董 振，李軍生 ，閻柳娟，黃國霞，王 微

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院, 廣西 柳州 545006 ；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室,廣西 柳州 545006；3廣西高校糖資源加工重點實驗室， 廣西 柳州 545006)

科研與開發(fā)

分子動力學(xué)模擬二硫鍵對大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)及表面活性的影響

董 振，李軍生 ，閻柳娟，黃國霞，王 微

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院, 廣西 柳州 545006 ；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室,廣西 柳州 545006；3廣西高校糖資源加工重點實驗室， 廣西 柳州 545006)

采用分子動力學(xué)模擬分析了二硫鍵對天然和還原狀態(tài)下大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)及其表面活性的影響。模擬結(jié)果表明，二硫鍵斷裂后蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定性降低，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象和二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；二硫鍵全部斷裂會增大蛋白質(zhì)分子的柔性，有利于表面活性的提高。而斷開Cys88-298和Cys12-45、Cys88-29之間的二硫鍵會增大蛋白質(zhì)疏水區(qū)域的溶劑可及表面，說明這兩種斷裂方式會增大蛋白質(zhì)分子在界面的吸附量，有利于界面張力的降低，可以有效提高蛋白質(zhì)的表面活性。

分子動力學(xué)模擬；11S球蛋白；二硫鍵；表面活性

表面活性劑在日常生活、工業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要位置，年使用量不斷增加。據(jù)統(tǒng)計[1]，2012年全球表面活性劑的產(chǎn)量超過1200萬噸，僅我國在2013年的產(chǎn)量就超過200萬噸。目前市面上見到的多是化學(xué)類表面活性劑，它的存在會導(dǎo)致土壤、水質(zhì)等污染，給生態(tài)環(huán)境帶來了不小的壓力[2]。用做殺菌消毒劑的陽離子表面活性劑對環(huán)境污染最大，陰離子表面活性劑次之。表面活性劑排放到水中很容易引起魚類的中毒，這些污染的食品進(jìn)入人體后會因為對多種酶的抑制作用降低人體免疫力。因此我們急需開發(fā)一種更為綠色、環(huán)保的表面活性劑。

大豆11S含有較多疏水性、親水性氨基酸，理論上具備表面活性劑的性質(zhì)。11S球蛋白中含有較多二硫鍵，將交替出現(xiàn)的堿性亞基和酸性亞基連接成一個二聚體，是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要因素之一[3]；正因為如此，堿性亞基含有的大部分疏水性氨基酸被包裹在分子內(nèi)部，導(dǎo)致天然11S球蛋白表面的疏水性氨基酸含量較少，其表面活性較差。

為了開發(fā)蛋白質(zhì)基表面活性劑，本實驗室進(jìn)行了大量研究[4-6]，前期工作已經(jīng)證實二硫鍵斷裂可以大幅提高蛋白質(zhì)的表面活性，但是受實驗手段和技術(shù)的限制，斷開二硫鍵后大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)的變化情況以及功能性質(zhì)變化的微觀理論至今沒有明確的解釋。分子動力學(xué)模擬隨著計算機性能的提高得到應(yīng)用，使解釋分子微觀變化的原因成為可能。本文主要采用動力學(xué)采用排列組合的方式模擬二硫鍵對維持大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要性，并揭示二硫鍵對大豆11S球蛋白表面活性的影響。

1 模型與方法

1.1 大豆11S球蛋白模型

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索蛋白質(zhì)序列，以大豆11S球蛋白為模版(編號為1FXZ)采用在線建模的方法補齊缺失的氨基酸，形成完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型。然后刪除三聚體中的其他原子得到Asn10-Leu336含有兩個二硫鍵的結(jié)構(gòu)模型，如圖1所示。天然大豆11S球蛋白鏈上的胱氨酸保持原有狀態(tài)，模擬未斷裂狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)體系。而還原狀態(tài)下的11S球蛋白在半胱氨酸上依次添加H+離子模擬蛋白質(zhì)二硫鍵斷裂的狀態(tài)。

圖1 大豆11S球蛋白的結(jié)構(gòu)模型(Asn10-Leu336)

