李　鵬　徐曲毅　劉　超，

（1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州510000；2.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東 廣州510000）

細菌與藻類生物在溺死診斷中的研究進展*

李鵬1徐曲毅2劉超1，2

（1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州510000；2.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東 廣州510000）

法醫(yī)工作中，水中尸體“生前溺死”的判斷是法醫(yī)病理學(xué)尸檢案例中的一個難點和重點。硅藻檢驗是溺死診斷常用的實驗室檢驗方法，被認為是溺死診斷的“金標準”。近年來研究表明，除在溺死尸體臟器中存在硅藻外，其它不同于硅藻藻類與細菌類等生物也存在溺死尸體臟器與血液中。本綜述主要就存在溺死尸體臟器或血液中的藻類與細菌的種類及其相關(guān)檢測方法，旨在使人們了解藻類與細菌類等生物在溺死診斷中的研究現(xiàn)狀。

法醫(yī)病理學(xué)溺死藻類細菌

溺死的判定在法醫(yī)實踐中是一項常見的工作和難題［1］，它通常建立在對尸表檢查、尸體解剖、及實驗室檢查等結(jié)果綜合分析的基礎(chǔ)上進行判斷［1，2］。當(dāng)尸體腐敗時或白骨化時，由于尸表等溺死征象消失，此時硅藻檢驗是輔助推斷溺死不可或缺的輔助手段［2］。近年來，除硅藻外，在溺死尸體臟器中同時檢出藍藻［3］、綠藻［4］等其它藻類得到證實。除藻類外，研究表明，與硅藻體積（＞2μm）相比，一些細菌（＜2μm）類如水生細菌等體積更小的生物更易隨溺液進入溺死者體內(nèi)分布到血液與臟器中，同時研究表明若根據(jù)細菌種類區(qū)別可對溺死尸體進行溺死地點的判斷［5］。因此，在水中尸體臟器與血液中發(fā)現(xiàn)上述細菌、藻類等生物可對溺死診斷的判定具有重要的參考意義。本綜述主要對發(fā)現(xiàn)可在溺死過程中隨溺液進入血液循環(huán)的生物及相關(guān)的檢測方法進行概述。

1　在溺死尸體臟器中發(fā)現(xiàn)的藻類、細菌類生物

溺死是液體媒介（通常是水）阻塞呼吸道（鼻和口）而引起的死亡［6］。在溺死過程中，由于肺泡、毛細血管屏障損傷導(dǎo)致水中存在的一些藻類或細菌，及存在正常人體喉部的細菌均有可能隨溺液進入體液循環(huán)，進而到達人體各器官。下述生物是研究證實可進入溺死人體血液循環(huán)的相關(guān)藻類、細菌。

1.1藻類

1.1.1硅藻（Diatom）

硅藻是國內(nèi)外溺死診斷研究最多同時也是最詳細的藻類。硅藻因其獨特的硅質(zhì)細胞殼，在高溫及強酸等條件不易被破壞，同時在各種水域中分布廣泛，至今仍然是溺死診斷的重要依據(jù)，尤其是對于尸體腐敗的案例［2］。目前，溺死尸體臟器中已發(fā)現(xiàn)多種硅藻，但不同水域中存在的硅藻種類與數(shù)量有差異。因此，有學(xué)者呼吁建立不同水域硅藻數(shù)據(jù)庫，對推斷溺死及溺死地點具有積極意義［2］。

1.1.2藍藻（Cyanobacteria）

據(jù)有關(guān)報道，藍藻存在于溺死尸體臟器中［3］。藍藻也稱藍細菌，是地球上現(xiàn)存最古老，最簡單、最原始的生物之一。藍藻種類繁多，分布極其廣泛。藍藻能生存于各種類型水生環(huán)境。在淡水、海水、鹽池，潮濕等環(huán)境均有分布［7］。2013年，Tie J［3］等人對溺死人體臟器肺、肝、腎等檢材分別同時取5mg、10mg、20mg進行分子生物學(xué)檢測，結(jié)果均為陽性，其檢材量遠小于硅藻檢驗所需檢材量［8］。同年，Kakizaki E［4］等人使用454焦磷酸測序方法對溺死人體血液與臟器進行檢測發(fā)現(xiàn)多種藍藻可進入溺死人體臟器中，見表1。

