田間麥蚜和實驗室麥蚜抗藥性毒力測定和生化測定的研究

李宏德

（甘肅省定西市安定區(qū)種子管理站，甘肅　定西　743000）

田間麥蚜和實驗室麥蚜抗藥性毒力測定和生化測定的研究

李宏德

（甘肅省定西市安定區(qū)種子管理站，甘肅定西743000）

麥蚜是危害小麥的主要害蟲，主要通過取食和病毒傳播來損害農(nóng)作物。麥蚜的防治一直以化學(xué)防治為主，但由于其繁殖快，遺傳背景復(fù)雜等，致使其抗性發(fā)展速度快、程度高，對多種常用農(nóng)藥已產(chǎn)生了顯著抗性。筆者對從田間帶回的麥蚜進行室內(nèi)培養(yǎng)，并從其生測，生物化學(xué)角度對其抗性機理進行了研究，其結(jié)果如下：㈠分別用四大類別7種農(nóng)藥對田間麥蚜和室內(nèi)麥蚜進行了毒力測定，在所有的藥劑中，氧化樂果對室內(nèi)品系的致死中濃度最低，毒死蜱對室內(nèi)品系的致死中濃度最高。相對于室內(nèi)品系，田間麥蚜對氧化樂果產(chǎn)生了40倍的抗性，對菊酯類的敵殺死產(chǎn)生了11倍的抗性，對滅多威產(chǎn)生了3倍的抗性，對于辛硫磷，吡蟲啉，速滅殺丁，毒死蜱等抗性不明顯。㈡測定了田間麥蚜和室內(nèi)品系的乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的酶活性和動力學(xué)常數(shù)。田間麥蚜的乙酰膽堿酯酶的活性及Vmax均小于敏感品系，而Km值大于敏感品系。對于其羧酸酯酶的水解活性，當(dāng)以α-NA為底物時，田間麥蚜的羧酸酯酶水解活性明顯低于室內(nèi)品系的，而動力學(xué)常數(shù)Km值與Vmax均大于室內(nèi)品系；當(dāng)以β-NA為底物時，田間麥蚜的羧酸酯酶水解活性，動力學(xué)常數(shù)Km，Vmax與室內(nèi)麥蚜無明顯區(qū)別。

麥蚜；羧酸酯酶；乙酰膽堿酯酶；抗性機制；玻璃管藥膜法

一、概述

麥蚜是危害小麥的主要害蟲，麥蚜俗稱小麥膩蟲，麥蚜是甘肅省麥田發(fā)生的主要蟲害之一，主要發(fā)生種類有麥二叉蚜（SchizaphisgraminumRonbani）、麥長管蚜 （Macrosiphumavenae Fabricius）二種，其次還有麥無網(wǎng)長管蚜和禾縊管蚜等發(fā)生危害較輕的種類。麥蚜1年可發(fā)生10～20余代。麥蚜在適宜的環(huán)境條件下，都以無翅型孤雌胎生若蚜生活。在營養(yǎng)不足、環(huán)境惡化或蟲群密度大時，則產(chǎn)生有翅型遷飛擴散，但仍行孤雌胎生，只是在寒冷地區(qū)秋季才產(chǎn)生有性雌雄蚜交尾產(chǎn)卵。卵來春孵化為干母，繼續(xù)產(chǎn)生無翅型或有翅型蚜蟲。卵長卵形，長為寬的1倍，約1 mm，剛產(chǎn)出的卵淡黃色，逐漸加深，5d左右即呈黑色。干母、無翅雌蚜和有翅胎生蚜外部形態(tài)亦相似，除具性器外，一般個體稍小。麥蚜在寄主莖、葉及嫩穗上刺吸為害，吸取汁液使葉片出現(xiàn)黃斑或全部枯黃，生長停滯，分蘗減少，籽粒饑瘦或不能結(jié)實，對產(chǎn)量影響較大。麥二叉蚜還可傳播小麥病毒病。有些地方麥蚜發(fā)生高峰從2次增加到3次，防治次數(shù)多，用藥量加大。目前對麥蚜的防治仍以化學(xué)防治為主，化學(xué)農(nóng)藥無節(jié)制的濫用，造成該蟲的抗藥性迅速增加。所以對麥蚜抗藥性的研究就變的尤為重要。

（一）麥蚜的抗藥性現(xiàn)狀

魏岑等在1983～1987采用6個省市共8個地區(qū)麥蚜種群對6種農(nóng)藥進行了點滴法毒力測定，探明了甘肅張掖、高臺麥長管蚜對氧化樂果產(chǎn)生了10～15倍的抗性，隨后其他省區(qū)也陸續(xù)報道了麥蚜對氧化樂果的抗性，且產(chǎn)生抗性的種類也不斷增多，包括常用的有機磷和氨基甲酸酯類藥劑，其中特別對氰戊菊酯和溴氰菊酯的抗性最為突出。

