張　瑜，鄭　偉，顧劍飛，石陸娥

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江　杭州　310016)

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Serratiamarcescens非特異性核酸酶研究進(jìn)展

張瑜，鄭偉，顧劍飛，石陸娥

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310016)

Serratiamarcescens核酸酶是一種非特異性核酸內(nèi)切酶，可降解不同形式的DNA和RNA。本文綜合國內(nèi)外的研究概況,主要介紹了Serratiamarcescens非特異性核酸酶的水解位點(diǎn)、催化機(jī)制及其降解底物的特點(diǎn)，另外也闡述了Serratiamarcescens非特異性核酸酶的原核表達(dá)的研究以及其應(yīng)用現(xiàn)狀，為Serratiamarcescens非特異性核酸酶更深層次的研究提供理論基礎(chǔ)。

Serratiamarcescens；非特異性核酸酶；催化機(jī)制；原核表達(dá)；應(yīng)用

非特異性核酸內(nèi)切酶是一類高活性水解酶，其最大的特點(diǎn)是能非特異地降解幾乎所有類型的核酸，包括單鏈、雙鏈、線狀及環(huán)狀的DNA和RNA，且對核酸的序列沒有嚴(yán)格的要求。到目前為止，研究人員已從病毒、細(xì)菌、真菌和動物中分離得到30余種非特異性核酸酶[1]，其中Serratiamarcescens非特異性核酸酶(SMNE)來源于粘質(zhì)沙雷氏菌，是一種分泌至胞外的磷酸二酯酶，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1　SMNE的結(jié)構(gòu)

SMNE的一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)均已被證實(shí)[2-5]。通過沉降速度實(shí)驗(yàn)、交聯(lián)研究、動態(tài)光散實(shí)驗(yàn)及X-射線晶體分析均證明SMNE是由兩個相同的亞基通過羧基末端的氨基酸殘基通過互補(bǔ)作用聚合而成，且兩個亞基中的H184殘基之間的相互作用占主導(dǎo)地位。由圖1A所示，在聚合的兩個亞單位接觸面，A亞基的His-174和B亞基的Ser-179通過非共價連接相互作用。圖1B所示，A亞基的Ser179,Pro180,Ala181,Val182和Asn183形成一定的空間結(jié)構(gòu)與B亞基的His184互補(bǔ)聚合[6]。

圖1　Serratia marcescens非特異性核酸酶的結(jié)構(gòu)

2　SMNE降解核酸

2.1核酸酶的催化作用

DNA中的磷酸二酯鍵極其穩(wěn)定，在25 ℃，pH 7.0的中性水溶液中半衰期可達(dá)千億年。磷酸二酯鍵的高度穩(wěn)定性被認(rèn)為是核酸作為遺傳物質(zhì)的重要原因之一。若使DNA中的磷酸二酯鍵在數(shù)分鐘之內(nèi)發(fā)生水解則要求催化劑能夠提供高達(dá)1017數(shù)量級的速率增強(qiáng)因子[7]。天然核酸酶能加速磷酸二酯鍵1012～1017倍的水解速率，其催化性均靠直接的親核取代反應(yīng)及構(gòu)象轉(zhuǎn)換來實(shí)現(xiàn)，這一原則普遍適用于限制性內(nèi)切酶和非特異性核酸酶。非特異性核酸酶催化磷酸二酯鍵水解實(shí)質(zhì)也是一個親核取代過程，該過程可簡單描述為兩步(圖 2)。第一步，金屬離子活化后的水分子解離產(chǎn)生氫氧根離子，氫氧根離子作為親核試劑攻擊磷原子，形成一個五配位的中間物，這一步是可逆性的；第二步，P-O鍵發(fā)生斷裂，帶有3’-羥基的2’-核苷酸離去，形成產(chǎn)物。上述過程中涉及三種基團(tuán):活化親核水分子的廣義堿，穩(wěn)定五價過渡態(tài)磷原子上負(fù)電荷的Lewis酸(通常為二價金屬離子)和促進(jìn)3'-羥基離去的廣義酸[8]。

