強治全梁雅珺于正陽杜 婭張 帥朱維寧張林生，*

1西北農林科技大學生命科學學院 / 旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室， 陜西楊凌712100；2西北大學生命科學學院， 陜西西安710069

小麥wzy2-1基因的克隆及功能分析

強治全1梁雅珺1于正陽1杜 婭1張 帥1朱維寧2張林生1，*

1西北農林科技大學生命科學學院 / 旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室， 陜西楊凌712100；2西北大學生命科學學院， 陜西西安710069

脫水素是一類植物胚胎發(fā)育后期豐富蛋白（late embryogenesis abundant protein， LEA蛋白）， 屬于LEA D-11家族，植物受非生物脅迫會大量表達。利用同源克隆技術， 從鄭引1號小麥中克隆了1個Kn型脫水素基因， 命名為wzy2-1。該基因全長1740 bp， 編碼579個氨基酸， 含有9個保守的K片段， 與大麥的Dhn5基因具有較高同源性。生物信息學預測該蛋白屬于高度親水性的無序蛋白。通過該蛋白對大腸桿菌的保護作用研究表明， WZY2-1蛋白能夠提高大腸桿菌對低溫、高溫、高鹽以及高滲脅迫的耐受性。熒光實時定量PCR分析表明， wzy2-1基因受低溫、鹽漬、干旱誘導表達， 但不受外源ABA誘導， 說明wzy2-1基因屬于非ABA依賴型脫水素基因。

小麥； 脫水素； 熒光實時定量PCR； 原核表達

植物賴以生存的環(huán)境并不總是適合植物生長。干旱、鹽漬、低溫、高溫等都會影響植物生長發(fā)育， 嚴重時會導致植物死亡。為了適應各種逆境脅迫， 植物在進化過程中，已經形成了多種生理生化機制， 以抵御不利環(huán)境因素， 通常在逆境脅迫下， 植物會積累一系列逆境相關蛋白， 如胚胎發(fā)育后期豐富蛋白（late embryogenesis abundant protein，LEA）、分子伴侶、解毒酶等［1］。其中， LEA蛋白對提高植物的逆境脅迫耐受性具有非常重要的作用。

LEA蛋白是胚胎發(fā)生后期大量積累的一類蛋白， 最早發(fā)現于胚胎發(fā)育后期的棉花子葉中［2］。LEA蛋白的共同特點是含有大量極性氨基酸， 其中賴氨酸和甘氨酸含量最高， 具有較強的親水性和熱穩(wěn)定性［3］。LEA蛋白是一大類逆境響應蛋白， 根據 LEA蛋白氨基酸序列的同源性分為6個家族， 即LEA-D19 （1族）、LEA-D11 （2族， 又稱脫水素）、LEA-D7 （3族）、LEA-D113 （4族）、LEA-D29 （5族）和LEA-D95 （6族）， 后兩族為附加族［4］。

脫水素屬于LEA2家族， 是目前研究較為深入的一類LEA蛋白［5］， 根據脫水素保守序列， 可以分為 YnSKm、Kn、KnS、SKn和YnKm共5個亞類。該類蛋白的特點是含有3個保守的區(qū)域， 分別是K、Y和S片段。其中， K片段富含賴氨酸， 是所有脫水素共有的， 一般由 15個氨基酸殘基組成（EKKGIMDKIKEKLPG）［6］； K片段可以形成兩親性的α-螺旋， 在植物失水情況下， 兩親性的α-螺旋可以保持細胞膜和細胞內蛋白的穩(wěn)定性［7］。S片段是一段富含絲氨酸的保守序列（SSSSSS）， 可被磷酸化， 并可能與脫水素的入核有關［8-9］。Y片段的保守序列為（VT）DEYGNP，但目前尚不清楚其功能。除了這3個保守的序列外， 脫水素還有另外一些保守區(qū)域， 這些區(qū)域富含極性氨基酸， 稱作Φ片段， 通常分布于K片段之間， 可能與參與細胞質組分的相互作用有關［10］。

