鄭曉新 汪小丁 侯果 邱璇 蔣學俊

基礎(chǔ)研究

大鼠腎去交感神經(jīng)實驗動物模型的制備

鄭曉新 汪小丁 侯果 邱璇 蔣學俊

目的 制備大鼠腎去交感神經(jīng)實驗動物模型。方法 52只SPF級SD大鼠隨機分為正常對照組（N組）、腎去交感組（RDN組）、心肌梗死組（MI+Sham組）和心肌梗死加腎去交感治療組（MI+RDN組）四組。MI+Sham組和MI+RSD組分別結(jié)扎前降支冠脈制備心梗模型，7 d后分別予腎去交感假手術(shù)或手術(shù)處理。電刺激法評估術(shù)前及RDN術(shù)后即刻，HE染色法評估術(shù)前和MI術(shù)后4周腎交感去除情況，ELISA法評估血漿血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）和去甲腎上腺素（NE）變化情況。結(jié)果 RDN術(shù)總死亡率為18.1%，手術(shù)成功率為81.9%。在RDN術(shù)前，腎神經(jīng)干電刺激可誘導明顯交感反應(yīng)，而術(shù)后上述反應(yīng)消失。HE染色顯示，正常未消融的腎動脈外膜外可見完整交感神經(jīng)，RDN術(shù)后3周未見任何完整腎交感神經(jīng)，腎動脈血管壁未見明顯異常。與MI+Sham組相比，MI+RDN組AngⅡ、ALD及NE均明顯減少［NE：（669.0±24.0）ng/L比（1349.0±209.0）ng/L，P＜0.01；AngⅡ：（205.5±16.4）ng/L 比（1069.0±209.1）ng/L，P＜0.01；ALD：（290.0±36.0）ng/L比（1049.5±298.5）ng/L，P＜0.01］。結(jié)論 本研究所制備的大鼠腎去交感模型具有良好的操作性、安全性、實用性和有效性。

大鼠； 腎去交感； 化學消融； 模型

腎去交感術(shù)（renal sympathetic denervation，RDN）主要機理是去除腎臟的傳入和傳出神經(jīng)，通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)反饋機制，顯著降低過度激活的全身交感活性[1]。雖然SYMPLICITY HTN-3并未達到主要的治療目標，但SYMPLICITY HTN系列研究顯示RDN在難治性高血壓治療方面有一定作用[2]。此外，RDN用于治療慢性交感系統(tǒng)過度激活引起的相關(guān)疾病，如左室肥厚、心力衰竭和糖耐量異常等有較大潛力[3,4]。

關(guān)于RDN的基礎(chǔ)研究對深入了解和應(yīng)用RDN術(shù)意義重大。大鼠因具有價廉、操作方便和重復性強特點而成為去腎交感相關(guān)研究的首選動物。大鼠去交感模型制備的質(zhì)量及成功率將直接影響到研究的進度和可信度。目前關(guān)于實驗用大鼠去交感模型制備的報道較少，本實驗旨在建立一種可行性高、操作性強的大鼠去交感模型，探討相關(guān)構(gòu)建方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 52只SPF級成年SD大鼠，體重180～200 g，由湖南斯萊克景達實驗動物中心提供，實驗操作遵守武漢大學動物倫理委員會規(guī)定。動物隨機分成正常對照組（N組，n=10）、腎去交感組（RDN 組，n=12）、心肌梗死組（MI+Sham 組，n=15）和心肌梗死加腎去交感治療組（MI+RDN組，n=15）四組。N組動物不做處理，RDN組動物給予腎去交感，MI+Sham組和MI+RDN組大鼠分別結(jié)扎前降支冠脈構(gòu)建心梗模型，7 d后行腎去交感假手術(shù)及手術(shù)處理。

1.2 心肌梗死模型建立 心肌梗死模型構(gòu)建和評估標準參考我們既往工作[5]。要點為：以2%戊巴比妥麻醉動物（40 mg/kg體重），氣管插管，呼吸機輔助呼吸（詳見下文）。備皮、消毒、開胸暴露心臟，以7-0號縫線結(jié)扎冠脈前降支，可見結(jié)扎處遠端心肌組織變白，以觀察終點病理形態(tài)學證實梗死面積占左心室總面積30%～40%為有效心梗模型。術(shù)后縫合傷口，消毒，放置于保暖環(huán)境自然蘇醒。術(shù)后預防感染（詳見下文）。

1.3 腎去交感模型的制作方法

1.3.1 麻醉及術(shù)前準備 實驗動物術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，稱重，2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，必要時追加0.1～0.2 ml的戊巴比妥（40 mg/kg）。待動物呼吸平穩(wěn)有力后仰臥固定在手術(shù)臺，四肢連接心電圖機。頸部和腹部備皮，2%碘伏消毒。