蘇建昆等1986～1989年采用點滴法測定了揚州市郊區(qū)麥蚜對常用殺蟲劑的敏感度水平，禾谷縊管蚜對各種殺蟲劑的敏感程度依次為溴氰菊酯>久效磷>樂果>氧化樂果>對硫磷>馬拉硫磷>氰戊菊酯>敵百蟲。麥長管蚜對各種殺蟲劑的敏感程度依次為久效磷>馬拉硫磷>氧化樂果>對硫磷>氰戊菊酯>敵百蟲。2種麥蚜對各種殺蟲劑的敏感度有一定的同步關(guān)系。但禾谷縊管蚜對久效磷和氧化樂果的敏感度分別下降10和7倍。

劉慧平等1991～1995年采用點滴法測定了山西主要麥區(qū)晉中、臨汾、運城麥長管蚜對擬除蟲菊酯殺蟲劑溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯，甲氰菊酯和有機磷殺蟲劑氧化樂果、樂果、馬拉硫磷、辛硫磷、敵敵畏的敏感性。測定結(jié)果表明：晉中麥長管蚜已對氰戊菊酯和氯氰菊酯產(chǎn)生了一定水平的抗性，抗性指數(shù)分別為8.4和9.4倍。而對有機磷殺蟲劑除臨汾、晉中地區(qū)對氧化樂果和樂果產(chǎn)生了低水平抗藥性，抗性指數(shù)為5～7倍。

潘文亮等于2000年進行了吡蟲啉對麥長管蚜的抗藥性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所測不同地區(qū)的麥長管蚜對吡蟲啉的敏感性差異不大，主要原因是由于各地尚未大量使用吡蟲啉防治這兩種害蟲。

洪波等于2001～2002年采用點滴法測定了寧夏地區(qū)麥長管蚜、禾谷縊管蚜、麥二叉蚜對幾種殺蟲劑的敏感性。結(jié)果表明，3種麥蚜對滅多威、吡蟲啉、丁硫克百威敏感性高，而對敵敵畏、氯氰菊酯、氧化樂果和煙堿敏感性較低。比較不同地區(qū)麥蚜種群對殺蟲劑的敏感性，各地區(qū)麥長管蚜種群對丁硫克百威、滅多威的敏感度差異較大，對其它供試藥劑的敏感度差異相對較小。

王曉軍等2004年采用麥穗浸漬法在室內(nèi)測定了麥長管蚜和禾谷縊管蚜對吡蟲啉可濕性粉劑和乳油的敏感度。結(jié)果表明，禾谷縊管蚜對吡蟲啉的敏感度是麥長管蚜的3～4倍（基于LC50的比較）。在北京、河南、江蘇、湖北、四川等地同濃度的吡蟲啉對禾谷縊管蚜的防治效果要好于麥長管蚜，特別是在低濃度時尤為明顯［1-5］。

（二）抗藥性機理的研究

害蟲抗藥性是殺蟲劑選擇的結(jié)果，抗性機理可分為行為抗性、生理抗性和生化抗性（代謝抗性）3種，行為抗主要有2類：依賴刺激的行為回避和非依賴刺激的行為回避，生理、生化特性機理主要有以下幾個方面：表皮穿透速率敏感度降低，靶標(biāo)部位敏感度降低或改變，代謝酶活性升高。關(guān)于麥蚜的抗性機理問題，一般認(rèn)為，藥物在滲入表皮后達到作用部位靶體（如神經(jīng)系統(tǒng)）之前，藥物的新陳代謝增加變成無毒的結(jié)果。這種新陳代謝包含了一系列的酶，其中水解酶是主要的一種。有機磷農(nóng)藥是磷酸酯類化合物，具有酯基，可能被水解酶斷裂而失去毒力，水解酶的含量和活性越高，分解斷裂有機磷的能力越強，農(nóng)藥毒力越低。吡蟲啉是內(nèi)吸性殺蟲劑，同時具有胃毒和觸殺作用，該藥對飛虱、粉虱、蚜蟲等刺吸式口器害蟲及其抗藥性種群，具有優(yōu)異的防治效果，害蟲抗吡蟲啉的機理目前尚未明確。從現(xiàn)有結(jié)果來看，抗性的形成可能與害蟲解毒能力提高和靶標(biāo)部位對毒素敏感性降低有關(guān)，或可能伴隨著表皮穿透率降低。Choi等研究了桃蚜對吡蟲啉的抗性機理，利用14C-吡蟲啉研究了抗性和敏感品系體內(nèi)的殘留動態(tài)，與敏感品系相比，抗性品系體內(nèi)的吡蟲啉殘留量較少，對吡蟲啉的排泄量有所增加。抗吡蟲啉桃蚜品系的乙酰膽堿酯酶活性是敏感種群的1.4倍，但吡蟲啉對2個品系都沒有抑制作用PBO和異稻瘟凈增效試驗表明，吡蟲啉和PBO按1∶1和1∶5混合處理抗性個體，增效比值分別是69.4和250。吡蟲啉和IBP按 1∶1和1∶5混合處理抗性個體，增效比值分別是227和80.6，而對敏感品系的增效比值都在0.6～1之間。以α-NA和β-NA為底物測定了酯酶活性，抗性品系分別是敏感品系的1.4和2.4倍。以上研究表明，P450單加氧化酶和酯酶解毒能力的提高與抗性形成有關(guān)。