近些年對于脫水素的研究有了許多重要發(fā)現。將小麥DHN5 （YSK2）轉入大腸桿菌中， 發(fā)現 DHN5可以提高大腸桿菌的耐逆性， 這可能與 DHN5可以防止大腸桿菌體內的蛋白聚集有關， 并且發(fā)現DHN5能夠保護LDH酶和葡萄糖苷酶的活性［11-12］。通過對小麥WZY2和DHN5 K片段的缺失， 發(fā)現K片段在提高大腸桿菌耐逆性和LDH等酶活保護中起著最主要的作用［13］。當植物遭受低溫、干旱、鹽漬等逆境時， 體內會大量積累脫水素蛋白， 例如，小麥 WCOR410［14］、擬南芥 COR15［15］、馬鈴薯 CI7［16］均可響應低溫脅迫； 大麥DHN5可以響應干旱、低溫和鹽漬脅迫［17］； 對辣椒的CaDHN1研究表明， CaDHN1可以響應低溫、鹽和水楊酸脅迫， 但不響應ABA誘導［18］。本研究通過同源克隆， 從鄭引1號小麥中成功克隆了小麥Kn型脫水素基因wzy2-1， 對其進行生物信息學分析， 并且研究了不同脅迫下的wzy2-1表達模式以及WZY2-1蛋白對大腸桿菌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料和脅迫處理

小麥品種鄭引1號， 由西北農林科技大學生命科學學院中心實驗室提供。將小麥種子經 75%酒精消毒 2 min，蒸餾水浸泡6 h， 置培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光/暗16 h/ 8 h， 晝/夜溫度25℃/19℃。當小麥長到二葉一心期時， 分別進行干旱（10%的PEG-6000）、低溫（4℃培養(yǎng)箱）、鹽（500 mmol L-1NaCl溶液）和外源ABA （100 μmol L-1ABA溶液）處理。在處理0、12、24、36、48和60 h取樣， 液氮速凍后保存于-80℃。

1.2 小麥RNA的提取及反轉錄合成cDNA

取干旱處理 2 d小麥葉片， 在液氮中研磨， 按照TRIzol試劑（Invitrogen）的操作說明， 提取小麥幼苗總RNA。以提取的 RNA 為模板， 按照反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （TaKaRa）的操作說明反轉錄成cDNA。

1.3 目的基因全長cDNA克隆

根據大麥 DNH5 （GenBank登錄號為 AF181455）的cDNA序列設計引物（F1： 5′-ATGCACGACGCCGAC-3′；R1： 5′-TTAGTTCAGTCCAGGC-3′）， 以小麥cDNA為模板進行 PCR擴增。反應體系 20 μL， 包含 2×Taq PCR Supermix （全式金公司） 8 μL， cDNA模板1 μL， 上、下游引物各1 μL， ddH2O 9 μL。PCR反應參數為94℃預變性5 min；94℃ 30 s， 63℃ 30 s， 72℃ 1 min， 35個循環(huán)； 72℃ 10 min。將擴增產物回收（天根公司）， 連接到pMD18-T載體上，轉化TOP10感受態(tài)細胞， 涂板， 挑單克隆， 菌液PCR檢測，送3個陽性菌落到上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 目的基因的生物信息學分析

利用DNAMAN分析wzy2-1基因序列及蛋白序列； 通過 Blast， 利用 MEGA5.0對 wzy2-1進行同源性分析。利用ExPAsy軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）對WZY2-1蛋白進行疏水性預測； 利用 Metaprediction軟件（http：// iimcb.genesilico.pl/metadisorder/metadisorder.html）對 WZY2-1蛋白無序化程度進行分析［13，19］。