圖2　磷酸二酯鍵水解簡化兩步示意圖

2.2SMNE的催化機(jī)制

在非特異性核酸酶中，與催化功能相關(guān)的基團(tuán)通常是由位于活性中心的一些特定氨基酸殘基或二價金屬離子。Miller等[9]發(fā)現(xiàn)SMNE的兩個活性位點(diǎn)在裂解核酸的過程中可以獨(dú)立的發(fā)揮作用。Biedermann[10]等研究發(fā)現(xiàn)SMNE的催化活性很高，在它的催化中心，Mg2+與Asn119結(jié)合，His89作為廣義的堿，活化親核水分子。Arg 57殘基參與過渡態(tài)的穩(wěn)定，而水化的Mg2+作為Lewis酸，穩(wěn)定5價過渡態(tài)P原子上的負(fù)電荷，起質(zhì)子化離去基團(tuán)的作用[11]。

SMNE的活性中心參與催化作用的氨基酸殘基為Arg 57，His89，Asn119和Glu127[12]。另外Tyr76和Trp123在所有Serratia核酸酶家族分子的活性位點(diǎn)較為保守，可能是由于核酸殘基間的堆積作用，這些氨基酸殘基的芳香側(cè)鏈可能在核酸酶與底物結(jié)合時發(fā)揮作用。Gregor等[13]獲得了幾種SMNE突變型分子，將Tyr76和Trp123分別突變?yōu)锳la和Phe，記作Y76A、Y76F、W123A和W123F。用野生型的酶分子作為對照，結(jié)果表明，突變體Y76A和W123A分別引起催化活性降低了104和25倍，而Phe突變體只引起催化活性的略微改變。

2.3SMNE對底物的選擇性

非特異性核酸酶雖然對底物沒有特殊的要求，但其降解核酸時也并非絕對的無堿基優(yōu)先。通過對非特異性核酸酶ColocinE7[14]的研究表明,在核酸酶的誘導(dǎo)下，DNA骨架容易發(fā)生變形的位點(diǎn)更易被核酸酶水解,且通過點(diǎn)突變對ColicinE7進(jìn)行改造后，其優(yōu)先水解的位點(diǎn)也可以得到改變，而且核酸酶的活力也得到了提高。

SMNE雖然對底物的特異性要求較低，能降解單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀和超螺旋形式的DNA和RNA，產(chǎn)生5’-磷酸化的單核苷酸、 二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸，但對Poly結(jié)構(gòu)的DNA和RNA降解效率較低。這些特殊結(jié)構(gòu)的DNA和RNA分別作為SMNE的底物時，SMNE無法降解PolyU, PolyG和PolyC結(jié)構(gòu)的底物，也不降解Poly[d(A)]和Poly[d(T)]結(jié)構(gòu)的底物，可微量降解PolyA結(jié)構(gòu)和PolyA·PolyU結(jié)構(gòu)的底物，但可高效降解Poly(I)·Poly(C)這種結(jié)構(gòu)的底物[15]。相對于嘌呤DNA作為底物，其表現(xiàn)出對嘧啶DNA作為底物的偏愛性[16]。

SMNE對底物的降解表現(xiàn)出序列偏愛性[15]。Gregor等設(shè)計不同的DNA作為此種核酸酶的底物。在給定的條件下，SMNE傾向于降解dsDNA中GC含量高的序列[17]，尤其是d(G)·d(C)序列，不降解d(A)·d(T)序列。當(dāng)改變反應(yīng)體系中的一些指標(biāo)，SMNE對序列的選擇性發(fā)生相應(yīng)的改變。