（三）羧酸酯酶與有機磷抗藥性分子機制

1.羧酸酯酶概述。羧酸酯酶（Carboxlesterase，CaEs，EC3.1.1.1）屬于α/β折疊水解酶家族，在水存在的條件下能夠水解代謝帶羧基的酯。α/β折疊水解酶包括磷酸三酯酶（如對氧磷酶）、膽堿酯酶、脂肪酶以及許多酶。這些酶的命名是基于它們8對幾乎平行的α/β結(jié)構(gòu)及其具有典型的可塑性的特性。蛋白質(zhì)的這種折疊屬性使其結(jié)構(gòu)域大小的變化范圍很大。羧酸酯酶存在于許多組織中，包括肝，腎，小腸，心臟，肌肉，肺，腦，睪丸，鼻和呼吸組織，脂肪組織，血細胞和血液。然而，羧酸酯酶的表達和活性依賴于組織，不同組織表達水平和活性有很大的變化。［6-10］

昆蟲中羧酸酯酶在細胞中可能主要以可溶性蛋白分子形式存在，羧酸酯酶分布的研究較少，在黑尾葉蟬、棉蚜、白背飛虱和褐飛虱中羧酸酯酶活性主要分布于上清液中（姚洪渭等，2001）。在銅綠蠅敏感品系和馬拉硫磷抗性品系中，羧酸酯酶活力均主要集中于上清液和線粒體中（Whyardetal，1994）。李騰武等（1999）對采自不同地區(qū)的小菜蛾種群幼蟲不同亞細胞層羧酸酯酶的活性分布結(jié)果表明，羧酸酯酶活性亞細胞分布沒有明顯差異，羧酸酯酶活性以線粒體層分布最高，占34%～52%。

CaEs可催化水解眾多藥物和內(nèi)源化合物，如鹽酸腎上腺素異戊酯、碳酸鹽、可卡因、水楊酸、辣椒素、棕櫚酸酰、氟哌啶醇、咪唑普利、吡咯烷生物堿、類固醇等。近年來研究發(fā)現(xiàn)CaEs還能水解老鼠胰腺和腎中類固醇中的脂肪酸酯［11-16］。此外，CaEs又被確定為代謝活化前藥過程中的一個關(guān)鍵性酶，可起到抑制藥物和活化前藥的作用［5］。

有關(guān)羧酸酯酶多態(tài)性已被報道了，其中值得一提的是鑒別了單個羧酸酯酶（CaE2或CES2）中15個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。隨著眾多酯酶被鑒定，酯酶家族一直不斷的壯大。Aldridge（1953）根據(jù)酯酶與有機磷的相互作用把酯酶分為三類：一是A-酯酶，這類酶能耐受有機磷，并把它們作為底物進行水解；二是B-酯酶，這類酶對對氧磷等有機磷很敏感，能被這些有機磷抑制；三是C-酯酶，既不被有機磷抑制，又不能水解這些有機磷。許多A酯酶能通過活性位點上乙酰化的半胱氨酸水解有機磷，這些酶被稱為磷酸三酯水解酶（Reiner，1993；Walker，1993）。羧酸酯酶主要指B-酯酶，這些酶具有一個絲氨酸活性位點，因此B酯酶和絲氨酸水解酶是同義的。

2.羧酸酯酶與有機磷抗藥性。Matsumura和Brown在1961年首次報道了抗馬拉硫磷蹌斑庫蚊（Calextarsalls）的羧酸酯酶活性高于敏感品系。世界各地報道的許多昆蟲對有機磷的抗性往往與高活性酯酶有關(guān)?？剐院兔舾袀€體酯酶活性的極大差異可以是量的差異，也可以是質(zhì)（酯酶發(fā)生變構(gòu)）的差異，或兩者兼有。關(guān)于酯酶在有機磷抗性棉蚜中的作用機理，Owusu（1994）認(rèn)為CarE很可能永久地與殺蟲劑結(jié)合，使殺蟲劑失效進而保護殺蟲劑作用的活性位點。Suzuki（1993）認(rèn)為CarE對殺蟲劑的解毒作用主要是酶與殺蟲劑的結(jié)合作用，CarE的所有同工酶都與有機磷抗性有關(guān)，其總酶活力與抗性程度有關(guān)。Satio（2000）通過殺螟硫磷對CarE活力的完全抑制這一實驗結(jié)果印證了Suzuki的觀點。