1.3.2 氣管插管 距胸骨上緣1 cm頸正中線，縱行剪開皮膚并暴露氣管，采用靜脈留置針在第4、5軟骨環(huán)間隙穿刺，氣管插管，膠布固定套管并連接呼吸機，正壓輔助呼吸，潮氣量3 ml/100 g，頻率為65次/min。

1.3.3 剝離腎動靜脈鞘 再次腹部皮膚消毒、鋪巾，沿腹白線剪開，縱行切口約3 cm，逐層小心分離，無菌紗布浸潤生理鹽水，將腸管壓向?qū)?cè)腹腔，暴露腎臟。小心將腎臟推向外側(cè)，見輸尿管及包在鞘內(nèi)的動、靜脈和神經(jīng)，用彎頭玻璃分針剝離動靜脈鞘。

1.3.4 腎去交感處理及術(shù)后即刻評估 參照Hu等[6]的方法，解剖顯微鏡下（×25）離斷所有可見腎神經(jīng)束，再以10%苯酚乙醇溶液涂抹腎動、靜脈2～3 min。電刺激方法評估腎交感神經(jīng)去除是否徹底，以Grass S48神經(jīng)刺激器（強度15 V，0.2 ms；頻率為10 Hz）刺激腎動脈近端腎神經(jīng)10～30 s來檢驗，評估指標為收縮壓、心率和腎臟大體顏色。隨后縫合、關(guān)腹。

1.3.5 術(shù)中及術(shù)后觀察及處理 術(shù)中嚴格無菌操作，術(shù)中至術(shù)后12 h置空調(diào)房里，室溫控制在22℃～24℃。保持墊料干燥清潔，常規(guī)進食飼料及飲水并記錄大鼠活動、飲食及傷口恢復情況。術(shù)后前3 d肌注青霉素8萬U/d預防感染。

1.4 標本取材及HE染色 在MI術(shù)后4周處死動物。動脈夾夾住腎動脈近心端，眼科剪剪取整段腎動脈及周圍組織，生理鹽水漂洗后，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片（范圍包括近、中、遠段），HE染色，顯微鏡下觀察腎神經(jīng)的去除情況。

1.5 血漿去甲腎上腺素（NE）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）和醛固酮（ALD）濃度測定 剪取腎動脈后，用采血針從下腔靜脈抽取血標本至含EDTA的離心管中，4℃，3000 r/min離心10 min，取血漿置于EP管中，-80℃保存。ELISA試劑盒（Rat kit，Abnova GmbH Inc.，Heidelberg，Germany） 檢測血漿 NE、AngⅡ和ALD濃度

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件分析。數(shù)據(jù)以±s表示，所有數(shù)據(jù)采用方差齊性和正態(tài)性檢驗，兩兩數(shù)據(jù)比較采用SNK-q檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)成功率及死亡率 術(shù)后死亡視為手術(shù)失敗。N組大鼠全部存活至實驗終點；RDN組大鼠手術(shù)成功率為75%（9/12），術(shù)后死亡率為25%（3/12）；MI+Sham組手術(shù)成功率為 60%（9/15，MI死亡 5只，MI不合格 1只），術(shù)后死亡率為 33.3%（5/15）；MI+RDN組手術(shù)成功率為53.3%（8/15，RDN死亡1只，MI死亡5只，MI不合格1只），術(shù)后死亡率為40%（6/15）。用于腎去交感手術(shù)大鼠共22只，RDN總死亡率為18.2%（4/22），總成功率為81.8%（18/22）。死亡原因主要為術(shù)后出血、感染、嚴重心力衰竭和室顫。各實驗組存活動物在觀察終點體重無明顯差異（數(shù)據(jù)未顯示）。見表1。

2.2 麻醉效果 采用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，大部分動物完全麻醉時間為40～50 min，個別動物需追加 0.1～0.2 ml的戊巴比妥（40 mg/kg），主要為體重190 g以上動物。無麻醉意外死亡情況。

2.3 手術(shù)即刻腎去交感神經(jīng)完全性測試 刺激正常大鼠腎臟交感神經(jīng)可觀察到大鼠腎臟顏色發(fā)白、光澤度降低，收縮壓上升5～10 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、心率上升 8～15 次/min，（圖 1B，圖2A）。而刺激RDN術(shù)后大鼠則未出現(xiàn)以上變化（圖1C，圖 2B）。