表1　溺死尸體血液中存在的藍藻Table 1.The Cyanobacteria existed in blood of drowning victims

上表表明多種藍藻種屬存在溺死尸體臟器中，并且據(jù)報道藍藻在正常人體內(nèi)不存在［4］，可避免尸體解剖過程中造成的污染，因此其有望成為輔助診斷溺死的新對象。

1.1.3其它藻類

除上述硅藻、藍藻等藻類存在溺死尸體臟器中，有研究報道，綠藻［4］、甲藻［9］等中的一些種類也存在溺死尸體臟器中，研究較少。

1.2細菌類

近年來，有研究報道水生細菌及存在人體喉部的正常菌群也可隨溺液進入溺死人體臟器中，可為溺死診斷提供證據(jù)。

1.2.1淡水中細菌（Freshwater bacteria）

受水中環(huán)境影響如鹽濃度影響，海水與淡水中生存的細菌種類有差別，進而引起不同水域進入溺死人體臟器中的細菌產(chǎn)生差別，可用于推斷溺死及溺死地點。淡水中存在且進入溺死尸體臟器中的細菌種屬主要為氣單胞菌屬（Aeromonas）中的菌種［5，10］，見表2。

1.2.2海水中細菌（Marine bacteria）

適應(yīng)生存在鹽濃度較高即海水的水環(huán)境中且被發(fā)現(xiàn)可隨溺液進入溺死人體臟器的海水中的細菌主要種屬屬于桿菌屬（Photobacterium）、弧菌屬（Vibrio）［5］中的菌種，見表2。

表2　溺死尸體血液中存在的淡水與海水細菌Table 2.The freshwater and marine bacteria existed in blood of drowning victims

1.2.3喉部菌群

在溺死過程中，溺液可沖刷存在于人體喉部、口腔中的正常菌群如唾液鏈球菌（Streptococcus salivarius）、血鏈球菌 （Streptococcus sanguinis），使上述細菌隨溺液進入血液循環(huán)到達各臟器與血液中而在溺死尸體臟器中被發(fā)現(xiàn)［11］。因其存在人體特殊部位，在一些案例如溺死在浴缸中因水中細菌與藻類較少或不存在時，檢測溺死尸體臟器中上述細菌的存在與否來判定溺死是很有意義的方法。

1.2.4細菌糞大腸菌、糞鏈球菌

溺死診斷研究中，有報道稱受糞便污染的水域常見的細菌糞大腸菌（faecal coliforms）、糞鏈球菌（faecal streptococc）可能成為溺死的標志的細菌，此研究中發(fā)現(xiàn)淡水溺死與海水溺死尸體血液中均發(fā)現(xiàn)上述兩種細菌的存在［12］。但這兩種細菌是否能成為溺死診斷的標志受溺死水域是否被污染及污染的程度影響。

上述細菌無論是在水域中存在或在人體喉部的正常菌群，與藻類相比，細胞體積更小，更容易隨溺液進入血液循環(huán)分布到臟器中，而可能成為溺死診斷檢測對象，對溺死診斷的判斷具有積極意義［5］。但上述細菌如喉部正常細菌屬于機會致病菌，在某種條件下死者生前血液中可能存在上述細菌，對溺死的判定造成影響。因此，使用上述細菌來診斷溺死前要充分了解死者生前身體健康狀況及相關(guān)病例來幫助分析是否為溺死是必要的。