1.5 目的基因的原核表達及Western blot驗證

設計含有 Xho I和 BamH I酶切位點的引物（F：5′-CGCGGATCCATGCACGACGCCGAC-3′； R： 5′-CCGCT CGAGTTAGTTCAGTCCAGGC-3′）， 以 pMD18-T-wzy2-1質粒為模板進行 PCR擴增， 回收產物， 然后對產物和pET28a質粒酶切。酶切體系20 μL， 含PCR產物或pET28a質粒10 μL， Xho I 1 μL， BamH I 1 μL， 10×K buffer 2 μL，ddH2O 6 μL。將酶切產物進行膠回收， 再將回收的 PCR產物和pET28a質粒進行16℃連接， 轉化TOP10感受態(tài)細胞， 涂板， 挑單克隆， 雙酶切檢測， 選 3個陽性菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

將構建好的原核表達載體pET28a-wzy2-1轉入大腸桿菌BL21 （DE3）， 經0.2 mmol L-1IPTG誘導0、2、4、6、8 h， 收集3 mL菌體， 10 000×g離心2 min， 加入1 mol L-1Tris-HCl 100 μL和 2×蛋白loading buffer 100 μL， 在沸水浴中煮10 min， 冰上冷卻， 10 000×g離心10 min， 取上清液10 μL進行SDS-PAGE檢測， 并且用K片段抗體進一步驗證［20-21］。

1.6 WZY2-1蛋白對大腸桿菌的耐逆性實驗

將轉 pET28a-wzy2-1和 pET28a空載體的大腸桿菌BL21 （DE3）接種到50 mL液體LB中， 于37℃搖床培養(yǎng)至OD值為0.6， 再加入0.2 mmol L-1IPTG誘導2 h。取該誘導菌液1 mL， 加入含10% PEG-6000、500 mmol L-1NaCl 或500 mmol L-1KCl的50 mL液體LB中， 測定波長600 nm下每小時的菌液OD值， 以無處理的菌液作對照。

采用涂板技術法進行目的基因表達蛋白對大腸桿菌的溫度耐逆性分析。對IPTG誘導2 h的重組菌和空菌進行45℃ 30 min或者-20℃ 2 h的處理， 然后稀釋1000倍，于37℃過夜， 統計菌落數， 以無脅迫處理作對照， 計算菌存活率［11，22］。

1.7 不同脅迫處理的實時定量PCR分析

提取不同處理的小麥樣品 RNA， 以小麥 β-actin （KC775780.1）為內參基因進行定量RT-PCR分析。引物序列為wzy2-1-F： 5′-CGGAGTGACCGATAAGG-3′， wzy2-1-R： 5′-TGCCAGTTGTTTCGTTGT-3′； actin-F： 5′-TCCAATC TAGGGATACACGC-3′， actin-R： 5′-TCTTCATTAGATTAT CCGTGAGGTC-3′。反應體系25 μL， 包括2×SYBR Premix 12.5 μL， 模板2 μL， 上、下游引物各1 μL。反應程序為95℃預變性30 s， 然后95℃ 5 s， 55℃， 20 s， 39個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 目的基因的克隆

以干旱處理 24 h的小麥 RNA為模板， 反轉錄得到cDNA， 利用合成的特異引物F1/R1擴增得到1740 bp的產物?；厥赵摦a物， 并連接到pMD18-T載體上， 轉入大腸桿菌 TOP10中。通過對陽性菌落測序， 得到完整開放閱讀框序列， 定名為wzy2-1基因， 提交到GenBank， 登錄號為KU230444。

2.2 wzy2-1基因的生物信息學分析

利用 DNAMAN軟件分析表明， wzy2-1編碼產物由579個氨基酸組成， 其分子量約為60.3 kD， 等電點為5.8；該蛋白含有9個保守的K片段基序， 屬于典型的Kn型脫水素（圖1）。利用MEGA5.0構建了wzy2-1基因的系統進化樹， 發(fā)現wzy2-1和大麥的脫水素基因Dhn5具有較高的同源性（圖 2）。利用 ExPAsy軟件（http：//web.expasy.org/ protscale/）分析表明， WZY2-1蛋白平均疏水系數為-1.307（圖3）， 具有較強的親水性。用Metprediction （http：//iimcb. genesiico.pl/metadisorder/metadisorder.html）軟件分析表明，WZY2-1蛋白是無序狀蛋白（圖 4）。以上結果顯示，WZY2-1蛋白在生理條件下是一種高度親水性的無序蛋白， WZY2-1蛋白屬于IDPs家族。

