芥子氣經腹腔和氣管致大鼠急性肺損傷細胞凋亡的變化*

祝筱姬，朱雙雙，韓瑋，貝媛媛，鐘玉緒，劉菲，王濤，趙超，趙建

（1.解放軍第89醫(yī)院 呼吸科，山東 濰坊 261021；2.濰坊醫(yī)學院 研究生處，山東 濰坊 261042；3.軍事醫(yī)學科學院 毒物藥物研究所，北京 100850；4.解放軍第89醫(yī)院 病理科，山東 濰坊 261021；5.解放軍第89醫(yī)院 檢驗科，山東 濰坊 261021）

論著

芥子氣經腹腔和氣管致大鼠急性肺損傷細胞凋亡的變化*

祝筱姬1，朱雙雙2，韓瑋1，貝媛媛2，鐘玉緒3，劉菲1，王濤4，趙超5，趙建3

（1.解放軍第89醫(yī)院 呼吸科，山東 濰坊 261021；2.濰坊醫(yī)學院 研究生處，山東 濰坊 261042；3.軍事醫(yī)學科學院 毒物藥物研究所，北京 100850；4.解放軍第89醫(yī)院 病理科，山東 濰坊 261021；5.解放軍第89醫(yī)院 檢驗科，山東 濰坊 261021）

目的經腹腔和氣管建立大鼠芥子氣（S M）急性肺損傷動物模型，比較兩種大鼠急性肺損傷模型細胞凋亡的差異。方法選取S p r a g u e D aw l ey大鼠136只，隨機分為5組，正常對照組8只，其他4個組為腹腔S M組、腹腔丙二醇對照組、氣管S M組、氣管丙二醇對照組，每組32只。腹腔S M組腹腔內注入稀釋的S M 0.1m l（0.96 L D50=8m g/k g），氣管S M組氣管內注入稀釋的S M 0.1m l（0.98 L D50=2m g/k g），正常對照組未做任何處理。采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d U T P缺口末端標記測定法（T U N EL）染色和免疫組織化學法及電鏡觀察，判斷細胞凋亡情況。結果①腹腔S M組各時間段肺泡間隔T U N EL染色陽性細胞表達率較氣管S M組增多（P＜0.05）。②腹腔S M組各時間段肺泡間隔凋亡蛋白Ba x陽性表達率較氣管S M組升高（P＜0.05）；腹腔S M組各時間段肺泡間隔凋亡蛋白B c l-2陽性表達率較氣管S M組降低（P＜0.05）。③腹腔S M組各時間段肺泡間隔凋亡蛋白酶C a s pa s e-3、C a s pa s e-9陽性表達率較氣管S M組增多（P＜0.05）。④電鏡顯示，染毒72 h，腹腔S M組和氣管S M組Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮凋亡細胞形態(tài)特征為上皮細胞膜附著的微絨毛斷裂缺失，排列紊亂；線粒體嵴模糊，粗面內質網表面附著的核糖體脫離，并游離于細胞質中。結論S M經腹腔和氣管染毒致大鼠急性肺損傷，通過內源性通道引發(fā)細胞凋亡調節(jié)異常，S M經腹腔染毒大鼠各項細胞凋亡指標比經氣管明顯升高，推測可能與S M腹膜腔的快速吸收有關。

芥子氣；肺損傷；細胞凋亡

芥子氣（s u l fu r m u stard，S M）是一種最常用的化學武器，據(jù)統(tǒng)計其致傷率占所有化學武器的80%［1］。S M的主要靶器官是皮膚、肺、眼睛，其死亡率主要來自肺損傷和呼吸道病變［2］。S M中毒的病理生理機制相當復雜，涉及DN A和蛋白質烷化、酶功能失調、基因表達改變、氧自由基產生過剩和能量耗竭，導致細胞周期受阻，細胞凋亡或死亡，且所有階段均伴隨炎癥反應［3］。S M誘導肺損傷與細胞凋亡密切相關，且細胞凋亡是S M誘導肺損傷的重要機制之一［4］。動物實驗表明，S M經口服、皮膚、皮下、靜脈、腹腔、氣管途徑均可致急性肺損傷，并且具有時間和劑量依賴性［1］。本實驗通過建立高劑量S M經腹腔和氣管途徑致大鼠急性肺損傷模型，探討其細胞凋亡的細胞和分子機制，為將來的干預性治療奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗試劑與儀器