2　檢驗方法

2.1形態(tài)學(xué)觀察

目前，形態(tài)學(xué)觀察主要應(yīng)用于硅藻檢驗。對水中尸體臟器進行不同的方法處理后通過離心或濾膜富集的方法收集硅藻，經(jīng)過光鏡或電鏡直接觀察硅藻的形態(tài)與種類來輔助診斷溺死及溺死地點是硅藻檢驗基本過程。進行硅藻檢驗的水中尸體臟器處理方法有很多，包括化學(xué)消化法（強酸、酶消化組織），物理消化法（灰化法、浸漬法、硅膠梯度離心法、碎漿法等）［2］。其中目前最常用的硅藻檢驗方法是強酸消化法，但其易污染、靈敏度低［8］。有報道稱使用微波消解——真空抽濾——電鏡掃描法檢測硅藻大大提高了硅藻檢驗的靈敏度、特異性［8］，但由于儀器昂貴，不易普及。其它藻類如藍藻、綠藻目前沒有相關(guān)研究其形態(tài)學(xué)在溺死診斷中的應(yīng)用。

2.2培養(yǎng)法

一些研究報道將提取溺死尸體血液進行細菌培養(yǎng)，不同水環(huán)境生存的細菌經(jīng)過不同鹽濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，其生長狀況、生長后菌落的顏色出現(xiàn)差別，從而判斷血液中是否含細菌有及細菌種類來判斷溺死及溺死地點［6，13，14］。血液中的細菌經(jīng)過培養(yǎng)提高細菌數(shù)量，有利于接下來的相關(guān)研究如分子生物學(xué)方法檢測即可增加PCR擴增時模板量，但此種方法對實驗室環(huán)境及操作者要求較高，應(yīng)嚴格控制污染避免造成假陽性結(jié)果。

2.3分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法與傳統(tǒng)的硅藻檢驗方法相比，其優(yōu)點是無需觀察溺死相關(guān)生物細胞形態(tài)，具有靈敏度高、特異性強等特點［15］。目前，國內(nèi)外許多研究報道使用分子生物學(xué)方法來檢測溺死尸體臟器中存在的上述細菌、藻類等生物基因來診斷溺死［3-5，10，16］。相關(guān)報道研究方法主要集中在PCR擴增技術(shù)與擴增后產(chǎn)物檢測方法的不同。

2.3.1PCR技術(shù)

PCR擴增技術(shù)在溺死診斷的相關(guān)研究中，使用PCR擴增技術(shù)的類型有以下3種：（1）普通PCR［3，16］；（2）巢式PCR［10］；（3）實時定量PCR［5］。這些溺死診斷相關(guān)研究中，PCR技術(shù)擴增體系有只含一對引物，有則含有多對引物的復(fù)合擴增體系。普通PCR技術(shù)是溺死相關(guān)研究中最常用的方法，相對簡單。巢式PCR技術(shù)含有兩對引物，據(jù)研究稱可提高樣本陽性率及擴增結(jié)果的特異性。實時定量PCR可同步檢測原始模板的濃度及產(chǎn)物的量，省去PCR擴增后產(chǎn)物電泳檢測的步驟，操作簡捷。一對引物的PCR擴增體系與多重PCR技術(shù)相比，由于水中尸體腐敗導(dǎo)致檢測的靶基因降解而使模板量減少可能導(dǎo)致PCR擴增失敗引起假陰性結(jié)果，而多重PCR技術(shù)增加了檢測對象的種類或（和）靶基因的數(shù)量，可能對于提高溺死診斷的可靠性是一種有效的方法。

2.3.2PCR擴增產(chǎn)物檢測方法

PCR擴增后的產(chǎn)物除實時定量PCR技術(shù)擴增后無需對產(chǎn)物進行電泳檢測，其它PCR技術(shù)擴增產(chǎn)物均需電泳檢測，常用有瓊脂糖-EB電泳、PAGE電泳等。近年有研究將毛細管電泳技術(shù)應(yīng)用到溺死診斷中檢測PCR產(chǎn)物，即通過檢測不同顏色的熒光的存在來反應(yīng)檢測的產(chǎn)物［17］，這種方法與上述兩種電泳技術(shù)相比，上樣量少，無需制膠、顯帶等過程，可更加靈敏與迅速完成電泳過程［18］。

