魏　琪，閔凡祥，張　抒，高云飛，董學(xué)志，王文重，楊　帥

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086）

病蟲防治

采用DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)馬鈴薯4種細(xì)菌病害

魏琪*，閔凡祥，張抒，高云飛，董學(xué)志，王文重，楊帥

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086）

馬鈴薯易受到多種細(xì)菌病害的侵染，特別是檢疫性病害和土傳性病害，對(duì)馬鈴薯種薯進(jìn)行全面的細(xì)菌病害檢測(cè)勢(shì)在必行。將檢測(cè)檢疫性細(xì)菌病害的DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用在馬鈴薯4種細(xì)菌性病害（環(huán)腐病、青枯病、瘡痂病和黑脛?。┑臋z測(cè)中，探討該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用可行性。采用已知菌株以明確該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用效果，結(jié)果表明，該項(xiàng)DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)馬鈴薯環(huán)腐病和瘡痂病的結(jié)果良好；檢測(cè)青枯病可以確定到屬；檢測(cè)黑脛病時(shí)配合特異性基因，可獲得良好的檢測(cè)結(jié)果。該DNA條形碼技術(shù)是標(biāo)準(zhǔn)性操作規(guī)程與測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的一種方法，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性高，同時(shí)可以在大規(guī)模樣品的檢測(cè)工作中縮減工作量，提高檢測(cè)效率。

DNA條形碼技術(shù)；馬鈴薯；環(huán)腐??；青枯病；瘡痂病；黑脛病

中國(guó)是世界第一大馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)。馬鈴薯在實(shí)際生產(chǎn)中會(huì)受到多種病原細(xì)菌的影響而導(dǎo)致減產(chǎn)、甚至絕產(chǎn)。這些病原細(xì)菌引起的馬鈴薯病害分為2類：一類為允許率為“0”檢疫性病害，如馬鈴薯環(huán)腐病和青枯??；另一類為非檢疫性病害，但嚴(yán)重影響馬鈴薯生產(chǎn)的病害，如馬鈴薯黑脛病、軟腐病及瘡痂病。馬鈴薯種薯傳播方式是上述細(xì)菌性病害大范圍傳播的重要途徑之一。因此，對(duì)于馬鈴薯種薯進(jìn)行主要細(xì)菌病害的檢測(cè)勢(shì)在必行。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌株及待檢馬鈴薯樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

表1　樣品來(lái)源Table 1Source of sample

1.2方法

1.2.1DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

采用北京天根生化科技（北京）有限公司的新型植物基因組提取試劑盒（DP320）提取所有樣品的DNA。分子生物學(xué)試劑均為Takara公司產(chǎn)品。

擴(kuò)增及測(cè)序引物、擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件參考?xì)W盟內(nèi)檢疫性有害生物的DNA Barcoding數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（www.q-bank.eu）內(nèi)細(xì)菌鑒定流程中所推薦的方法，并進(jìn)行必要的調(diào)整。所用引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，其序列見(jiàn)表2和表3。

獲得的擴(kuò)增序列由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司和華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)最新流行病學(xué)資料顯示[7-8]，全球糖尿病患者人數(shù)在3.8億左右，是目前最為嚴(yán)重的代謝性疾病之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生活健康。糖尿病患者往往存在多飲、多食、多尿以及身體消瘦等臨床癥狀，對(duì)糖尿病患者進(jìn)行中醫(yī)護(hù)理具有重要意義。中醫(yī)認(rèn)為人體是一個(gè)有機(jī)的整體，強(qiáng)調(diào)人與自然、環(huán)境的相互統(tǒng)一，中醫(yī)學(xué)中，糖尿?。ㄏ剩┎C(jī)是陰津虧損、稟賦不足以及燥熱偏盛等，所以強(qiáng)調(diào)在疾病的治療和康復(fù)中保證患者的生活護(hù)理質(zhì)量，從整體的角度出發(fā)。其次，中醫(yī)特色護(hù)理具有個(gè)性化特征，針對(duì)不同個(gè)體患者和患者疾病的不同階段[9]，在中醫(yī)辨證的基礎(chǔ)上進(jìn)行個(gè)體化指導(dǎo)，能夠讓治療具有針對(duì)性，促進(jìn)患者的康復(fù)。