1，2-丙二醇溶液由天津致遠化學有限公司提供，羊血清由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，微波緩沖液自配，試劑由北京化工廠提供，R oche細胞凋亡試劑由瑞士羅氏生物科技公司提供，B a x、B cl-2、活化的胱天蛋白酶（C aspase）-3、C aspase-9試劑盒由北京博奧森生物技術有限公司提供，H-7500型透射電鏡由日本日立公司提供。

1.2實驗動物與分組

健康雄性S pra g u e Da w ley大鼠（S P F級，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，合格證號：0015902）136只，體質量280～300 g，年齡15周。

將大鼠分為腹腔S M組（32只）、腹腔丙二醇組（32只）、氣管S M組（32只）、氣管丙二醇組（32只）、正常對照組（8只）。S M液（純度＞90%）臨用前用丙二醇稀釋至所需濃度。①氣管途徑染毒動物模型建立：實驗前氣管S M組和氣管丙二醇組皮下注射阿托品（0.05m g/k g），30min后腹腔內注射鹽酸氯胺酮（100m g/k g）實施麻醉，氣管內注入稀釋的S M 0.1ml （0.98L D50=2m g/k g），氣管丙二醇組注入丙二醇0.1ml。②腹腔途徑染毒動物模型建立：同上方法實施麻醉。腹腔S M組大鼠腹腔內注入稀釋的S M 0.1ml（0.96 L D50=8m g/k g），腹腔丙二醇組注入丙二醇0.1ml。正常對照組未做任何處理。

1.3觀察指標

1.3.1制備石蠟切片與電鏡觀察收集大鼠肺組織標本共136份，10%中性福爾馬林溶液固定標本24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色法（hemato x ylin-eosin stainin g，H E）染色，光鏡觀察。制備超薄切片：取新鮮標本1mm3，用3%戊二醛液固定標本，別在70%、80%、90%和100%丙酮梯度脫水15min，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鈾鉛染色，透射電鏡觀察。

1.3.2末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d U T P缺口末端標記測定（t e r m in a l-d e o x y n u c l e o i t i d y l tr a ns f e r a s e m e d i a t e d ni c k e n d l a b e l ing，T U N EL）法標記凋亡細胞4μm石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，0.3%雙氧水H202處理10min；1∶200的P roteinase K稀釋液消化10min；標記緩沖液末端轉移酶（terminal deo x yn u cleotidyl trans f erase，TdT）和異羥基洋地黃毒苷配基標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（di g o x i g enin-deo x y u ridine triphosphate，D IG-d U T P）各1μl，加入18μl標記緩沖液，每片20μl，37℃標記2 h。封閉液每片50μl，室溫處理30min。抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，每片50μl，37℃孵育30min。抗體稀釋液l∶100稀釋鏈霉親和素-生物素復合物，每片50μl，37℃孵育30min。新鮮配制二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色20min，蘇木素復染，0.01mol三羥基甲胺-鹽酸緩沖鹽溶液（Tris-H C l b uff er saline，T B S）終止反應，甘油明膠封片。以不加TDT酶作陰性對照，已知陽性切片作陽性對照組。

1.3.3凋亡蛋白Ba x和B c l-2檢測免疫組織化學法檢測凋亡蛋白B a x和B cl-2的表達。石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，抗原修復，滴加兔抗大鼠B a x和B cl-2單克隆抗體20μl/片，再滴加二抗，三乙烯二胺（triethylene diamine，D A B C）顯色，蘇木精襯染，常規(guī)樹脂封片。磷酸緩沖鹽溶液（phosphate b uff er saline，P B S）代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照組。

1.3.4C a s pa s e-3和C a s pa s e-9檢測免疫組織化學法檢測C aspase-3和C aspase-9的表達。石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，抗原修復，滴加兔抗大鼠C aspase-3和C aspase-9單克隆抗體20μl/片，再滴加二抗，D A B C顯色，蘇木精襯染，常規(guī)樹脂封片。P B S代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照組。