1.2 模擬方法

模擬溫度設(shè)置為300K，選擇GROMACS的全原子立場和SPC水模型。在蛋白質(zhì)周圍加入 的水分子形成一個水盒子模擬體系作為周期性邊界進(jìn)行動力學(xué)模擬。為保持體系成電中性，需添加9個正離子。模擬數(shù)值準(zhǔn)確有效需要穩(wěn)定的模擬體系，首先，模擬體系采用40000步最速下降法進(jìn)行能量最小化。模擬過程中，采用PME[7]算法計算長程靜電相互作用，積分步長設(shè)置為2fs，在NVT(保持原子數(shù)、體積、溫度恒定)系綜下，保持7S堿性蛋白原子不變，體系平衡且對水優(yōu)化800ps；然后采用NPT(保持原子數(shù)、壓力、溫度恒定)系綜，對11S大豆球蛋白和水分子體系進(jìn)行平衡800ps。在該系綜條件下，保持體系壓強P恒定，整個盒子模擬體系的體積持續(xù)變化，當(dāng)模擬體系穩(wěn)定時，其體系的體積會圍繞在一定值處上下波動，選擇該體積平均值作為體系模擬的體積。模擬全程可以使用VMD軟件觀察每個階段體系和蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同狀態(tài)半胱氨酸相對位置分析

圖2 不同狀態(tài)大豆球蛋白中半胱氨酸殘基之間的距離，A圖為cys12-45之間的位置變化圖，B為cys88-298之間的位置變化圖，a:天然11S球蛋白，b:斷開Cys88-298，c:斷開Cys12-45，d:斷開Cys88-298和 Cys12-45

天然大豆球蛋白含有2對二硫鍵。首先考察在模擬過程中半胱氨酸的位置變化，判斷二硫鍵是否斷裂，模擬結(jié)果如圖2所示。由圖可知，天然蛋白質(zhì)具有完整的二硫鍵，半胱氨酸殘基的運動受到了該鍵的限制，只在小范圍內(nèi)做諧振運動，當(dāng)二硫鍵被斷開后，可以發(fā)現(xiàn)半胱氨酸的運動范圍較大，距離較遠(yuǎn)。

2.2 二硫鍵對均方根偏差(RMSD)的影響

RMSD可以用來分析蛋白質(zhì)在模擬體系中運動變化情況，其值越大表明在分子在運動過程中蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性變化越大[8]。通過RMSD的計算除了可以判斷模擬體系是否達(dá)到平衡要求之外，還可以得出不同斷裂位置的二硫鍵對維持11S球蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的影響。如圖3所示，黑色線條代表天然大豆11S球蛋白的RMSD變化趨勢，所有模擬體系均在3.5ns時候維持恒定。從圖2可以看出，斷開其中任何一條二硫鍵都可以改變蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。其中變化幅度最大的是斷開Cys12-45、Cys88-298之間的二硫鍵，在這種狀態(tài)下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開程度最大。而斷開Cys88-298之間的二硫鍵在模擬后期蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開后又出現(xiàn)了相互吸引，這可能是在后期由于疏水相互作用等非二硫鍵的原因?qū)е路肿酉嗷ノ斐傻?。從整體RMSD角度分析，斷開Cys88-298的穩(wěn)定性變化最小，說明斷開僅僅Cys88-298之間的二硫鍵對蛋白質(zhì)表面活性的提高影響可能不大。

圖3 斷裂不同位置二硫鍵的11S球蛋白模擬軌跡RMSD，a:天然11S球蛋白，b:斷開Cys88-618，c:斷開Cys12-618，d:斷開Cys88-618和 Cys12-618

Figure.3 Root mean square fluctuations of different cleaved disulfide bond position in glycinin, a: native glycinin,b: cleaved Cys88-618, c: cleaved Cys12-618, d: cleaved Cys88-618 and Cys12-618

2.3 二硫鍵對漲落均方根(RMSF)的影響

為了考察二硫鍵對大豆11S球蛋白構(gòu)象和功能的影響，我們對體系中蛋白質(zhì)骨架的漲落均方根進(jìn)行深入的研究。如圖4所示，11S球蛋白有6個較大的loop區(qū)，所有l(wèi)oop區(qū)都表現(xiàn)出較高的分子漲落，同天然大豆11S球蛋白相比，斷開不同位置的二硫鍵的蛋白質(zhì)的漲落有明顯的不同。在第一個loop區(qū)，斷開Cys12-45和Cys12-45、Cys88-298二硫鍵的蛋白表現(xiàn)出比天然蛋白質(zhì)更大的分子柔性，斷開Cys88-298二硫鍵在該區(qū)域的分子柔性均下降。在第二個loop區(qū)域，斷開Cys88-298和Cys12-45、Cys88-298之間的二硫鍵都會增加蛋白質(zhì)分子的柔性。值得注意的是在第3和第5個loop區(qū)，斷開任何一個二硫鍵都會使分子分柔性下降。而在第4個loop結(jié)果與第4和第5個loop結(jié)果恰恰相反，分子柔性都呈增大趨勢。而在第六個loop，斷開任何一個二硫鍵都會提高蛋白質(zhì)分子的柔性且提高幅度沒有差異。從所有蛋白質(zhì)的RMSF可以看出，斷開全部二硫鍵后，幾乎所有的loop區(qū)都大于天然大豆11S球蛋白的分子柔性。對于二硫鍵斷開后RMSF較小的原因，Qiu[9]認(rèn)為可能是形成了范德華力或疏水相互作用造成的。蛋白質(zhì)分子分柔性越大，乳化性等功能性質(zhì)越好[10]。因此，斷開Cys12-45、Cys88-298二硫鍵能夠大大提高大豆11S蛋白的分子柔性，從而提高蛋白質(zhì)的乳化(穩(wěn)定)性和起泡(穩(wěn)定)性。從該RMSF結(jié)果分析可以得出，斷開不同位置的二硫鍵對蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)影響不同，有選擇、控制性的斷開二硫鍵才能有針對性的提高11S球蛋白的表面活性。

