敏感，但仍有6株鼠傷寒沙門菌出現(xiàn)ACSSuT耐藥譜；有l(wèi)株腸炎沙門菌13ESS1295和1株韋太夫雷登沙門菌14ESS1286對(duì)10種抗生素均耐藥，1種中介。各年齡段的耐藥率并沒(méi)有出現(xiàn)大的差異， 見(jiàn)表2。

表1不同血清型沙門菌的所占百分比

Tab.1Percentage of different Salmonella serotypes

血清型(Serotype)菌株量(No.ofstrains)百分比(Ratio/%)鼠傷寒沙門菌(Typhimurium)3642.86腸炎沙門菌(Enteritidis)1315.48斯坦利沙門菌(Stanley)78.33羅森沙門菌(Rissen)78.33韋太夫雷登沙門菌(Weltevreden)44.76德?tīng)柋吧抽T菌(Derby)22.38倫敦沙門菌(London)22.38豬霍亂沙門菌(Choleraesuis)11.19傷寒沙門菌(Typhi)11.19恩戈?duì)柹抽T菌(Ngor)11.19吉韋沙門菌(Give)11.19雷丁沙門菌(Rding)11.19里定沙門菌(Reading)11.19利奇菲爾德沙門菌(litchfield)11.19比斯拉沙門菌(Bsilla)11.19紐波特沙門菌(Newport)11.19圣保羅沙門菌(Saintpaul)11.19湯卜遜沙門菌(Thompson)11.19新斯托夫沙門菌(Sinstorf)11.19印第安納沙門菌(Indiana)11.19

2.4PFGE試驗(yàn)結(jié)果選取分離的鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、斯坦利沙門菌種共51株分離株使用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切、PFGE 分型并對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行圖譜聚類分型(圖2)。根據(jù)菌株間相似性>100%視為同一PFGE型，51株沙門菌經(jīng)過(guò)聚類分析可分為 42個(gè)PFGE型，相似度在53%～100%之間。其中32株鼠傷寒沙門菌可分為28個(gè)PFGE型，12株腸炎沙門菌可分為10個(gè)PFGE型，7株斯坦利沙門菌可分為5個(gè)PFGE型。鼠傷寒沙門菌中有3株2012年的菌株P(guān)FGE帶型相似性為100%，3株2014年的菌株P(guān)FGE帶型相似性為100%；腸炎沙門菌中2012年的ESS12451菌株與2013年的13ESS1294PFGE帶型相似性為100%，2014年的2株菌株P(guān)FGE帶型相似性為100%。斯坦利沙門菌的2012年的ESS12828株與2014年的14ESS0992株相似性為100%；2014年的2株菌株P(guān)FGE帶型相似性為100%。

3　討　論

據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)細(xì)菌性食物中毒中，70%～80%是由沙門氏菌引起[4]，人們一旦攝入了含有大量沙門氏菌(105～106個(gè)/g)的食物，就會(huì)引起細(xì)菌性感染，進(jìn)而在毒素的作用下發(fā)生食物中毒[4]。廣州市屬于亞熱帶氣候，全年7—10月均較為炎熱，有利于沙門菌的增殖，故這幾個(gè)月的分離率明顯高于其他月份。從菌種來(lái)源人群的年齡結(jié)構(gòu)來(lái)看，5歲以下嬰幼兒構(gòu)成比明顯高于成人，這與嬰幼兒免疫力低下，感染該菌后病情表現(xiàn)嚴(yán)重，大多家長(zhǎng)均會(huì)快速尋求醫(yī)治，而當(dāng)醫(yī)生收治嬰兒病患時(shí)，常做糞便培養(yǎng)有關(guān)。而老年人患病率僅次于嬰幼兒也與其免疫力低下有關(guān)。本次分離的沙門菌血清型以鼠傷寒沙門菌為主，其次為腸炎沙門菌和斯坦利沙門菌。該分布與廣東省歷年整體分布保持一致[5-8]，但與中山市的斯坦利沙門菌所占比例高于腸炎沙門菌有區(qū)別[9]。

表284株沙門菌不同年齡段藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果(%)

Tab.2Antibiotic susceptibility of 84 Salmonella stains in different age groups

age(stain)≤5(57/84)6-20(3/84)20-50(12/84)≥50(12/84)SIRSIRSIRSIRAMP29.820.0070.1833.330.0066.6750.000.0050.0033.330.0066.67CAZ84.213.5112.28100.000.000.0091.678.330.0091.678.330.00CIP71.9317.5410.5366.670.0033.3375.0016.678.3383.3316.670.00CHL68.421.7529.8233.330.0066.6758.3316.6725.0066.678.3325.00CTX84.210.0015.7966.670.0033.33100.000.000.0091.670.008.33FEP87.721.7510.53100.000.000.0091.670.008.3391.670.008.33NAL49.1214.0436.8433.3333.3333.3358.330.0041.6741.670.0058.33SMX24.561.7573.680.000.00100.0016.678.3375.0050.000.0050.00STR19.3022.8157.890.0066.6733.338.3333.3358.3333.3325.0041.67TCY22.811.7575.4433.330.0066.6725.000.0075.0041.678.3350.00TMP54.391.7543.8633.330.0066.6741.670.0058.3366.670.0033.33GEN50.8815.7933.3366.670.0033.3366.670.0033.3358.338.3333.33

注：氨芐西林(AMP)、頭孢他啶(CAZ)、環(huán)丙沙星(CIP)、氯霉素(CHL)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢毗肟(FEP)、萘啶酸(NAL)、磺胺甲二唑(SMX)、鏈霉素(STR)、四環(huán)素(TCY)和甲氧芐啶(TMP)慶大霉素(GEN).