3　SMNE的原核表達(dá)

SMNE來源于粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，而粘質(zhì)沙雷氏菌是一種致病菌，其培養(yǎng)菌液用于核酸酶的分離純化存在潛在的風(fēng)險，因此有必要探索該酶安全高效的重組表達(dá)體系。由于核酸酶的胞內(nèi)表達(dá)可能造成重組核酸酶自身核酸的降解而對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性，因此已報道的SMNE的重組表達(dá)均采用胞外分泌的方式，但表達(dá)效率較低，每升僅可生產(chǎn)1.23×104U的酶。張開俊等[18]通過合成SMNE的基因，應(yīng)用PCR技術(shù)在基因的5'端引入6個組氨酸標(biāo)簽序列，將其插入分泌表達(dá)載體pET-20b(+)中并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SMNE，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳離子螯合瓊脂糖凝膠進(jìn)一步純化后，重組蛋白的表達(dá)量為8.0 mg/L，純度達(dá)到95%，比活達(dá)1.1×106U/mg，成功的構(gòu)建了SMNE的原核高效表達(dá)體系。陳鵬等[19]以粘質(zhì)沙雷氏菌的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增非特異性核酸酶(NU)的基因，并克隆到pMAL-c4X載體上構(gòu)建重組表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)78 kDa的麥芽糖結(jié)合蛋白-NU融合蛋白，其最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為37 ℃，0.75 mmol/L 誘導(dǎo)時間1.5 h。

4　SMNE的應(yīng)用

非特異性核酸酶已在各領(lǐng)域得到非常普遍的應(yīng)用，在工業(yè)領(lǐng)域中最主要的應(yīng)用是生物制品中外源核酸的去除[19-20]。在治療用重組生物制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，外源性核酸的殘留量是一個重要的指標(biāo)，直接關(guān)系到產(chǎn)品的安全性。美國FDA和我國SFDA對其殘留量的要求越來越嚴(yán)格。美國FDA制定的治療用重組生物制品生產(chǎn)準(zhǔn)則規(guī)定，成品的外源性核酸殘留量應(yīng)不超過100 pg/劑[21-22]。此外，SMNE在遺傳機(jī)制方面[23]的應(yīng)用有避免突變、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制和重組、為生長代謝清除核苷和磷酸、宿主防御外源的核酸分子、病毒感染宿主的建立和細(xì)胞凋亡等[24]；在醫(yī)藥方面如治療腫瘤[25]、纖維性囊腫、紅斑性狼瘡、兒童急性氣喘[26]等；分子研究方面如核酸結(jié)構(gòu)的檢測、RNA的快速檢測、抗病毒試劑的應(yīng)用等[27]。SMNE已有商品化的產(chǎn)品Benzonase，主要用途是在蛋白質(zhì)純化的過程中消除核酸的污染，加入該核酸酶可以減小加工處理過程中蛋白樣品的粘稠度。

5　展　望

利用定點(diǎn)突變等技術(shù)，結(jié)合蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)研究SMNE的酶學(xué)性質(zhì)，有望為SMNE的功能進(jìn)化研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。SMNE的催化高效性使得其在生物技術(shù)領(lǐng)域中具有較為積極的應(yīng)用價值，尤其是SMNE在蛋白質(zhì)純化過程中消除核酸污染方面的顯著效果。利用比較成熟的定向進(jìn)化技術(shù)，如DNA改組、易錯PCR等基因突變和高通量篩選等方法，有望加快SMNE的工業(yè)化應(yīng)用。由于核酸酶本身會對宿主細(xì)胞造成強(qiáng)的毒害作用，因此構(gòu)建其原核表達(dá)系統(tǒng)以獲得更高核酸酶的表達(dá)量有望成為研究的熱點(diǎn)之一。

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Reseach Progress onSerratiamarcescensNon-specific Nuclease

ZHANGYu,ZHENGWei,GUJian-fei,SHILu-e

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Zhejiang Hangzhou 310016，China)

Serratiamarcescensnuclease is a non-specific endonuclease, which is able to cleave different forms of DNA and RNA. The cleavage sites and the catalytic mechanism of the non-specific nuclease ofSerratiamarcescen, its characteristics of the degrade substrate were mainly summarized. In addition, the research on prokaryotic expression and application of this nuclease was briefly introduced in order to provide the theoretical basis for further research ofSerratiamarcescensnon-specific nuclease.

Serratiamarcescens; non-specific nuclease; catalytic mechanism; prokaryotic expression; application

張瑜(1991-)，女，碩士研究生，主要從事微生物資源的開發(fā)利用研究。

石陸娥(1979-)，女，副教授，博士，主要從事微生物工程、分子生物學(xué)等方面的研究。

Q71

A

1001-9677(2016)05-0016-03