1.2.2病害檢測(cè)流程

本研究中主要檢測(cè)的馬鈴薯細(xì)菌性病害種類有環(huán)腐病、青枯病、黑脛病和瘡痂病，引起這4種病害的病原菌分別來(lái)自Clavibacter屬、Ralstonia屬、Pectobacterium屬和Streptomyces屬。研究中采用歐盟內(nèi)檢疫性有害生物的DNA Barcoding數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（www.q-bank.eu）推薦的病害檢測(cè)流程見(jiàn)圖1。首先，根據(jù)16S rDNA的測(cè)序及Blast比對(duì)結(jié)果，初步判斷各樣品所含病原菌的屬。在這個(gè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別使用其他基因，進(jìn)行病原菌的進(jìn)一步鑒定。其中，Clavibacter屬和Streptomyces屬采用DNA促旋酶B亞單位基因（GyrB）；Ralstonia屬采用DNA錯(cuò)配修復(fù)基因（mutS），Pectobacterium屬采用基因組的基因。

1.2.3序列比對(duì)及同源性分析

由于采用的檢測(cè)樣品存在多種病原菌共同侵染的情況以及馬鈴薯塊莖組織內(nèi)含物相對(duì)復(fù)雜等情況，因此在DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序的過(guò)程中，均有可能會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不佳的情況，所以本研究對(duì)結(jié)果不佳的樣品進(jìn)行汰出，以最終獲得有效的病原菌基因序列的個(gè)體來(lái)進(jìn)行分析。

表2　3種細(xì)菌擴(kuò)增引物及測(cè)序引物Table 2Three kinds of primers used for PCR-sequencing bacteria

表3　Pectobacterium屬細(xì)菌擴(kuò)增引物及測(cè)序引物Table 3Primers used for PCR-sequencing Pectobacterium

圖1　馬鈴薯細(xì)菌病害檢測(cè)方案Figure 1Detection scheme for potato bacterial diseases

采用Chromas軟件對(duì)獲得的堿基序列進(jìn)行峰值圖的檢查，確定序列的準(zhǔn)確性及截取有效片段長(zhǎng)度，將確定有效測(cè)序結(jié)果與GenBank中的現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)和分類學(xué)比較，判斷被測(cè)樣品中病原菌的屬。利用MEGA6軟件分析序列間的相似度，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.116S rDNA檢測(cè)結(jié)果及分析

將供試樣品進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增，YA-6無(wú)PCR產(chǎn)物，其他樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物情況（圖2）。每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物分別經(jīng)過(guò)2條引物進(jìn)行測(cè)序后，分析二者的重合序列，用該重合序列進(jìn)行Blast比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表4。其中，樣品1-1、HJ1、QK3、YA-4、ZN-1的測(cè)序結(jié)果不能獲得有效的重合序列，因此不能進(jìn)行16S rDNA的比對(duì)分析。

圖2　供試樣品16S rDNA-PCR結(jié)果Figure 216S rDNA-PCR results

2.2后續(xù)基因擴(kuò)增及測(cè)序

根據(jù)表4中所示的16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果，進(jìn)行后續(xù)基因檢測(cè)分析。

2.2.1Clavibacter屬和Streptomyce屬的GyrB基因擴(kuò)增

樣品HF1、YA-3、YA-5、28-2、YA-4進(jìn)行550 bp的GyrB基因擴(kuò)增，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3，從圖3中可知，Streptomyce屬的28-2也獲得了擴(kuò)增產(chǎn)物，其條帶大小明顯小于500 bp；Clavibacter屬的HF1、YA-3、YA-5及YA-4均獲得了550 bp左右的產(chǎn)物。YA-4的16S rDNA未獲得重合序列，因此，僅進(jìn)行GyrB基因的PCR擴(kuò)增，未測(cè)序。樣品HF1、YA-3、YA-5以及28-2進(jìn)行GyrB基因序列測(cè)定。

表4　7個(gè)樣品的16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果Table 4Blast comparison with 16S rDNA sequences of seven samples

圖3　Clavibacter屬和Streptomyce屬的GyrB基因擴(kuò)增Figure 3GyrB-PCR results of Clavibacter and Streptomyce

2.2.2Ralstonia屬的mutS基因擴(kuò)增

樣品QK1、QK3及1-1進(jìn)行767 bp的mutS基因擴(kuò)增，電泳結(jié)果見(jiàn)圖4，從圖4中可知，1-1未產(chǎn)生目的條帶，而QK1和QK3均獲得了與預(yù)期相似的目的條帶，其中對(duì)QK1的mutS基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