（四）乙酰膽堿酯酶與有機磷抗藥性分子機制

1.乙酰膽堿酯酶概述。膽堿酯酶（cholinesterase，ChE）是一類絲氨酸水解酶，同其他絲氨酸水解酶相比，在活性中心絲氨酸周圍有一個共同的五肽序列，并在膽堿酯酶和甲狀腺球蛋白的羧基端區(qū)之間具有明顯的序列同源性。依其底物特異性可分為乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶（BuChE）兩種。在脊椎動物體內(nèi)，膽堿有兩種：AChE和BuChE，兩者的基因結(jié)構(gòu)、氨基酸序列及空間三維構(gòu)型均顯示了很高的同源性，兩者的主要差異在于對乙酰膽堿（ACh）、丁酰膽堿（BuCh）兩種底物有明顯不同的選擇性。昆蟲體內(nèi)，膽堿酯酶僅有一種，該酶對底物的選擇性位于AChE和BuChE之間。但對ACh的選擇性仍強于BuCh，所以昆蟲體內(nèi)的膽堿酯酶仍習(xí)慣性地稱為AChE。AChE主要分布于動物的神經(jīng)系統(tǒng)和脊椎動物的紅血球以及肌肉中。AChE的體軀分布因昆蟲種類而異。Booth等（1987）分析了八種昆蟲包括嶂螂、蟋蟀、蜜蜂、家蠅、蚊子、皮蠢、刺蠟和納的AChE的組織分布，發(fā)現(xiàn)其遍布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括突觸和非突觸結(jié)構(gòu)。在鞘翅目的棉鈴象甲（Anthonomusgrandis）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、二化螟（Chilosuppressalis）、黑腹果蠅（Drosophila melanogast）、騷擾角（Haematohia irritans）中，AChE主要分布在頭胸部，以腹部最少（Bulland Lundquist，1968；Melanson等，1985；Xu and Bull，1994；高希武等，1998；彭宇，2000）。對于蜚鐮目的美洲大鐮和白背飛虱（Sogatella furcifera）其頭部、胸部、腹部身體的各部分AChE活性相差不大（唐振華，1993；姚洪渭等，2001）。另外，在一些昆蟲的血淋巴（Arpagaus and Toutant，1985）中也發(fā)現(xiàn)了AChE的存在?？梢?，AChE不僅存在于昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也存在于其它的組織器官。

2.乙酰膽堿酯酶靶標(biāo)不敏感與有機磷抗藥性。乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性的酶。在膽堿能突觸間，該酶能降解乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)對后膜的刺激作用，保證神經(jīng)沖動在突觸間正常傳導(dǎo)。AChE是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)。有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑首先和AChE形成一個復(fù)合體，然后發(fā)生酶的磷?；虬被柞；?，這也就造成了酶的被抑制。AChE被抑制后，使ACh在突觸處積累，過量的ACh造成去極化阻斷，從而抑制了正常的神經(jīng)傳導(dǎo)，神經(jīng)傳導(dǎo)的阻斷必然會影響整個生理生化過程的失調(diào)與破壞，最終造成昆蟲的死亡。

在抗性昆蟲，AChE活性往往增強，而更多是由于AchE變構(gòu)所致。也有研究認(rèn)為抗性與AchE蛋白多態(tài)性的丟失相關(guān)［17-23］。

乙酰膽堿酯酶靶標(biāo)不敏感性是害蟲對有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的主要原因（Feyereisen1995）。自從首次在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）乙酰膽堿酯酶基因中發(fā)現(xiàn)與抗藥性有關(guān)的突變位點（F115S，I199V，G303A，F(xiàn)368Y）后（Muteroet al.，1994），隨后又在馬鈴薯葉甲（Leptinotarsa decemlineata）（Zhu et al.，1996；Kim et al.，2006），家蠅（Musca domestica）（Walsh et al.，2001），桔小實蠅（Bactrocera dorsalis）（Hsu et al.，2006），棉蚜 （Aphis gossypii）（Li and Han 2004；Andrews et al.，2004；Toda et al.，2004；Benting and Nauen 2004），麥長管蚜（Sitobion avenae）（Chen et al.，2007），桃蚜（Myzus persicae）（Nabeshima et al.，2003），淡色庫蚊（Culexpipiens）（Weill et al.，2003；Haoues et al.，2007），瘧蚊（Anopheles gambiae）（Weill et al.，2003），三帶喙庫蚊（Culextritaeniorhynchus）（Oh et al.，2006），二斑葉螨（Tetranychus urticae）（Anazawa et al.，2003），棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）（Ren et al.，2002），蘋果蠹蛾（Cydia pomonella）（Stefano et al.，2006），Bractocera oleae（Vontas et al.，2002），小菜蛾（Jietal.，2005；Lee etal.，2007）的Ⅰ型或Ⅱ型乙酰膽堿酯酶中發(fā)現(xiàn)一些與抗藥性相關(guān)的突變位點。

（五）研究意義

目前國內(nèi)外科學(xué)家對麥蚜的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、防治等方面報道較多，而對抗藥性的研究僅限于表層的研究，如對農(nóng)藥的敏感性，致死中濃度的研究較多。而對抗藥性機理，分子蛋白等方面的報道相對來說較少。所以本實驗通過對兩種種群麥蚜的毒力測定及羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶活性及動力學(xué)參數(shù)進行測定對比，明確了羧酸之酶和乙酰膽堿酯酶在麥蚜產(chǎn)生抗性過程中所起的作用。為田間麥蚜的抗性診斷及治理提供可靠的理論依據(jù)和切實可行的方法。

二、麥蚜的毒力測定

（一）材料與方法

1.供試藥劑。75%氧樂果原藥（原中國人民解放軍第九七一五工廠），40%辛硫磷乳油 （江蘇寶靈化工股份有限公司），40%毒死蜱乳油（江蘇寶靈化工股份有限公司），20%滅多威可濕性粉劑（英國LK作物科學(xué)有限公司），20%速滅殺丁，25%敵殺死，20%滅多威，95%吡蟲啉。

2.田間麥蚜與敏感麥蚜的選育

（1）供試蟲源。田間麥蚜是從田間麥田隨機采集帶有麥蚜葉片，帶回室內(nèi)，并在不接觸藥劑的情況下進行室內(nèi)飼養(yǎng)。室內(nèi)麥蚜為實驗室在不接觸藥劑下長期飼養(yǎng)蟲源.