2.3.3變性梯度凝膠電泳（DGGE）與變性高效液相色譜分析（DHPLC）檢測PCR產(chǎn)物推斷溺死地點

判斷水中尸體是否為溺死是法醫(yī)工作中重要的一部分，同時推斷溺死地點對法醫(yī)判斷溺死的工作具有重要意義。目前關(guān)于溺死地點的推斷的分子生物學(xué)方法的研究主要有兩種方法即變性梯度凝膠電泳（DGGE）與變性高效液相色譜分析（DHPLC）。2008年，何方剛［19］等人將三個不同水域及相應(yīng)溺死地點實驗兔肺臟進行提取浮游生物DNA進行PCR擴增，而后進行DGGE電泳檢測，結(jié)果顯示溺死地點實驗兔肺臟與相應(yīng)溺死水域DGGE圖相似而不同于其它水域及溺死兔肺臟。2013年，余政梁［20］等人使用DHPLC法來推斷溺死地點，結(jié)果同樣顯示溺死水樣與相應(yīng)溺死兔肺臟DHPLC圖譜具有很高相似性。水中尸體溺死的診斷不應(yīng)僅僅是推斷溺死的本身，有時正確推斷溺死地點可使溺死診斷更加完整、可靠。

3　小結(jié)

溺死診斷是法醫(yī)病理學(xué)工作中常見的任務(wù)與困難之一［8］。目前。溺死的診斷主要依靠尸表檢查、尸體解剖與實驗室檢查，尤其當(dāng)尸體腐敗導(dǎo)致溺死征象消失時，實驗室檢查對溺死診斷更為重要，其中硅藻檢查被認為是溺死診斷的不可缺少的手段［2］。但也有報道稱非溺死尸體臟器中發(fā)現(xiàn)硅藻的存在，其應(yīng)用也受一些學(xué)者的爭議［21，22］。近年來，除硅藻外，其它藻類如藍藻、綠藻等藻類在溺死尸體臟器中被發(fā)現(xiàn)，使更多可在溺死尸體臟器中檢測到的對象得到豐富。此外，與上述藻類相比，體積更小的一些細菌更容易進入隨溺液進入體液循環(huán)分布到各臟器中得到證實。若在水中尸體臟器中發(fā)現(xiàn)上述藻類與細菌等生物對溺死診斷均具有重要的參考意義。溺死的判定有望隨相關(guān)研究的深入，會有越來越多可隨溺液進入血液循環(huán)的生物被發(fā)現(xiàn)，增加可檢測的對象，聯(lián)合檢測多種對象可使溺死診斷更加可靠。對水中尸體進行溺死診斷外，同時對溺死地點進行確定可使溺死診斷更加完整。目前，我們根據(jù)一些研究報道可知DGGE等分子生物學(xué)方法可判斷溺死地點，但只停留在理論研究中，其應(yīng)用于實踐中的可靠性有待進一步檢驗。

［1］Piette M H，De Letter E A.Drowning:still a difficult autopsy diagnosis［J］.Forensic Sci Int，2006，163（1-2）:1-9.

［2］白英杰，張海東.溺死診斷中浮游生物檢驗方法的研究現(xiàn)狀及進展［J］.證據(jù)科學(xué)，2011（05）:625-631.

［3］Tie J，Uchigasaki S，Haseba T，et al.Direct and rapid PCR amplification using digested tissues for the diagnosis of drowning［J］.Electrophoresis，2010，31（14）: 2411-2415.