圖4 斷裂不同位置二硫鍵的11S球蛋白模擬軌跡RMSF，a:天然11S球蛋白，b:斷開Cys88-618，c:斷開Cys12-618，d:斷開Cys88-618和 Cys12-618

Figure.4 Root mean square fluctuations of different cleaved disulfide bond position in glycinin, a: native glycinin, b: cleaved Cys88-618, c: cleaved Cys12-618, d: cleaved Cys88-618 and Cys12-618

2.4 二硫鍵對回旋半徑的影響

分析蛋白質(zhì)的回旋半徑采用GROMACS自帶的g_gyate程序。回旋半徑的大小反應(yīng)蛋白質(zhì)在模擬過程中體積和構(gòu)象的變化，可以判斷蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的緊密程度?；匦霃皆酱笳f明蛋白質(zhì)分子越膨脹。從圖5可以看出，二硫鍵斷裂后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，全部斷開的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化最大，在1500～3500ps之間該蛋白質(zhì)回旋半徑最大，表明在此階段蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)體系膨脹幅度最大。在整個模擬過程中只有斷開Cys88-298二硫鍵蛋白質(zhì)的回旋半徑幾乎始終小于天然蛋白質(zhì)，表明斷開Cys88-298二硫鍵可能不利于功能性質(zhì)的改善。在模擬后期斷開Cys88-298和Cys12-45二硫鍵都會使得蛋白體系膨脹，而斷開Cys88-298二硫鍵并沒有使體系得到膨脹，說明斷開Cys88-298之間的二硫鍵對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開不利。模擬同RMSD結(jié)果一致，因此我們可以推斷，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化作用最大的是Cys12-45二硫鍵。

圖5 斷裂不同位置二硫鍵的11S球蛋白模擬軌跡回旋半徑，a:天然11S球蛋白，b:斷開Cys88-618，c:斷開Cys12-618，d:斷開Cys88-618和 Cys12-618

Figure.5 Radius of gyration plots of different cleaved disulfide bond position in glycinin, a: native glycinin, b: cleaved Cys88-618, c: cleaved Cys12-618, d: cleaved Cys88-618 and Cys12-618

2.5 二硫鍵對疏水溶劑可及表面的影響

采用GROMACS模擬軟件自帶的g_sas程序可以計算蛋白質(zhì)的溶劑可及表面(SASA)。由圖6可知，在模擬初期所有斷開二硫鍵的蛋白質(zhì)的SASA值大于天然蛋白質(zhì)，說明二硫鍵斷開后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變的疏松，此時蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開表面疏水性增大[11]，疏水基團(tuán)伸進(jìn)極性溶劑中。隨著模擬的進(jìn)行，SASA值減小，這可能是因為疏水性互作用增大導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)致密程度增加。在模擬階段后期斷開Cys12-45、Cys88-298二硫鍵都斷開的蛋白質(zhì)SASA最大，表明此時的蛋白質(zhì)伸展程度最大[12]，結(jié)構(gòu)最為疏松。劉國宇[13]認(rèn)為分子的SASA值越小說明表面活性劑在界面的吸附量能力越大，在界面的飽和吸附量越大，降低界面張力的能力越強。因此，該實驗?zāi)M表明斷開Cys88-298和Cys12-45、Cys88-29二硫鍵的蛋白質(zhì)降低界面張力的能力最強，由于兩種蛋白的SASA值差別較小，所以可以推斷斷開Cys88-298二硫鍵對蛋白質(zhì)在界面的吸附效果影響較大。

圖6 斷開不同位置二硫鍵11S球蛋白的溶劑可及表面，a:天然11S球蛋白，b:斷開Cys88-618，c:斷開Cys12-618，d:斷開Cys88-618和 Cys12-618

