劉小花, 崔　方, 張夢婷, 王　影, 封士蘭

(蘭州大學(xué) 藥學(xué)院, 甘肅 蘭州　730000)

?

HPLC法同時測定黃芪中的5種黃酮類成分的含量
——一種新的應(yīng)用于藥學(xué)實驗分析方法

劉小花, 崔方, 張夢婷, 王影, 封士蘭

(蘭州大學(xué) 藥學(xué)院, 甘肅 蘭州730000)

高效液相色譜技術(shù)是藥學(xué)院本科生儀器分析的必修內(nèi)容。采用高效液相色譜法同時測定黃芪中毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮和芒柄花素的含量,該方法操作簡便,重復(fù)性好,結(jié)果準確可靠,不僅用于黃芪藥材中黃酮類成分的含量測定,也可用于藥學(xué)院分析化學(xué)、制劑分析等學(xué)生實驗,讓學(xué)生掌握高效液相色譜技術(shù)。

藥物檢測； 黃芪； 黃酮類成分； HPLC

高效液相色譜法(high performance liquid Chromatography, HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。2010版中國藥典中80%以上的中藥材和制劑其含量測定項均采用高效液相色譜法,高效液相色譜技術(shù)是藥學(xué)院本科生及研究生儀器分析的必修內(nèi)容,也是制劑分析、藥物分析和現(xiàn)代色譜分析的常規(guī)方法,因此掌握高效液相色譜技術(shù)對于藥學(xué)類技術(shù)人才是必要的。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch. )Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根, 具有補氣固表、 利尿托毒、排膿、 斂瘡生肌等功效[1]。其主要化學(xué)成分包括黃酮類化合物、黃芪多糖以及黃芪皂苷等。黃芪主產(chǎn)于我國甘肅、內(nèi)蒙和山西三省,不同地區(qū)的黃芪質(zhì)量有一定的差別[2]。

房樹標等[3]利用紫外分光光度法測定了黃芪藥材中總黃酮的含量,但是此法對于黃芪藥材中的多種黃酮類成分無法進行同時測定。石子儀等[4-5]采用HPLC-DAD法建立芒柄花素以及毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷等黃酮類成分的含量測定方法。趙強強等[6-11]采用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷等皂苷類成分的含量。2010版中國藥典已將黃芪甲苷和毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷作為指標成分控制黃芪藥材及其制劑的質(zhì)量。本實驗首次在黃芪藥材中鑒別出金雀異黃酮,并建立同時測定包括金雀異黃酮在內(nèi)的5個黃酮類成分含量的方法。本實驗中心進行了天然藥物化學(xué)本科生綜合實驗和設(shè)計性實驗改革[12-13],取得不錯成績。

1　實驗

1.1儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀系列:Millennum32 在線工作站,在線脫氣機,四元泵,2771自動進樣器,柱溫箱,2998二極管陣列檢測器；SpursilTMC18 柱(250 mm×4.6 mm, 5μm,北京迪馬有限公司)；乙腈為色譜純(美國邁瑞達科技有限公司)；甲醇為色譜純(美國邁瑞達科技有限公司)；水為超純水；95%乙醇為分析純；電熱恒溫水浴鍋；KQ3200DB 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

對照品毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、金雀異黃酮均購自中國食品藥品檢定研究院。

黃芪藥材(7批),自采或購買,具體產(chǎn)地見表1,經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院生藥研究所馬志剛教授鑒定為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

表1　黃芪藥材來源與品種

1.2色譜條件

SpursilTMC18 柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相為乙腈(A)和水(B),其梯度洗脫條件見表2；柱溫為30 ℃；檢測波長范圍為210～400 nm；2998二極管陣列檢測器；進樣量為10 μL。

表2　梯度洗脫條件

1.3對照品溶液配制

分別取毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、金雀異黃酮標準品適量,用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.100、0.130、0.116、0.103、0.157 g/L的對照品溶液,置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.4樣品處理

稱取黃芪藥材2 g,以10倍量(20 mL)的95% 乙醇回流提取,每次1 h,共提取3次,過濾并合并提取液,將合并液置水浴鍋上蒸餾濃縮至近干;干樣品用95% 乙醇溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,定容至刻度,搖勻,即得藥材的乙醇提取液(供試品溶液)。微孔濾膜(0.45 μm)濾過后以封口膠封存,置4 ℃冰箱冷藏備用。7批藥材均按上述過程處理。

2　方法學(xué)考察

2.1線性關(guān)系考察

分別取對照品儲備液并用甲醇逐級稀釋成一系列不同濃度對照品溶液,進樣5 μL進行測定,梯度洗脫條件見表2。5種黃酮類化合物以進樣量(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸分析,結(jié)果見表3。各回歸方程呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表3　對照品的回歸方程