1.3.5顯微圖像分析采用I ma g e-P ro P l u s 6.0病理細胞圖像分析系統(tǒng)，將各組T U NE L標記及B a x、B cl-2、C aspase-3、C aspase-9免疫組織化學法染色切片行圖像分析，選取測量參數(shù)，測定陽性率和強陽性率，每間隔1個高倍視野（400倍）選取1個視野進行觀察，每張切片觀察≥5個高倍視野，計算其肺泡間隔陽性細胞比率，肺泡間隔陽性細胞比率=5個高倍視野的陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%，并計算其平均值。

1.4統(tǒng)計學方法

采用S P SS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±平均差（x±s）表示，多組間比較用重復測量的多因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1大鼠肺泡間隔細胞凋亡情況

2.1.1T U N EL染色腹腔S M組6和24 h肺泡間隔凋亡細胞呈帶狀分布，48 h肺泡間隔凋亡細胞聚集成簇，72 h肺泡間隔凋亡細胞呈團簇狀；氣管S M 組6、24、48和72 h肺泡間隔細胞凋亡聚集成簇；丙二醇和正常對照組凋亡細胞呈零星分布（見圖1）。5組不同時間的細胞凋亡陽性表達率比較，采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析結果：①腹腔和氣管S M組不同時間的細胞凋亡陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=18.479，P=0.000）。②腹腔S M組與其他4組的細胞凋亡陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F= 1 318.654，P=0.000）。③腹腔S M組與氣管S M組的細胞凋亡陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.623，P=0.000），呈遞增趨勢（見圖2、3）。

2.1.2Ba x免疫組織化學法腹腔和氣管S M組6 h肺泡間隔凋亡蛋白B a x陽性表達呈帶狀分布，24 h肺泡間隔凋亡蛋白B a x陽性表達聚集成簇，48和72h肺泡間隔凋亡蛋白B a x陽性表達呈團簇狀；丙二醇和正常對照組肺泡間隔凋亡蛋白B a x陽性表達呈零星分布（見圖4）。5組不同時間的細胞凋亡陽性表達率比較，采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析結果：①腹腔和氣管S M組不同時間的細胞凋亡陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=23.202，P=0.000）。②腹腔S M組與其他4組的細胞凋亡陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=490.828，P=0.000）。③腹腔S M組與氣管S M組的細胞凋亡陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.031，P=0.000），呈遞增趨勢（見圖5、6）。

圖1　大鼠肺泡間隔TUN E L染色 （×400）

圖2　5組大鼠肺泡間隔TUN E L染色細胞凋亡陽性表達率不同時間的變化趨勢

圖3　大鼠肺泡間隔TUN E L染色陽性細胞表達率

2.1.3B c l-2免疫組織化學法腹腔和氣管S M組6 h肺泡間隔凋亡蛋白B cl-2陽性表達呈團簇狀，24 h肺泡間隔凋亡蛋白B cl-2陽性表達聚集成簇，48和72 h肺泡間隔凋亡蛋白B a x陽性表達呈帶狀分布。丙二醇和正常對照組肺泡間隔凋亡蛋白B cl-2陽性表達呈零星分布（見圖7）。5組不同時間的細胞凋亡陽性表達率比較，采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析結果：①腹腔和氣管S M組不同時間的細胞凋亡陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=211.833，P=0.000）。②腹腔S M組與其他4組的細胞凋亡陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=617.955，P=0.000）。③腹腔S M組與氣管S M組的細胞凋亡陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=134.574，P=0.000），呈遞減趨勢（見圖8、9）。

圖4　大鼠肺泡間隔凋亡蛋白Ba x表達 （×400）

圖5　5組大鼠肺泡間隔凋亡蛋白Ba x陽性表達率不同時間的變化趨勢

圖6　大鼠肺泡間隔凋亡蛋白Ba x陽性表達率

2.1.4C a s pa s e-3免疫組織化學法腹腔和氣管S M 組6 h肺泡間隔凋亡細胞C aspase-3陽性表達呈帶狀分布，24 h肺泡間隔凋亡細胞C aspase-3陽性表達聚集成簇，48和72 h肺泡間隔凋亡細胞C aspase-3陽性表達呈團簇狀。丙二醇和正常對照組肺泡間隔凋亡細胞C aspase-3陽性表達呈零星分布（見圖10）。5組不同時間的細胞凋亡陽性表達率比較，采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析結果：①腹腔和氣管S M組不同時間的細胞凋亡陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=34.201，P=0.000）。②腹腔S M組與其他4組的細胞凋亡陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=759.817，P=0.000）。③腹腔S M組與氣管S M組的細胞凋亡陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=18.073，P=0.000），呈遞增趨勢（見圖11、12）。