圖4　Ralstonia屬的mutS基因擴(kuò)增Figure 4mutS-PCR results of Ralstonia

2.2.3Pectobacterium屬的基因擴(kuò)增

樣品HJ2和FL-1分別進(jìn)行P.atrosepticum基因組和P.carotovorum基因組的特異性引物擴(kuò)增及測(cè)序，電泳結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。從電泳圖5中可知，HJ2擴(kuò)增出P.atrosepticum基因組的特異性目的片段，而FL-1并未獲得任何PCR產(chǎn)物。因此，HJ2的P.atrosepticum-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。從電泳圖6中可知，樣品HJ2和FL-1均未擴(kuò)增出P.carotovorum基因組的特異性片段。

圖5　P.atrosepticum基因組特異性擴(kuò)增Figure 5PCR of P.atrosepticum by special primers

2.2.4序列比對(duì)分析

將樣品HF1、YA-3、YA-5和28-2的GyrB基因序列測(cè)定結(jié)果、QK1的mutS基因測(cè)序結(jié)果和HJ2的P.atrosepticum基因組PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果在GenBank進(jìn)行Blast的比對(duì)分析，分析結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可知，樣品HF1、YA-3、YA-5的病害類型均為C.michiganensis subsp.sepedonicus；樣品QK1為R.pickettii；樣品HJ2為P.atrosepticum；樣品28-2為S.scabiei。

圖6　P.carotovorum基因組特異性擴(kuò)增Figure 6PCR of P.carotovorum by special primers

表5　6個(gè)樣品的其他基因序列比對(duì)結(jié)果Table 5Blast comparison with other gene sequences of six samples

3　討論

3.1DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的比較

4種病害的已知菌液中，HF1、HJ2和28-2的16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果、GyrB基因鑒定結(jié)果與已知結(jié)果相一致；QK1的樣品原為R.solanacearum，而本研究所使用的條碼技術(shù)鑒定結(jié)果卻為R.pickettii，該樣品在“種”鑒定方面存在差異。

在病害待檢的樣品鑒定中，YA-3的16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果與GyrB基因擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果差異很大，YA-5的16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果是未知菌株，但是，YA-3和YA-5的GyrB基因擴(kuò)增的電泳圖中可明顯看出二者與HF1一致，經(jīng)過(guò)測(cè)序后比對(duì)發(fā)現(xiàn)，二者確實(shí)為C.michiganensis subsp.sepedonicus，與HF1結(jié)果一致。而且，YA-3、YA-4和YA-5經(jīng)環(huán)腐病Real-Time PCR方法驗(yàn)證均為C.michiganensis subsp.sepedonicus[14]，與應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果一致。因此，本研究應(yīng)用的DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)C.michiganensis subsp.sepedonicus時(shí)，采用16S rDNA序列與GyrB基因相結(jié)合，其中GyrB基因鑒定結(jié)果良好，田茜等[12]的分析認(rèn)為cpn60基因具備作為Clavibacter屬內(nèi)亞種級(jí)別區(qū)分鑒定用基因的潛力。但是，在實(shí)際應(yīng)用中，GyrB基因即可滿足馬鈴薯病害檢測(cè)的要求。主要原因是，該基因可以將2種革蘭氏陽(yáng)性菌引起的馬鈴薯環(huán)腐病和瘡痂病區(qū)分開(kāi)來(lái)，獲得準(zhǔn)確的馬鈴薯瘡痂病檢測(cè)結(jié)果。

3.2復(fù)合侵染樣品對(duì)DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的影響

DNA條形碼技術(shù)在應(yīng)用的過(guò)程中對(duì)被測(cè)樣品的DNA質(zhì)量要求較高，特別是在16S rDNA序列的比對(duì)中[12]。在本研究中，采用的供試馬鈴薯塊莖樣品可能存在多種細(xì)菌病害復(fù)合侵染的情況，導(dǎo)致16S rDNA序列的測(cè)定后無(wú)法獲得足夠長(zhǎng)度的重合序列。因此，在應(yīng)用該DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)馬鈴薯細(xì)菌病害時(shí)，需要對(duì)待檢樣品提取DNA時(shí)應(yīng)確保是單一菌株侵染并保證提取的DNA質(zhì)量良好。如果無(wú)法保證待檢樣品是單一病害侵染時(shí)，應(yīng)先對(duì)待檢樣品進(jìn)行菌株的分離培養(yǎng)，再逐一挑取病原菌進(jìn)行16S rDNA序列的擴(kuò)增等檢測(cè)工作。同時(shí)，在檢測(cè)過(guò)程中務(wù)必設(shè)立空白對(duì)照，以保證PCR反應(yīng)未發(fā)生污染現(xiàn)象。