（2）麥蚜的飼養(yǎng)。在上方為玻璃、四周為100目尼龍紗圍住的養(yǎng)蟲籠中單獨飼養(yǎng)田間麥蚜和敏感麥蚜，養(yǎng)蟲籠基本可以避免外界昆蟲的進入，麥苗正常飼養(yǎng)，所用培養(yǎng)土為營養(yǎng)土。每盆土中種20～30粒小麥種子，于正常室溫光照下飼養(yǎng)，待麥苗長到一定高度，將麥蚜均勻的接到麥苗上，繼續(xù)培養(yǎng)，每天澆水一次，當(dāng)麥蚜長成無翅成蚜?xí)r即可選用。

（3）毒力測定方法。毒力測定采用Shotkoski等（1990）和高希武等［16］的玻璃管藥膜法，略有改進。先將殺蟲藥劑用丙酮配置成1 000 mg/L的母液，使用時用丙酮稀釋，按等比或等差稀釋成需要的濃度［16］。從稀釋好的藥液中吸取200 μL加入到直徑2 cm，高5.2 cm的玻璃管（內(nèi)表面積36 cm2）中，將玻璃管放于桌上均勻滾動，待丙酮揮發(fā)后用于毒力測定。對照單獨用丙酮處理。挑取健康一致的無翅成蚜進行試驗，每個制備好的藥膜管放置20頭蚜蟲，將試管口用棉花堵住，防止蚜蟲跑出。蚜蟲挑選時，應(yīng)在所有麥苗上均勻選取，不應(yīng)只在一盆麥苗上挑選，這樣不能代表整個種群，實驗結(jié)果勢必不會準(zhǔn)確。麥蚜盡量選擇個頭較大，大小較一致的無翅成蚜。在室內(nèi)正常飼養(yǎng)條件下（溫度18～25℃，相對濕度大約為50%～70%，光照為17L∶7D）［16］，3 h后檢查死亡率，其中只有一條腿動或者完全不動者記為死，記錄死亡數(shù)，用polo軟件計算出LC50，斜率等。每個藥劑六七個濃度，每個濃度3次重復(fù)。

本實驗中先對7種農(nóng)藥進行預(yù)實驗，分別記錄每種農(nóng)藥對田間麥蚜和敏感麥蚜致死的大概中心濃度.以此濃度為中間值，上下共設(shè)六組濃度梯度，彼此間為2倍的關(guān)系，稀釋時所用溶劑為丙醇，每組設(shè)3次重復(fù)。

（二）結(jié)果與分析

實驗結(jié)果如下表所示，田間麥蚜和室內(nèi)麥蚜對新煙堿類藥劑吡蟲啉的LC50值分別為0.4548和1.63417 mg/L；對氨基甲酸酯類藥劑滅多威LC50值為2.19450和0.73026 mg/L；對有機磷類藥劑氧樂果，辛硫磷、毒死蜱的LC50值0.586～18.336 mg/L和0.045～9.45 mg/L。田間麥蚜對7種農(nóng)藥的敏感度由高到低依次為吡蟲啉，毒死蜱，辛硫磷，滅多威，速滅殺丁，氧化樂果，敵殺死。室內(nèi)麥蚜對7種農(nóng)藥的敏感度由高到低為氧化樂果，滅多威，吡蟲啉，敵殺死，辛硫磷，速滅殺丁，毒死蜱

田間麥蚜對三種藥劑的抗性相對室內(nèi)麥蚜來說非常明顯，其中，對于氧化樂果，敵殺死，滅多威三種農(nóng)藥的LC50，田間麥蚜的LC50分別為室內(nèi)麥蚜的40倍，11倍，3倍。由表1可看出，田間麥蚜對于有機磷類的氧化樂果的抗性最高。

表1　田間麥蚜與敏感麥蚜的毒力測定結(jié)果

（三）討論

關(guān)于蚜蟲的生物測定方法有浸蟲法、浸葉片法、點滴法、噴霧法等多種，本實驗為了便于操作、節(jié)省時間，選擇了玻璃管藥膜法。處理后檢查死亡率的時間是影響實驗結(jié)果的一個重要因子，通過觀察不同時間的死亡率，最后確定了處理后3 h作為標(biāo)準(zhǔn)。玻璃管藥膜法在國外也是一種常用的藥劑敏感度測定方法。