圖7　大鼠肺泡間隔凋亡蛋白B c l-2表達 （×400）

圖8　5組大鼠肺泡間隔凋亡蛋白B c l-2陽性表達率不同時間的變化趨勢

圖9　大鼠肺泡間隔凋亡蛋白B c l-2陽性表達率

圖10　大鼠肺泡間隔Caspase-3表達 （×400）

圖11　5組大鼠肺泡間隔凋亡細胞Caspase-3陽性表達率不同時間的變化趨勢

圖12　大鼠肺泡間隔凋亡細胞Caspase-3陽性表達率

2.1.5C a s pa s e-9免疫組織化學法腹腔和氣管S M組6 h肺泡間隔凋亡細胞C aspase-9陽性表達呈帶狀分布，24 h肺泡間隔凋亡細胞C aspase-9陽性表達聚集成簇，48和72 h肺泡間隔凋亡細胞C aspase-9陽性表達呈團簇狀。丙二醇和正常對照組肺泡間隔凋亡細胞C aspase-9陽性表達呈零星分布（見圖13）。5組不同時間的細胞凋亡陽性表達率比較，采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析結果：①腹腔和氣管S M組不同時間的細胞凋亡陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=24.755，P=0.000）。②腹腔S M組與其他4組的細胞凋亡陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=2 087.109，P=0.000）。③腹腔S M組與氣管S M組的細胞凋亡陽性表達率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=10.844，P=0.000），呈遞增趨勢（見圖14、15）。

2.2大鼠肺泡上皮細胞的超微結構變化

染毒72 h，腹腔和氣管S M組大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮凋亡細胞形態(tài)特征：上皮細胞膜附著的微絨毛斷裂缺失，排列紊亂；線粒體嵴模糊，粗面內質網表面附著的核糖體脫離，并游離于細胞質中，細胞核染色質正常。丙二醇和正常對照組肺泡上皮形態(tài)：細胞膜、線粒體、粗面內質網、細胞核染色質正常。見圖16。

圖13　大鼠肺泡間隔Caspase-9表達 （×400）

圖14　5組大鼠肺泡間隔凋亡細胞Caspase-9陽性表達率不同時間的變化趨勢

圖15　大鼠肺泡間隔凋亡細胞Caspase-9陽性表達率

圖16　大鼠肺泡上皮細胞超微結構變化

3　討論

細胞凋亡包括內源性（線粒體）和外源性（死亡受體）兩種通路［5］。內源性通路啟動經促凋亡分子（細胞色素C）從線粒體釋放到胞漿內，導致C aspase-9激活，最后激活C aspase-3；外源性通路經細胞表面死亡受體誘導，刺激死亡結構域相關蛋白（adaptor F as-associated protein w ith death domain，F(xiàn) P DD）和死亡結構域相關腫瘤壞死因子受體（t u mor necrosis f actor receptor 1A-associatedv iadeathdomain，T R A DD），依次激活啟動因子胱天蛋白酶原-8、-10。F P DD/T R A DD和 P rocaspaese-8，P rocaspaese-10組合成誘導死亡信號復合體（death-ind u cin g si g nalin g comple x，D I S C），D I S C能促進自身程序，啟動P rocaspase活化，激活胱天蛋白酶原-8、-10并從蛋白復合體中游離。C aspaese-8、C aspaese-10可直接激活下游C aspaese-3、C aspaese-7導致細胞凋亡［6-7］。C aspaese是一種關鍵的蛋白酶，在兩種細胞凋亡通路中發(fā)揮重要作用［8］。內源性通路和外源性通路均需激活C aspaese-3，其是細胞凋亡中的效應因子［9］。在許多生物過程中，細胞的生存與死亡取決于線粒體表面的B cl-2家族成員。B cl-2家族蛋白由促凋亡（B a x、B a k、B o k）和抗凋亡（B cl-2、B cl-x l）蛋白組成，主要在線粒體水平調控C aspase活性［10-11］。B cl-2和B cl-x l可穩(wěn)定線粒體的完整性，B a x和B a k則可使小細胞器喪失穩(wěn)定性。當B a x激活時，可嵌入線粒體外膜內，引發(fā)細胞色素C釋放和細胞凋亡。反之，B cl-2表達過?？梢种艬 a x激活，阻止DN A損傷和細胞色素C釋放［12］。細胞凋亡還包括細胞核形態(tài)改變、凋亡小體形成、胞質凝聚、線粒體膜電位降低、細胞內酸化、絲氨酸磷脂?；懵队诩毎砻妗⒓毎櫩s、膜出泡［3］。S M可觸發(fā)多種分子通路致肺損傷，包括氧化應激、細胞凋亡、補給失調、蛋白水解酶與抗蛋白水解酶失調、炎癥、氣道重塑、基因失調，導致細胞的完整性和功能喪失［13-17］。體內外實驗研究表明，S M主要通過線粒體通路和死亡受體通路誘導細胞凋亡［2，4，8，18］。S M誘導的細胞反應相當復雜，還涉及3種絲裂原活化蛋白激酶（mito g en-acti v ated protein k inase，M A P K）通路和核因子-κB（n u clear f actor κB，N F-κB）通路、P53和胱天蛋白酶-多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly A D P-ribose polymerase，P A R P，C aspase-P A R P）通路、鈣調蛋白通路［19-22］。許多學者研究發(fā)現(xiàn)，S M誘導細胞凋亡常與氧化應激、炎癥反應、DN A損傷伴隨，并與其伴隨的反應程度呈正相關［23-26］。由此可見，在S M誘導肺損傷中，細胞凋亡是重要的分子和細胞損傷機制之一。