3.3DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)馬鈴薯細(xì)菌病害的可行性

本文所應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)是根據(jù)歐盟地區(qū)的檢疫性細(xì)菌病害DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行必要的改良后建立的。在本研究中，該技術(shù)在馬鈴薯環(huán)腐病檢測(cè)的應(yīng)用效果良好，可以作為馬鈴薯環(huán)腐病的一種檢測(cè)體系在實(shí)際工作中應(yīng)用。然而，該DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)馬鈴薯青枯病時(shí)，可以獲得“屬”的鑒定結(jié)果，但是在“種”的鑒定中未能獲得理想的檢測(cè)結(jié)果，因此，該方法需要進(jìn)一步對(duì)mutS基因或其他特異性基因進(jìn)行篩選研究后，以獲得更加準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定結(jié)果。

在馬鈴薯瘡痂病的檢測(cè)上，借鑒了馬鈴薯環(huán)腐病的檢測(cè)方法，本研究發(fā)現(xiàn)該方法可檢測(cè)S.scabiei（馬鈴薯普通瘡痂病菌），而對(duì)于其他種的馬鈴薯瘡痂病菌還將繼續(xù)進(jìn)行應(yīng)用研究。在馬鈴薯黑脛病的檢測(cè)中，雖然已知樣品在16S rDNA序列中獲得了準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，但是在待檢樣品的檢測(cè)中未獲得良好的檢測(cè)結(jié)果，因此，該DNA條形碼技術(shù)在馬鈴薯黑脛病檢測(cè)中應(yīng)用需要配合以該病原菌特異性基因。

除2種馬鈴薯檢疫性病害之外，本研究拓展了該DNA條形碼技術(shù)的檢測(cè)范圍，將其應(yīng)用在非檢疫性病害的病原細(xì)菌（瘡痂病和黑脛病菌）等方面。本研究初步構(gòu)建的馬鈴薯4種細(xì)菌病害DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)流程使得馬鈴薯種薯質(zhì)量檢測(cè)中獨(dú)立的待檢樣品進(jìn)行多種細(xì)菌性病害檢測(cè)得以實(shí)施，待檢樣品首先經(jīng)過(guò)16S rDNA序列的分類后，再進(jìn)行具體病原菌種類的鑒定。而且標(biāo)準(zhǔn)操作和測(cè)序技術(shù)的相結(jié)合使得檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高，還可以避免待檢樣品按照不同病害種類多次進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增的工作，大大縮減工作量。該項(xiàng)技術(shù)既可保證操作的標(biāo)準(zhǔn)性和結(jié)果的準(zhǔn)確性，還大大提高馬鈴薯病害的檢測(cè)效率，因此，該項(xiàng)技術(shù)在馬鈴薯種薯生產(chǎn)中應(yīng)用潛力巨大。

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Detection of Four Bacterial Diseases of Potato by DNA Barcoding

WEI Qi*,MIN Fanxiang,ZHANG Shu,GAO Yunfei,DONG Xuezhi,WANG Wenzhong,YANG Shuai
(Virus-free Seedling Research Institute,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin,Heilongjiang 150086,China)

ract:Potato is vulnerable to infection by a variety of bacterial diseases,especially quarantine diseases and soil-borne diseases,and to advance a comprehensive detection of bacterial diseases for seed potato bacterial disease is imperative.In this research,four bacterial diseases of potato,including potato ring rot,bacterial wilt,potato common scab, and black leg,were detected using DNA barcoding technique to investigate the application feasibility of the technology for potato bacterial disease testing.Known strains were used to assess the detection results.The DNA barcoding technique was good for potato ring rot and potato scab detection.Bacterial wilt was determined to genus level.Black leg could also be detected by combination of DNA barcode technology and specific gene.The DNA barcoding technique includes a standard method of operating procedures,and sequencing technology,which could achieve high accuracy of testing,reduce the workload of large-scale work in potato bacterial diseases testing,and improve the detection efficiency.

rds:DNA barcoding;potato;ring rot;bacterial wilt;common scab;black leg

S532

A

1672－3635（2016）02-0105-07

2016-01-15

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（QC2012C063）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金資助（CARS-10-P14）；國(guó)際合作項(xiàng)目（2013DFA31970）；國(guó)家科技支撐項(xiàng)目（2012BAD06B02）；公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201303015-9）。

魏琪（1981-），女，博士，副研究員，主要從事馬鈴薯病害檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)工作。

（Corresponding author）：魏琪，E-mail:weiqi1981917@126.com。