點滴法是一種比較精確的方法，但是其致命的缺點是要求測定人員技術(shù)熟練，特別是對蚜蟲類的測定，在國外很少采用；葉片藥膜法由于小麥葉片比較狹窄不適于用于葉片藥膜法；浸蟲法的程序也是比較復(fù)雜的。相比之下玻璃管藥膜法易用性要明顯優(yōu)于其他方法［16］。

對兩類麥蚜毒力測定結(jié)果可看出，田間麥蚜相對于室內(nèi)品系來說對有機磷類農(nóng)藥的氧化樂果抗性最高，而對同是有機磷類的毒死蜱和辛硫磷致死中濃度很低，非常敏感。對于氨基甲酸酯類的滅多威有一定的抗性。對于菊酯類的敵殺死抗性很高，而對于同是菊酯類的速滅殺丁來說敏感度較高。由此可見，田間麥蚜對于某些殺蟲劑有明顯抗性，而對于一些殺蟲劑來說其敏感度較高。

三、羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶與田間麥蚜抗藥性關(guān)系研究

羧酸酯酶（CarE）是昆蟲體內(nèi)重要的水解酶之一，一般認(rèn)為它在有機磷及擬除蟲菊酯殺蟲劑抗性中起著重要的作用。乙酰膽堿酯酶（AChE）作為有機磷和氨基甲酸酯類藥劑的作用靶標(biāo)，在害蟲抗藥性形成過程中具有重要作用。了解羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶特性的變化對研究麥蚜的抗性機制有著重要的作用。

（一）材料與方法

1.藥劑。75%氧樂果原藥（原中國人民解放軍第九七一五工廠）；α-乙酸萘酯（α-NA）、β-乙酸萘酯（β-NA）、固藍B鹽、毒扁豆堿和牛血清白蛋白（BSA）均購自 SIGMA-ALDRICH，考馬斯亮藍G-250。

2.試蟲來源。同上。

（二）乙酰膽堿酯酶比活力測定

1.試劑配制。配置0.1 mg/mL的牛血清蛋白液；磷酸緩沖液（pH7.0，0.04M）。

考馬斯亮藍G-250試液的配置：考馬斯亮藍G-250 100 mg+95%乙醇50 ml+85%H3PO4100 mL，蒸餾水定容至1 L，過濾。

配置ATCH（硫代乙酰膽堿）10 mm/l；DTNB（5，5-二硫雙-2-硝基苯甲酸）0.0125 mm/l。

2.乙酰膽堿酯酶酶液的制備。取田間麥蚜和敏感麥蚜各300頭，在冰水浴中預(yù)冷20 min，于4℃，10 000 g冷凍離心20 min，取上清，離心后，若有脂肪體可抽取過濾，抽濾瓶應(yīng)預(yù)先冷凍。將上清液分裝于預(yù)冷好的離心管中，備用。

3.蛋白質(zhì)（pr）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。參照Bradford［22］考馬斯亮藍G-250法將試管分成8組，每組設(shè)3個重復(fù)，按照表2加入試劑。

Buffer為不含Triton x-100（聚乙二醇辛基苯基醚）的PH7.5磷酸緩沖液。大量的去污劑如Triton X-100等會干擾測定?；靹?，室溫放置10～20 min，分光光度計595 nm處測定吸光值，重復(fù)三次取平均值。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度（mL）為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，做出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2　蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)加試劑

4.樣本測定。挑取田間麥蚜和敏感品系無翅健壯成蚜各300頭，加入1 mLpH 7.0，0.04 M磷酸緩沖液勻漿，4℃，10 800 rpm離心15 min，取上清液0.05 mL，加入磷酸緩沖液0.95 mL，加入染色液5 mL，混合均勻后在2 min至1 h內(nèi)測OD595值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到麥蚜蛋白質(zhì)含量。

5.乙酰膽堿酯酶活力測定。采用Gorun（1978）改進的Ellman方法，取四支試管，分別加入0.1 mL碘化硫代乙酰膽堿（ATCh）（10 mmol/L）作底物，前三支試管再分別加入0.1 mL AChE反應(yīng)生成硫代膽堿和乙酸，在30℃水浴中反應(yīng)15 min，振蕩3次。然后加入0.9 mL顯色劑（DTNB）顯色并中止反應(yīng)，第四支試管為空白管，在加入顯色劑后補加0.1 mL酶液，將試劑振蕩均勻，在412 nm下測定光密度（OD）值［17］。按照如下公式即可算出乙酰膽堿酯酶的比活力。

AChE的比活力比活力（mol/mg.Pr.min）=（ODV總）/（TPr. VE）

6.乙酰膽堿酯酶Km和Vmax的測定。Km是酶的特征性常數(shù)，該值的大小表明酶和底物之間親和力的高低［21］。將麥蚜乙酰膽堿酯酶液稀釋成所需倍數(shù)用于測定羧酸酯酶的Km及Vmax，將試管分成7組，每組設(shè)三個重復(fù)和一個對照，按照表3加入試劑［1］。