Figure.6 Solvent accessible surface area of different cleaved disulfide bond position in glycinin, a: native glycinin, b: cleaved Cys88-618, c: cleaved Cys12-618, d: cleaved Cys88-618 and Cys12-618

2.6 二硫鍵對二級結(jié)構(gòu)的影響

圖7 4種體系的隨時間變化的二級結(jié)構(gòu)圖，a:天然11S球蛋白，b:斷開Cys88-298， c:斷開Cys12-45，d:斷開Cys88-298和 Cys12-45

Figure.7 Secondary structures as a function of simulation time for four different proteins, a: native glycinin, b: cleaved Cys88-298, c: cleaved Cys12-45, d: cleaved Cys88-298 and Cys12-45

為了進(jìn)一步研究二硫鍵對11S球蛋白結(jié)構(gòu)的影響，我們用DSSP軟件對模擬后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[14]。如圖7所示。從上到下依次為斷開Cys65-78、Cys70-94、Cys81-89，Cys65-78、Cys81-89，Cys65-78，從圖可以看出，整個體系沒有新的條帶出現(xiàn)，隨著二硫鍵斷裂個數(shù)增加，N10-P22原有的無規(guī)則含量逐漸增加，R62-Q71無規(guī)則卷曲含量增加，而V238-T295之間混亂程度增加。β-折疊變化不大，L201-L223α-螺旋含量依次增加(圖中藍(lán)色部分)，β-轉(zhuǎn)角含量降低(圖中黃色部分)，說明二硫鍵斷開后，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。變化程度與斷開二硫鍵的個數(shù)成正比，這說明二硫鍵斷與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有直接關(guān)系，斷開后蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低。

3 結(jié)論

本文采用分子動力學(xué)模擬分析了二硫鍵對大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)及其表面活性進(jìn)行了初步探索。模擬結(jié)果顯示，二硫鍵斷裂后分子的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，斷開不同位置和不同個數(shù)二硫鍵對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和表面活性的影響也不相同，二硫鍵全部斷開會增大大豆11S球蛋白的分子柔性，有利于提高分子的表面活性，只斷開Cys88-298和Cys12-45、Cys88-29可能更有利蛋白質(zhì)分子在界面的吸附；二硫鍵斷裂后蛋白質(zhì)分子不在受二硫鍵的影響，分子結(jié)構(gòu)變得膨脹，溶劑進(jìn)入分子內(nèi)部增大了疏水區(qū)域與溶劑的接觸面積。通過以上模擬結(jié)果分析我們可以推斷，斷開二硫鍵的位置和個數(shù)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響，這將直接影響11S球蛋白表面活性的展示，因此在提高蛋白質(zhì)表面活性的過程中需要控制性的打開二硫鍵。本研究結(jié)果將為蛋白質(zhì)基表面活性劑的開發(fā)提供一定的參考依據(jù)，對于斷開二硫鍵對表面活性的影響需要進(jìn)一步研究。

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(本文文獻(xiàn)格式：董 振，李軍生 ，閻柳娟，等.分子動力學(xué)模擬二硫鍵對大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)及表面活性的影響[J].山東化工，2016，45(16)：1-4，8.)

Molecular Dynamics Simulation of Impact of Disulfide Bonds on Surface Activity and Structure of Glycinin

DongZhen,LiJunsheng*,YanLiujua,HuangGuoxia,WangWei

(1.Faculty of Biological and Chemical Engineering, Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,China; 2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources, Liuzhou 545006,China; 3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources of Guangxi Higher Education Institutes,Liuzhou 545006,China)

Molecular dynamics simulations were used to analyze the impact of disulfide bonds on the structure and surface activity of native and reduced glycinin in Soybean. The simulation results shown that the stability of glycinin decreased after the cleaving of disulfide bonds and conformation and secondary structure of glycinin was changed，disulfide bonds were cleaved will increase the flexibility of the reduced glycinin, which was conducive to the improvement of surface active. Cys88-298 and Cys12-45, Cys88-29 were cleaved will increases the solvent accessible surface of hydrophobic domains in protein, indicating that the two modes will increase protein molecular adsorption on the interface, which was conducive to the surface tension decreased and enhances the activity of the protein on the surface.

molecular dynamics simulations; glycinin; disulfide bond; surface activity

2016-06-07

國家自然科學(xué)基金項目(21466006)；廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團(tuán)隊及卓越學(xué)者計劃資助(桂教人〔2014〕7 號)

董 振(1990—)，江蘇人，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)基表面活性劑研究；通訊聯(lián)系人: 李軍生。

R914

A

1008-021X(2016)16-0001-04