［4］Kakizaki E，Ogura Y，Kozawa S，et al.Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims:firstmetagenomicapproachusinghighthroughput 454-pyrosequencing［J］.Forensic Sci Int，2012，220（1-3）:135-146.

［5］Uchiyama T，Kakizaki E，Kozawa S，et al.A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death:simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes［J］.Forensic Sci Int，2012，222（1-3）:11-26.

［6］Kakizaki E，Kozawa S，Tashiro N，et al.Detection of bacterioplankton in immersed cadavers using selective agar plates［J］.Leg Med，2009，11 Suppl 1:S350-S353.

［7］王捷.念珠藻屬（藍藻）的分類及分子系統(tǒng)研究［D］.山西大學(xué)，2011.

［8］Zhao J，Liu C，Hu S，et al.Microwave Digestion-Vacuum Filtration-Automated Scanning Electron Microscopy as a sensitive method for forensic diatom test［J］. Int J Legal Med，2013，127（2）:459-463.

［9］Diaz-Palma P A，Alucema A，Hayashida G，et al.Development and standardization of a microalgae test for determining deaths by drowning［J］.Forensic Sci Int，2009，184（1-3）:37-41.

［10］Aoyagi M，Iwadate K，F(xiàn)ukui K，et al.A novel method for the diagnosis of drowning by detection of Aeromonas sobria with PCR method［J］.Leg Med，2009，11（6）:257-259.

［11］ Suto M，Kato N，Abe S，et al.PCR detection of bacterial genes provides evidence of death by drowning ［J］.Leg Med，2009，11 Suppl 1:S354-S356.

［12］Lucci A，Campobasso C P，Cirnelli A，et al.A promising microbiological test for the diagnosis of drowning ［J］.Forensic Sci Int，2008，182（1-3）:20-26.

［13］Huys G，Coopman V，Van Varenbergh D，et al.Selective culturing and genus-specific PCR detection for identification of Aeromonas in tissue samples to assist the medico-legal diagnosis of death by drowning ［J］.Forensic Sci Int，2012，221（1-3）:11-15.

［14］Kakizaki E，Takahama K，Seo Y，et al.Marine bacteria comprise a possible indicator of drowning in seawater［J］.Forensic Sci Int，2008，176（2-3）:236-247.

［15］張又川，王會品，胡孫林，等.浮游生物PCR檢測及其在溺死鑒定中的研究進展［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2012（03）:209-211.

［16］He F，Huang D，Liu L，et al.A novel PCR-DGGE-based method for identifying plankton 16S rDNA for the diagnosis of drowning［J］.Forensic Sci Int，2008，176（2-3）:152-156.

［17］Zhengliang Yu，Chao Liu，Sunlin Hu，Jian Zhao，Huipin Wang，Yu Zhou，feibing Xie，Huijun Wang，PCR-Capillary electrophoresis is a new method for forensic diatom testing［J］.Journal of pure and applied microbiology，2014，8（2）.

［18］ Ruan J，Li M，Liu Y P，et al.Rapid and sensitive detection of Cronobacter spp.（previously Enterobacter sakazakii）in food by duplex PCR combined with capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence detector［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013，921-922:15-20.

［19］何方剛，黃代新，劉良，等.PCR-DGGE法檢測浮游生物16S rDNA在溺死鑒定中的應(yīng)用［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2008（04）:234-237.

［20］余政梁，劉超，胡孫林，等.PCR-DHPLC法檢測硅藻SSU基因在溺死鑒定中的應(yīng)用［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2013（06）:457-460.

［21］Spitz W U，Schneider V.The significance of diatoms in the diagnosis of death by drowning［J］.J Forensic Sci，1964，9（1）:11-18.

［22］Calder I M.An evaluation of the diatom test in deaths of professional divers［J］.Med Sci Law，1984，24（1）: 41-46.

廣東省科技計劃項目（2010A0861001）；公安部科技強警計劃項目（2014GABJC020）