圖1 wzy2-1基因編碼的氨基酸序列Fig. 1 Amino acid sequence of wzy2-1 gene

2.3 wzy2-1基因的原核表達以及Western blot驗證

構建了pET28a-wzy2-1原核表達載體， 并用0.2 mmol L-1IPTG誘導重組菌 BL21 （DE3）， 通過對熱溶性蛋白SDS-PAGE電泳檢測， 發(fā)現在100 kD附近有一條帶， 比預測的結果偏大， 這可能是 K片段與蛋白膠的特殊作用導致電泳條帶略滯后移。Western blot驗證結果顯示， 該條帶是WZY2-1重組蛋白（圖5）。

圖2 小麥wzy2-1基因編碼區(qū)與多種植物脫水素基因的遺傳進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of wzy2-1 and other dehydrin genes from different plant species

圖4 WZY2-1蛋白無序化程度預測Fig. 4 Disorder prediction of WZY2-1 protein

圖5 用K片段抗體進行Western blot驗證Fig. 5 Western blot with K-fragment antibody

2.4 WZY2-1蛋白對大腸桿菌的耐逆性

在正常條件下， 重組菌和對照菌生長情況基本一致，但在10% PEG-6000、500 mmol L-1NaCl和500 mmol L-1KCl處理后， 重組菌表現出較好的生長趨勢（圖 6）， 說明WZY2-1蛋白能夠提高大腸桿菌對逆境脅迫的耐受性。分別將對照菌和重組菌進行45℃ 30 min和-20℃ 2 h處理，結果表明， 重組菌的存活率顯著高于對照菌（圖 7）， 說明重組菌對溫度脅迫有較高的耐受性。

圖6 不同處理條件下重組菌（wzy2-1）和對照菌（Epet）的生長曲線Fig.6 Growth of recombinant （wzy2-1） and control E. coli （Epet） under different treatments

圖7 重組菌（wzy2-1）和對照菌（Epet）在經45℃ 30 min和-20℃2 h處理后的存活率Fig. 7 Survival rate of recombinants （wzy2-1） and control E.

2.5 不同脅迫處理下wzy2-1表達的定量RT-PCR分析

在冷脅迫處理下， wzy2-1基因表達量在12 h達到最高，為對照的30倍； 在鹽脅迫處理下， wzy2-1基因的表達量在36 h達到最高， 是對照的30倍； 然而在干旱脅迫下， 直到48 h wzy2-1的表達量才達到峰值， 是對照的8倍（圖8）。同時還發(fā)現， 在 ABA處理條件下， wzy2-1基因表達量在60 h內沒有明顯上調的趨勢（圖8）。推測wzy2-1基因屬于非ABA依賴型的冷、滲透、干旱響應的脫水素基因。

圖8 不同脅迫處理下小麥葉片wzy2-1基因的表達模式Fig. 8 Transcript accumulation of wzy2-1 in wheat leaves in response to different abiotic stresses as determined by qRT-PCR

3 討論

植物在生長過程中會產生一系列應對非生物脅迫的機制， 像上調某些基因的表達以適應外界多變的環(huán)境。LEA蛋白就是其中之一， 它能夠提高植物對干旱、鹽漬、低溫等逆境脅迫的耐受性。脫水素具有的 K片段能形成A2型雙親性 α-螺旋， 能與囊泡膜、酸性磷脂、磷脂雙分子層結合， 提高細胞膜的穩(wěn)定性， 提高植物對不利環(huán)境的耐受性［24-26］。小麥wzy2-1基因含有9個保守的K片段， 分子量為60.3 kD， 等電點為5.8， 屬于Kn型酸性脫水素。具有較強的親水性和高度的無序化， 這種高度親水性的無序蛋白在細胞失水情況下表達， 對于細胞水分子有較強的束縛能力， 以利保護細胞免于逆境下過度失水而發(fā)生膜的損傷［27］。