注:表中F1—F5分別為毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素。

2.2穩(wěn)定性考察

同一樣品分別在0、2、4、6、12、24 h進樣10 μL,記錄峰面積,F1—F5對照品的RSD(%)分別為1.82%、0.76%、1.75%、1.60%、1.96%,所有的RSD<2%,符合規(guī)定。

2.3精密度考察

取對照品溶液測定日內(nèi)精密度和日間精密度。同一對照品溶液在同一天內(nèi)連續(xù)進樣6次,每次進樣5μL,計算日內(nèi)精密度。同一對照品溶液連續(xù)3 d每天進樣2次,計算日間精密度。實驗結(jié)果表明,5個黃酮類化合物的日內(nèi)和日間精密度的RSD<2%,符合規(guī)定。

2.4重復(fù)性考察

取1號黃芪藥材(來源于華亭馬峽)6份,每份2 g,精密稱定,制備成供試品溶液,按照樣品測定方法測定。測得F1—F5的5個黃酮類化合物的平均含量和RSD。測定結(jié)果表明,5種化合物的RSD<2%,重復(fù)性符合規(guī)定。

2.5準確度考察

以加樣回收率考察準確度。取同一批已知含量的1號(華亭馬峽)黃芪藥材5份,每份2 g,精密稱定,各加入適量的各種對照品溶液(F1—F5質(zhì)量濃度分別為0.100、0.130、0.116、0.103、0.157 g/L)按照上述的對照品溶液制備中的操作測定,計算5個成分的加樣回收率,結(jié)果表明,5個黃酮類成分的平均回收率都在96.86%～101.09%,RSD<2%,符合規(guī)定。

2.6樣品測定

取7批黃芪藥材,制備成樣品溶液,精密吸取10 μL進入HPLC儀進行分析,測得的色譜圖見圖1,與標準溶液的對比見圖2,毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的保留時間tR和含量測定結(jié)果見表4。

圖1　7批黃芪藥材提取物HPLC-DAD 色譜圖(254 nm)

圖2　藥材與5個黃酮類成分HPLC-DAD 色譜圖(254 nm)

分析物tR/min5種黃酮類成分的含量/(μg·g-1)樣1樣2樣3樣4樣5樣6樣7F16.4684.14350.09126.10213.62411.42222.09295.54F213.1432.71115.82104.10106.98189.56136.9957.82F316.6654.23256.077.7315.6629.8826.53168.52F421.011.011.360.871.431.751.821.03F526.7415.40120.861.49018.8523.0683.99

由圖1和圖2可知,黃芪藥材提取物的HPLC-DAD指紋圖譜中有5個共有峰,通過與標準品比對,F1—F5號峰對應(yīng)的化合物分別為毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素。

3　實驗結(jié)果與討論

3.1提取方法評價

采用95%乙醇作為溶劑,對7批來自不同產(chǎn)地的黃芪藥材進行回流提取, 5個黃酮類成分在該提取條件下得到的峰面積較大,提取效果良好,操作簡單。

3.2檢測系統(tǒng)評價

采用HPLC-DAD法對7批來自不同產(chǎn)地的黃芪藥材進行黃酮類成分的含量測定,測得各對照品——毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的最大吸收波長分別為258.1、249.8、248.7、259.3、248.7 nm。本實驗選取254 nm為檢測波長,對這5個黃酮類成分進行測定,其結(jié)果準確,重復(fù)性好。說明將HPLC-DAD法應(yīng)用于黃芪藥材中黃酮類成分的質(zhì)量控制中效果好。

3.3含量測定分析

測定顯示黃芪藥材內(nèi)的5種黃酮類成分含量大小關(guān)系為毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含量>毛蕊異黃酮含量>芒柄花苷含量>芒柄花素含量> 金雀異黃酮含量。其中,7批藥材中的金雀異黃酮含量均少于2 μg/g,而以往的學(xué)者做黃芪藥材中成分測定時,選用的對照品在藥材中的含量往往比較高,因此金雀異黃酮的峰形不易被發(fā)現(xiàn)。

此外,從表4中可發(fā)現(xiàn),即使是同一化合物在7批不同的黃芪藥材中的含量有較大的差異,這可能與黃芪的生長環(huán)境、生長年限以及儲藏時間等因素有關(guān)。

2010版藥典將黃芪甲苷以及毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷含量作為黃芪藥材的質(zhì)量控制標準。本研究在黃芪藥材中同時測定了金雀異黃酮等5個黃酮類成分的含量,為多指標控制黃芪藥材的質(zhì)量提供了實驗基礎(chǔ)。