2.4 病理形態(tài)學觀察 正常未行消融術(shù)的腎動脈外膜外可見正常腎交感神經(jīng)，其外膜光滑完整，形態(tài)規(guī)則（圖3）。腎去交感術(shù)后4周腎動脈外膜外未見任何完整腎交感神經(jīng)，殘留腎交感神經(jīng)纖維萎縮，形態(tài)不規(guī)則；藥物消融后的腎動脈外組織壞死，呈蟲蝕樣改變，但腎動脈管壁未見異常（圖3）。

2.5 腎去交感神經(jīng)對心梗后血漿NE、AngⅡ和ALD的影響 與RDN組相比，MI+Sham組大鼠血漿NE、AngⅡ和ALD水平明顯升高［NE：（1349.0±209.0）ng/L 比 （574.5±18.5）ng/L，P＜0.01；AngⅡ：（1069.0±209.1）ng/L 比（132.0±17.4）ng/L，P＜0.01；ALD：（1049.5±298.5）ng/L 比（175.5±24.0）ng/L，P＜0.01］。與N組相比，單純RDN（RDN組）未改變血漿NE、AngⅡ和ALD水平（P＞0.05）。與 MI+Sham組比較，MI+RSD組大鼠血漿NE、AngⅡ和ALD水平明顯降低［NE：（669.0±24.0）ng/L 比（1349.0±209.0）ng/L，P＜0.01；AngⅡ：（205.5±16.4）ng/L 比（1069.0±209.1）ng/L，P＜0.01；ALD：（290.0±36.0）ng/L 比（1049.5±298.5）ng/L，P＜0.01］。

表1 四組實驗鼠RDN術(shù)的死亡率和成功率

3 討論

隨著對腎去交感認識的深入，腎去交感基礎(chǔ)研究的動物模型需求量不斷增加，選擇合適的動物模型并尋找可靠的造模技術(shù)是保證實驗順利開展的前提。大型動物腎去交感模型對設(shè)備和技術(shù)要求較高，且價格昂貴，成為基礎(chǔ)研究的一個瓶頸。大鼠等小動物操作簡便、成本低，但尚未形成公認的安全、有效和復制性強的造模方法。

大鼠腎去交感模型的優(yōu)點：哺乳動物常用于制備去交感模型，如犬、豬、大鼠、猴等。靈長類動物如猴的生理狀態(tài)最接近人體，但其價格高昂，實驗條件要求較高，不易推廣。豬腎交感系統(tǒng)接近人類，犬大小適中、操作方便，但都存在成本較高及飼養(yǎng)不便的缺點。故近年來轉(zhuǎn)而多用兔、鼠等小動物，其具有操作簡便、成本低、成活率高和可重復等優(yōu)點[7]。尤其是用大鼠制備腎去交感模型的方法，現(xiàn)國內(nèi)外已普遍使用，所得數(shù)據(jù)具有一定的參考價值[8]。

有多種去交感動物模型方案可供選擇，目前常用的方法有兩種。①射頻消融法：隨著Krum等[9]采用去腎交感神經(jīng)術(shù)治療頑固性高血壓的突破，經(jīng)皮導管射頻消融術(shù)成為去腎臟神經(jīng)的熱門方法。但該方法對設(shè)備、技術(shù)和經(jīng)費等要求較高，難以應(yīng)用于小動物實驗。②外科手術(shù)+化學消融法：在解剖顯微鏡下離斷所有可見的腎交感神經(jīng)，再用10%苯酚乙醇溶液對腎交感神經(jīng)進行化學消融。但目前對該法的消融效果評判不一，消融時間不足則易消融不完全而導致手術(shù)效果欠佳，由于苯酚侵蝕作用較強，消融時間過長則易引起腎動脈狹窄。

本研究通過上述第二種方法進行RDN術(shù)。RDN術(shù)后即刻，電刺激未導致腎臟表面顏色和心率、血壓改變，表明術(shù)后即刻去交感成功（圖1、2）。