研究表明， 脫水素可能具有分子伴侶、防凍劑、離子緩沖劑、膜的穩(wěn)定劑、抗氧化劑等功能［21］。本實驗結果表明， WZY2-1蛋白能夠提高大腸桿菌對低溫、高溫、高鹽以及高滲脅迫的耐受性（圖6和圖 7）， 脫水素能夠提高大腸桿菌對逆境脅迫的耐受性， 這為后續(xù)轉基因相關研究奠定了基礎。

植物響應非生物脅迫依賴于一系列的信號途徑， 包括ABA依賴型和非ABA依賴型［23，28-29］。在本研究中， 低溫、干旱、鹽漬脅迫處理誘導 wzy2-1基因上調表達， 但是基因對各脅迫處理的敏感程度不盡相同。低溫脅迫12 h wzy2-1基因表達至峰值， 而鹽脅迫 36 h基因表達才到峰值； 干旱脅迫48 h， 基因表達量比對照上調8倍， 與低溫和鹽脅迫上調 wzy2-1表達量 30倍有較大差距?？梢?，wzy2-1對各種脅迫的敏感程度為低溫＞鹽漬＞干旱。這與以前報道結果相似， 即Kn型脫水素主要響應低溫脅迫［17，30］。ABA處理60 h未引起wzy2-1基因表達量明顯變化（圖8）， 因此我們認為， wzy2-1可能屬于非ABA依賴型脫水素基因。

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Cloning and Functional Analysis of wzy2-1 Gene in Wheat

QIANG Zhi-Quan1， LIANG Ya-Jun1， YU Zheng-Yang1， DU Ya1， ZHANG Shuai1， ZHU Wei-Ning2， and ZHANG Lin-Sheng1，*1College of Life Science / State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas， Northwest A&F University， Yangling 712100， China；2College of Life Science， Northwest University， Xi’an 710069， China

Dehydrins （DHNs） are identified as the group II of LEA proteins and involved in plant abiotic stress tolerance. In this study， we isolated a novel Kn-type dehydrin gene from wheat cultivar Zhengyin 1， which was designated wzy2-1. The full length of wzy2-1 is 1740 bp， encoding 579 amino acids and containing nine conserved K-fragments. Sequence alignment indicated that wzy2-1 had high homology to Dhn5 gene in Hordeum vulgare. The WZY2-1 protein was predicted to be a highly-hydrophilic and disordered protein. The WZY2-1 protein was successfully expressed in E. coli strain BL21 （DE3）. We found that WZY2-1 protein improved the tolerance to low or high temperature， salt and osmotic stresses in E. coli. The qRT-PCR assay indicated that the expression of wzy2-1 gene was induced by low temperature， PEG， and salt stresses rather than ABA. Thus， we conclude that wzy2-1 is an ABA-independent gene.

Wheat； Dehydrins； Real-time PCR； Procaryotic expression

10.3724/SP.J.1006.2016.01253

本研究由高等學校博士學科點專項科研基金項目（20120204110033）和旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室基金項目（CSBAA2015007）資助。This study was supported by the Projects for Doctoral Research Funding in Higher Education Institutions Function and Structure of Dehydrin Protein in Different Water Content （20120204110033） and the Foundation of State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas of Northwest A&F University （CSBAA2015007）.
*

（Corresponding author）： 張林生， E-mail： linszhang@nwsuaf.edu.cn， Tel： 029-87092379

聯系方式： E-mail： qiangsir0934@qq.com
Received（

）： 2016-01-23； Accepted（接受日期）： 2016-05-09； Published online（網絡出版日期）： 2016-06-02.
URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160602.1442.010.html