S：敏感(Susceptible) I：中介(Intermediate)R：耐藥(Resistant)

圖2　51株沙門菌PFGE聚類分析圖譜(XbaⅠ內(nèi)切酶)Fig.2　Cluster analysis of 51 stains of Salmonella according to the results of PFGE incised by XbaⅠ

在本次耐藥率分析中出現(xiàn)6株鼠傷寒沙門菌存在ACSSuT耐藥譜；有l(wèi)株腸炎沙門菌13ESS1295和1株韋太夫雷登沙門菌14ESS1286對(duì)10種抗生素均耐藥，1種中介。對(duì)AMP的耐藥率相較于往年[5]有大幅上升，達(dá)到66%以上。對(duì)頭孢毗肟(FEP)的敏感率也下降到90%左右。提示本地區(qū)引起腹瀉的沙門菌耐藥性變得更加嚴(yán)峻，這與世界范圍的沙門菌耐藥趨勢(shì)相同[10]，需要臨床醫(yī)生的重視，在早期經(jīng)驗(yàn)性用藥的基礎(chǔ)上，根據(jù)藥敏結(jié)果合理使用抗生素。

近年來(lái)，隨著基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)各種流行菌株監(jiān)測(cè)的方法逐步發(fā)生改變，然而PFGE分型技術(shù)仍被廣泛地應(yīng)用于我國(guó)各級(jí)別疾控中心對(duì)細(xì)菌的分子流行病學(xué)研究，其優(yōu)點(diǎn)具有能夠?qū)φ麄€(gè)染色體進(jìn)行分析、重復(fù)性好、易于標(biāo)準(zhǔn)化等[11]。在本次研究中，51株沙門菌經(jīng)過(guò)聚類分析可分為42個(gè)PFGE型，相似度在53%～100%之間，表現(xiàn)為較大的遺傳多樣性。對(duì)于相似度100%的菌株溯源及病例分析，并沒(méi)有同源性暴發(fā)的證據(jù)，且這些菌株的耐藥譜并不存在明顯關(guān)聯(lián)性，這可能是由于菌株耐藥基因發(fā)生突變位點(diǎn)并不在以XbaⅠ為酶切基礎(chǔ)的PFGE 酶切位點(diǎn)上，導(dǎo)致耐藥情況無(wú)法從分型中表現(xiàn)出來(lái)。

對(duì)PFGE結(jié)果的分析，不同研究者可出現(xiàn)較大差異。Tenover等在解釋PFGE結(jié)果時(shí)，將具有85%以上相同條帶的菌株認(rèn)為是相同的菌株，50%以上的條帶不相同時(shí)，菌株被認(rèn)為流行病學(xué)不相關(guān)。這是因?yàn)榧?xì)菌存在高度變異性，他們認(rèn)為在判斷是否同一菌株時(shí)允許存在一定的變異[12]。這一觀點(diǎn)在現(xiàn)在的一些畜牧業(yè)食源性肉類研究中被使用[11]。因此，在基因技術(shù)高速發(fā)展的背景下，更加精確標(biāo)準(zhǔn)化的溯源監(jiān)測(cè)方案亟待完善。

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Characterization of antimicrobial resistances and molecular characteristics of 84 strains ofSalmonella

LIN Mao-rui，ZHOU Xuan，LI Ming-you，HUANG Ji-wei，LIU Gui-zhi，CAO Dong-lin

(Departmentoflaboratory,thesecondPeoplesHospitalofGuangdong,Gungzhou510317,China)

A total of 84Salmonellaisolates，from part of Guangzhou，2012-2014，were detected with serum agglutination and antibiotic susceptibility to investigate the antimicrobial resistance. Results were assessed by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI，2012). The 51Salmonellastrains were tested by pulse field gel electrophoresis (PFGE). Bionumerics software was used to analyze the PFGE results in order to determine the correlation between differentSalmonellastrains. Results showed thatSalmonellainfections were found in all age groups and children under 5 years old accounted for the major proportion (67.86%)，with the gender ratio at 1.1∶1. A total of 84Salmonellastrains were divided into 20 serotypes. The top three wereSalmonellatyphimurium(42.86%)，Salmonellaenteritidis(15.48%) andSalmonellastanley(8.33%). Over 84.21% ofSalmonellawere sensitive to Cephalosporin，66.67% to Ciprofloxacin (CIP) and Chloramphenicol (CHL)，50.88% to Trimethoprim (TMP) and Gentamicin (GEN). However，there still were many strains showed multidrug resistance. The 51Salmonellastrains were divided into 42 PFGE types，showing great genetic diversity. We emphasized that antibiotics should be chosen reasonably and prudently based on antimicobial sensitivity testing. There is no significant correlation betweenSalmonellaresistance patterns and PFGE types in our survey.

Salmonella; antimicrobial resistance; pulsed-field gel electrophoresis

Cao Dong-lin，Email: caodl@126.com

曹東林，Email：caodl@126.com

廣東省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州510317

R378.2

A

1002-2694(2016)06-0553-05

2015-08-13；

2015-12-22

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.009

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(No.C2012036)和2013年度廣東省級(jí)財(cái)政技術(shù)研究開(kāi)發(fā)與推廣應(yīng)用專項(xiàng)資金(粵財(cái)工[2013]401號(hào))聯(lián)合資助