室溫放置15 min，600 nm（或550 nm）下比色測定OD值。

根據(jù)蛋白含量的測定，計算出不同底物濃度下羧酸酯酶的比活力，然后根據(jù)Enzif軟件計算出Km和Vmax值。

表3　乙酰膽堿酯酶Km和Vmax應(yīng)加試劑

（三）羧酸酯酶活力測定

1.試劑配制。配制0.1 mg/mL的牛血清蛋白液及考馬斯亮蘭顯色劑，0.03 Mα-NA，β-NA，α-NPr含0.03 M毒扁豆堿，磷酸緩沖液PBS（pH7.0，0.04 M）；顯色劑：1%固蘭B鹽+5%SDS（2：5）。

2.酶液制備。挑取田間麥蚜和敏感品系無翅健壯成蚜各300頭，加入1 mLpH 7.0，0.04 M磷酸緩沖液勻漿，4℃，10 800 rpm離心15 min，上清液為酶液母液，將其分裝置于-20℃，根據(jù)不同品系的抗性程度稀釋20～30倍用于實驗。

3.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。將試管分成7組，每組設(shè)3個重復(fù)，按照表4加入試劑。

表4　羧酸酯酶活力測定應(yīng)加試劑

混勻，室溫放置10～20 min，分光光度計595 nm處測定吸光值，重復(fù)三次取平均值。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度（mL）為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，做出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.麥蚜羧酸酯酶活力的測定。羧酸酯酶比活力測定方法參照高希武［22］的方法并稍加修改。取七支試管分別加入PH 7.0，0.04 mol/L磷酸緩沖液0.9 mL，3×10-4 M底物（含毒扁毒堿，1：1）1.8 mL，前六支試管中再分別加入適當(dāng)稀釋的酶液100 μL，30℃水浴中反應(yīng)15 min后，加入0.9 mL顯色劑（1%固藍B鹽：5%SDS2：5）終止反應(yīng)。第七支試管為空白管，在加入顯色劑后補加100 uL酶液。靜置15 min后，在分光光度計中于600 nm（α-NA）或550 nm（β-NA）波長測定光吸收值。根據(jù)得到的OD值和酶液蛋白含量，按照如下公式即可算出羧酸酯酶的比活力。比活力（mol/mg.Pr.min）=（ODV總）/（TPr.VE）

其中：V總為反應(yīng)總體系（mL）；T為反應(yīng)時間（min）；Pr.為蛋白含量（mg/mL）；VE為反應(yīng)酶液體積（mL）。

5.麥蚜羧酸酯酶Km及Vmax測定。將麥蚜羧酸酯酶酶液稀釋成所需倍數(shù)用于測定羧酸酯酶的Km及Vmax，將試管分成7組，每組設(shè)三個重復(fù)和一個對照，按照表5加入試劑。

室溫放置15 min，600 nm（或550 nm）下比色測定OD值。

根據(jù)蛋白含量的測定，計算出不同底物濃度下羧酸酯酶的比活力，然后根據(jù)Enzif軟件計算出Km和Vmax值。

（四）結(jié)果與分析

1.ACHE比活力測定。ACHE活力測定結(jié)果如表6，田間麥蚜AchE的比活力1.59±0.016 mol/mg.pr.min，室內(nèi)麥蚜AchE的比活力為3.26±0.104 mol/mg.pr.min，室內(nèi)麥蚜的AchE比活力是田間麥蚜的2倍。

表5　麥蚜羧酸酯酶Km及Vmax測定應(yīng)加試劑

表6　田間麥蚜和室內(nèi)品系乙酰膽堿酯酶比活力測定結(jié)果

2.ACHE的km值與Vmax。田間麥蚜的km值為25.76 mol/L大于室內(nèi)麥蚜的20.4 mol/L，而最大反應(yīng)速度為1.867 mol/mg.pr.min小于室內(nèi)麥蚜的2.850mol/mg.pr.min。

表7　田間麥蚜和室內(nèi)品系乙酰膽堿酯酶的Km與Vmax

3.羧酸酯酶比活力。當(dāng)?shù)孜餅棣?NA時，田間麥蚜的比活力為48.65 mol/mg.Pr.min，小于室內(nèi)麥蚜的121.11 mol/mg. Pr.min。而當(dāng)?shù)孜餅棣?NA時，田間麥蚜的比活力為497.46± 8.50 mol/mg.Pr.min，大于室內(nèi)麥蚜的348.11±1.29 mol/mg.Pr. min。

表8　田間麥蚜和室內(nèi)品系羧酸酯酶的比活力

4.羧酸酯酶km值與Vmax。由實驗結(jié)果表明，田間品系羧酸酯酶Km值均大于敏感品系（1.05～1.22倍）；抗性品系羧酸酯酶最大反應(yīng)速度Vmax也均大于敏感品系1.15倍左右。

表9　室內(nèi)麥蚜及田間麥蚜羧酸酯酶的Km和Vmax值

（五）討論

害蟲的抗藥性問題是害蟲綜合治理中最重要的問題之一，明確害蟲抗藥性機制是害蟲抗藥性治理的基礎(chǔ)。長期以來，人們一直關(guān)心對抗性生化機制的研究。近來，已有研究表明昆蟲對殺蟲劑的代謝能力提高是抗藥性產(chǎn)生的重要原因，主要表現(xiàn)為一系列解毒酶活性的提高［23］。