本研究通過T U NE L染色檢測發(fā)現(xiàn)，腹腔和氣管S M組肺泡間隔凋亡細胞數(shù)隨時間延長呈遞增趨勢。腹腔S M組各時間段肺泡間隔凋亡細胞陽性表達率較氣管S M組明顯增多（P＜0.05）。免疫組織化學法顯示，腹腔和氣管S M組肺泡間隔凋亡蛋白B a x陽性表達隨時間延長呈遞增趨勢，而凋亡蛋白B cl-2則呈遞減趨勢。腹腔和氣管S M組肺泡間隔凋亡蛋白酶C aspase-3、C aspase-9陽性表達隨時間延長呈遞增趨勢。電鏡顯示，染毒72h，腹腔S M組和氣管S M組Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮凋亡細胞形態(tài)特征為上皮細胞膜附著的微絨毛斷裂缺失，排列紊亂；線粒體嵴模糊，粗面內質網表面附著的核糖體脫離，并游離于細胞質中。本研究結果提示，經兩種途徑致大鼠急性肺損傷中細胞凋亡是S M損傷機制之一，像炎癥反應一樣，與S M的暴露劑量和時間呈正相關［27］。同時證實，導致細胞凋亡的分子機制是經線粒體通路。體外實驗發(fā)現(xiàn)，S M誘導細胞凋亡可通過線粒體通路和死亡受體通路，且兩種通路之間存在著相互關聯(lián)性［28-29］。筆者檢測的凋亡蛋白指標顯示，促凋亡蛋白B a x表達增多，抗凋亡蛋白B cl-2表達減少，B a x/B cl-2比值增加，該比值的變化與T U NE L染色凋亡細胞逐漸增加趨勢相符合。檢測的凋亡蛋白酶指標提示，啟動因子C aspase-9和效應因子C aspase-3均呈陽性表達，表明線粒體通路中C aspase裂解和觸發(fā)作用被激活［30-31］。該凋亡蛋白酶的變化與R A Y［8］和S OU R DE V A L等［32］報道結果相同。電鏡顯示，S M誘導肺上皮細胞形態(tài)學變化主要在細胞膜、線粒體、粗面內質網。學者推測該損傷現(xiàn)象可能與線粒體膜通透性改變和線粒體膜電位降低及鈣離子失衡有關［33-34］。由此表明，線粒體是細胞易損傷的微小器官和生物程序的主要調控點［11］。一旦線粒體損傷，則會激活多種促凋亡分子信號通路，有助于加速細胞的自我毀滅［35-36］。筆者認為，S M誘導細胞凋亡是多種因素作用的結果，其分子和細胞機制相當復雜，這種網絡式調節(jié)通路尚未完全闡明。本研究結果顯示，S M經腹腔和氣管致大鼠急性肺損傷通過內源性通道引發(fā)細胞凋亡調節(jié)異常，S M經腹腔染毒大鼠各項細胞凋亡指標比氣管明顯升高，推測可能與S M腹膜腔的快速吸收有關。在經腹腔和氣管造模劑量的選擇方面，研究發(fā)現(xiàn)，S M腹腔注射引起的肺損傷較經皮下注射或口服途徑染毒更嚴重［37］。當大鼠經腹腔注射S M劑量＞10m g/k g時，就會出現(xiàn)大鼠死亡［38］。顯然筆者選擇經腹腔和氣管S M L D50相近的劑量建立急性肺損傷模型，S M肺損傷細胞凋亡的反應程度出現(xiàn)差異性，說明血液對S M的吸收可能占主導作用。本研究提示，在S M L D50相同劑量下，并非是經氣管致肺損傷誘導細胞凋亡最重，為S M肺損傷的靶向干預提供有價值的參數(shù)。