4　結(jié)語

高效液相色譜法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù),也是藥物檢測必備的現(xiàn)代分析技術(shù)。本實驗方法的建立充分利用現(xiàn)代技術(shù)手段,使學(xué)生了解和應(yīng)用當前新技術(shù),牢固掌握所學(xué)的理論知識,實現(xiàn)了藥學(xué)院本科生及研究生的儀器分析、制劑分析、藥物分析和現(xiàn)代色譜分析等實驗內(nèi)容的改進,為培養(yǎng)高素質(zhì)的掌握現(xiàn)代分析手段的藥學(xué)類技術(shù)人才創(chuàng)造了條件。

References)

[1] 中華人民共和國藥典委員會.中國藥典一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:212-213.

[2] Pui Ying Yip, Hoi Shan Kwan. Molecular identification of Astragalus membranaceus at the species and locality levels [J]. J Ethnophar, 2006(106):222-229.

[3] 房樹標,李艷彥,劉必旺,等.紫外分光光度法測定蒙古黃芪中總黃酮的含量[J].中國藥物與臨床,2007,7(12):899-901.

[4] 石子儀,鮑忠,姜勇,等. 不同來源黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素的定量分析[J].中國中藥雜志,2007,32(9):779-783.

[5] 姚雪蓮,裴彩云,王宗權(quán).不同產(chǎn)地、不同采收期黃芪藥材及飲片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素含量測定[J].藥物分析雜志,2012,32(5):797-801,805.

[6] 趙強強,韓麗,歐水平. HPLC-ELSD法測定黃芪提取物中黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ及乙酰黃芪皂苷[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(11):56-58.

[7] 汪紅,王強.HPLC-ELSD法測定黃芪及其注射液中黃芪皂苷Ⅳ、Ⅲ和Ⅰ的含量[J].中國藥學(xué)雜志,2002,37(4):298-300.

[8] 趙靈芝,朱丹妮,嚴永清. HPLC-ELSD法測定黃芪中黃芪甲苷的含量[J].藥物分析雜志,1999,19(6):403-405.

[9] 馬玲,王坤,張?zhí)J艷,等.HPLC-ELSD 法測定不同生長年限黃芪中黃芪甲苷的含量[J].藥物分析雜志,2006,26(12):1869-1870.

[10] 王宗權(quán),賈繼明,宋劍.不同產(chǎn)地黃芪中黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪皂苷Ⅳ含量測定[J].藥物分析雜志,2010,30(7):1191-1194.

[11] 梁瑾,劉小花,任遠,等.HPLC-DAD-ELSD法同時測定黃芪中5個成分的含量[J].藥物分析雜志,2013,33(2):210-213.

[12] 劉小花,胡芳弟,李文,等.大黃中不同活性成分的綜合實驗[J].實驗技術(shù)與管理,2013,30(3):47-51.

[13] 劉小花,胡芳弟,崔方,等.將蘆丁提取分離實驗打造為綜合設(shè)計性實驗[J].實驗技術(shù)與管理,2012,29(10):160-162.

A new analysis method for pharmaceutical student experiment by HPLC to simultaneously determine five flavonoids’ compounds in RadixAstragali

Liu Xiaohua, Cui Fang, Zhang Mengting, Wang Ying, Feng Shilan

(School of Pharmacy,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)

High performance liquid chromatography (HPLC) technique is the compulsory courses of instrument analysis to undergraduates. The content determinations of more than 80% of Chinese herbs and preparations in the Chinese pharmacopoeia 2010 are using HPLC, so it is necessary to master the HPLC technique for training the pharmaceutical talents. The analysis of experimental method is established to simultaneous determination of five flavonoids’ compounds in RadixAstragaliby HPLC, and the method is simple and reproducible. It can be used as principles of quantitative analysis to flavonoids compounds of RadixAstragali, also as student analytical experiments of chemistry and preparation analysis in order to improve students grasping the technology of HPLC.

pharmaceutical determination; RadixAstragali; flavonoids; HPLC

10.16791/j.cnki.sjg.2016.02.008

實驗技術(shù)與方法

2015- 07- 08修改日期：2015- 08- 27

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目( lzujbky-2015-59)

劉小花(1976—),女,甘肅蘭州,博士,高級實驗師,蘭州大學(xué)藥學(xué)院實驗中心副主任,研究方向為藥物分析.

E-mail:liuxiaoh@lzu.edu.cn

R284.1

B

1002-4956(2016)2- 0024- 04