乙酰膽堿酯酶是多種藥劑的靶標(biāo)酶，在正常昆蟲中，殺蟲劑使AchE活性降低，神經(jīng)突觸間的傳遞物質(zhì)乙酰膽堿的正常釋放或接收遭到破壞，打斷神經(jīng)傳導(dǎo)，使昆蟲死亡；而在抗性昆蟲中，由于藥劑的長期選擇作用，突觸間的物質(zhì)傳遞活動已對藥劑的干擾或破壞作用有了很強的適應(yīng)性，發(fā)生了某些改變，甚至完全可以不受藥劑的干擾而進行正常的神經(jīng)傳導(dǎo)活動，這樣毒物藥劑就失去了效用，昆蟲不能因神經(jīng)傳導(dǎo)中斷而死亡，害蟲表現(xiàn)為抗藥性。Torre，etal.（2002）曾指出，AChE是反映有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥污染最有效的生物標(biāo)記酶.因此研究昆蟲AChE的特性及有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑對其抑制作用，是研究這些殺蟲劑的作用機理和抗性機理的基礎(chǔ)。

本實驗結(jié)果顯示田間麥蚜的乙酰膽堿酯酶的活性與Vmax均小于室內(nèi)品系，而田間麥蚜的Km值大于室內(nèi)品系，Km是酶的特征性常數(shù)，該值的大小表明酶和底物之間親和力的高低。可見田間麥蚜的AchE與底物的結(jié)合力較低，田間麥蚜的AChE對殺蟲劑的敏感性下降，可能是田間麥蚜AChE的量過高所致，也可能是AChE性質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，這還有待進一步研究證明。

羧酸酯酶是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶系，它不僅具有廣泛的底物特異性，可以水解羧酸酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵，在對含酯鍵殺蟲劑的水解方面起著重要作用，而且還可以作為結(jié)合蛋白與殺蟲劑分子不可逆結(jié)合，使其不能到達靶標(biāo)，從而起到對殺蟲劑的隔離作用。昆蟲體內(nèi)該酶活性的高低會直接影響其對殺蟲藥劑的抵抗能力。

本實驗結(jié)果顯示，當(dāng)以α-NA為底物時，田間麥蚜的羧酸酯酶水解活性明顯低于室內(nèi)品系的，而動力學(xué)常數(shù)Km值與Vmax均大于室內(nèi)品系；當(dāng)以β-NA為底物時，田間麥蚜的羧酸酯酶水解活性，動力學(xué)常數(shù)Km，Vmax均與室內(nèi)麥蚜無明顯區(qū)別。

由上述結(jié)果可推斷，田間麥蚜對于不同種類的農(nóng)藥產(chǎn)生高低不同的抗性與其體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶有顯著關(guān)系而與羧酸酯酶關(guān)系不大。

四、結(jié)論

文章對田間麥蚜和實驗室麥蚜進行了毒力測定以及生化測定。毒力測定使用了四大類別7種農(nóng)藥，結(jié)果顯示，田間麥蚜相對于室內(nèi)麥蚜來說，對于對于有機磷類的氧化樂果，菊酯類的敵殺死，氨基甲酸酯類的滅多威三種農(nóng)藥的LC50，田間麥蚜的LC50分別為敏感麥蚜的40倍、11倍、3倍?？剐悦黠@。對于辛硫磷，毒死蜱，速滅殺丁和吡蟲啉，田間麥蚜的敏感性較高，沒有表現(xiàn)出抗性。由此可見，田間麥蚜對于某些農(nóng)藥

表現(xiàn)出明顯抗性，該類農(nóng)藥應(yīng)是經(jīng)常用于麥蚜治理。

田間麥蚜對于生化測定來說，田間麥蚜的乙酰膽堿酯酶的活性及Vmax均小于室內(nèi)品系，而Km值大于室內(nèi)品系。對于其羧酸酯酶的水解活性，當(dāng)以α-NA為底物時，田間麥蚜

的羧酸酯酶水解活性明顯低于室內(nèi)品系的，而動力學(xué)常數(shù)Km值與Vmax均大于室內(nèi)品系；當(dāng)以β-NA為底物時，田間麥蚜的羧酸酯酶水解活性，動力學(xué)常數(shù)Km，Vmax均與室內(nèi)麥蚜無明顯區(qū)別。這可能是由于本實驗所用麥蚜均采自田間田間，對其用藥背景不了解，其抗性背景較復(fù)雜.由上述結(jié)果可推斷，田間麥蚜對于不同種類的農(nóng)藥產(chǎn)生高低不同的抗性與其體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶有顯著關(guān)系而與羧酸酯酶關(guān)系不大。

本試驗的結(jié)果只是初步研究了田間麥蚜的抗藥性及抗性機制產(chǎn)生的原因.若要進一步了解乙酰膽堿酯酶是如何參與其抗性過程還需進一步做分子生物學(xué)的實驗.

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（編輯：張瓊瓊）

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1673-9019（2016）02-00-0

2016-01-06

李宏德（1990-），男，甘肅定西人，主要從事馬鈴薯良種生產(chǎn)工作。