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（童穎丹 編輯）

Changes of apoptosis in acute pulmonary injury of rats induced by intraperitoneal and tracheal injection of sulfur mustard*

X iao-j i Z h u1，S h u an g-sh u an g Z h u2，W ei H an1，Y u an-y u an B ei2，Y u-x u Z hon g3，F(xiàn) ei L i u1，Tao W an g4，C hao Z hao5，J ian Z hao3
（1.Department of Respiratory Diseases，the 89th Hospital of PLA，Weifang，Shandong 261021，China；2.Graduate Department，Weifang Medical College，Weifang，Shandong 261042，China；3.Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；4.Department of Pathology；5.Clinical Laboratory，the 89th Hospital of PLA，Weifang，Shandong 261021，China）

Objective To establish rat models of sulfur mustard（SM）-induced acute lung injury via intra-peritoneal and tracheal injection，and compare the difference in apoptosis of the two models.M ethods A total of 136 male Sprague Dawley rats were selected and randomly divided into control group with 8 cases and other four groups（i.e.intraperitoneal SM group，intraperitoneal glycol propylene group，tracheal SM group and tracheal glycol propylene group with 32 cases in each group）.The intraperitoneal SM group was intraperitoneally injected with 0.1m l diluted SM（0.96 LD50=8mg/kg），the tracheal SM group had intratracheal injection of 0.1m l diluted SM（0.98 LD50=2mg/kg），meanwhile the status quo was kept with the control group. SM-induced apoptosis was observed by TUNEL staining and immunohistochemical staining as well as electron microscopy.Results In the alveolar septum，the expression rate of positive cells by TUNEL staining in the intraperitoneal SM group was increased compared with that in the tracheal SM group at the same period of time（P＜0.05）.In the alveolar septum，a significantly higher positive expression rate of Bax protein was detected by immunohistochemical staining in the intraperitoneal SM group at different periods of time compared with that in the tracheal SM group at the corresponding period（P＜0.05）；while a significantly lower positive expression rate of Bcl-2 protein was detected by immunohistochemical staining in the intraperitoneal SM group at different periods of time compared with that in the tracheal SM group at the corresponding period（P＜0.05）.In the alveolar septum，the expression rates of caspase-3 and caspase-9 by immunohistochemical staining in the intraperitoneal SM group at different periods of time were increased compared those with the tracheal SM group at the corresponding period（P＜0.05）.Electron microscopic observation confirmed that both type I and type II alveolar epithelial cells in the lungs exhibited apoptotic morphologic features，such as break，loss and disarrangement of the microvilli on cell membrane，blurred mitochondrial cristae，and detachment and dissociation of the ribosomes from the surface of the rough endoplasmic reticula.Conclusions Our results showed that dysregulation of apoptosis via intrinsic pathways in the intraperitoneal SM group and the tracheal SM group leads to up-regulation of apoptosis.In SM-induced acute lung injury in rats via intraperitoneal route，the index of apoptosis is significantly higher than that via tracheal route，which may be related to fast absorption of SM in the peritoneal cavity.

sulfur mustard；lung injury；apoptosis

R 114；R 563.8文獻識別碼：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.003

1005-8982（2016）15-0011-11

2015-01-19

國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項（No：2013Z X09J13103-01B）

趙建，E-mail：j ian_z hao@126.com；Tel：010-66931646，18910216751