RDN術(shù)成功率和死亡率影響因素分析：本實驗大鼠觀察終點，RDN術(shù)總成功率為81.8%（18/22）：RDN 組（n=12）成功 9只；MI+RDN 組（MI后存活n=10）成功9只。本實驗RDN術(shù)死亡率為18.2%（4/22）。RDN 組（n=12）2只出血，1只感染；MI+RDN組（n=15）1只感染。本實驗總結(jié)提高模型制備成功率并避免動物死亡要點如下。①動物質(zhì)量、飼養(yǎng)環(huán)境及術(shù)前護理：本實驗選取SPF級大鼠，體重150～200 g，在標準環(huán)境中飼養(yǎng)。術(shù)前12 h禁食、4 h禁水，避免因腸道及胃內(nèi)容物過多影響手術(shù)操作，以及術(shù)后腸梗阻等并發(fā)癥發(fā)生。②麻醉質(zhì)量：2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，起效快（5～10 min），維持時間合適（1 h以內(nèi)），蘇醒時間適宜。本實驗無麻醉意外發(fā)生。麻醉劑的用量寧少勿多，尤其對肥胖或體弱大鼠應(yīng)適當減少藥量，以呼吸平穩(wěn)且口腔黏膜呈粉紅色，捏腳趾反射消失為麻醉完全參考。③氣管插管和呼吸機應(yīng)用：參考趙靜等[10]的方法，采用直徑3 mm的靜脈留置針穿刺氣管插管，操作簡單，對大鼠氣管黏膜損傷小。術(shù)后大鼠復蘇后，應(yīng)盡早撤掉呼吸機，盡量避免呼吸機抑制動物自主呼吸導致的死亡。④切口位置和大?。罕緦嶒炓矅L試過經(jīng)脊柱旁線縱向切口，發(fā)現(xiàn)需切開較厚的肌肉群，對動物創(chuàng)傷較大，且不易暴露手術(shù)視野，故改為經(jīng)腹途徑。在劍突下1 cm處縱向切開，注意沿腹白線切開，避免損傷不必要的肌肉組織和血管，開口不宜過大，3 cm左右即可，以利于術(shù)后恢復（圖1A）。⑤預防出血和組織損傷：本實驗RDN術(shù)導致的4例死亡中有2例是出血引起，主要是在分離腎血管時發(fā)生。由于腎動、靜脈比較脆弱，易破裂，且許多動物存在異常的解剖結(jié)構(gòu)，故分離時采用玻璃分針小心分離，避免粗暴拉扯，在顯微鏡下分辨神經(jīng)纖維和側(cè)支血管后再進一步處理。腸管用紗布推向?qū)?cè)腹腔，以避免損傷。由于苯酚具有較強腐蝕性，我們用橡皮條穿過血管，再行化學消融（圖1C），既可充分消融，又能避免損傷周圍組織。另外，輸尿管解剖位置緊挨腎動、靜脈，故分離時要注意避免損傷。⑥預防感染：本實驗所用器械均經(jīng)過滅菌處理。術(shù)中嚴格無菌操作，術(shù)后肌注青霉素預防感染。本實驗因感染所致死亡大鼠2例，均為體型瘦弱個體。⑦術(shù)后保暖與護理：術(shù)中至術(shù)后12 h空調(diào)控溫保暖，保持墊料干燥清潔，觀察大鼠活動、飲食及傷口恢復情況。

去神經(jīng)動物模型成功的驗證：心肌梗死后以交感神經(jīng)系統(tǒng)及RASS系統(tǒng)的激活為一系列病生改變的基礎(chǔ)機制，表現(xiàn)為循環(huán)內(nèi)和組織血管加壓素、去甲腎上腺素、內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ和醛固酮的濃度增高，導致心室重構(gòu)，引發(fā)心衰[11]。腎臟交感神經(jīng)激活與心梗后心力衰竭的發(fā)展密切相關(guān)，阻斷腎交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活對心衰的治療有積極作用[12]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，RDN術(shù)能顯著改善心梗大鼠的心功能[5]。本實驗結(jié)果顯示，MI組大鼠血漿NE、AngⅡ和ALD水平較N組和RDN組明顯升高，RDN術(shù)可明顯逆轉(zhuǎn)這種升高趨勢。另外，病理結(jié)果顯示，RDN術(shù)可有效去除腎交感，無腎交感神經(jīng)殘留及再生，且無腎動脈狹窄發(fā)生（圖3）。雖然腎交感神經(jīng)可能在術(shù)后3～6周再生[13]，但本研究制備的大鼠腎去交感模型未見神經(jīng)再生現(xiàn)象。結(jié)合以上相關(guān)實驗結(jié)果，表明RDN法在觀察期內(nèi)是安全和有效的。該模型在較長觀察期內(nèi)的安全性和有效性，有待于后續(xù)研究證實。

本研究通過對圍手術(shù)期護理、麻醉質(zhì)量、氣道管理及解剖方法等的摸索，建立了一種較理想的腎去交感大鼠模型，操作方法簡便，價格低廉，可重復性強，該模型所得實驗數(shù)據(jù)對大動物乃至臨床具有一定的參考價值。

（本文圖片封三）

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Establishment of a rat renal sympathetic denervation experimental animal model

ZHENG Xiao-xin，WANG Xiao-ding，HOU Guo，et al.Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei Key Laboratory of Cardiology，Cardiovascular Research Institute of Wuhan University，Wuhan 430060，China

Objective To establish a repeatable and steady rat renal sympathetic denervation（RDN）model.Methods 52 SPF level SD rats were randomly divided into 4 groups，N group，RDN group，MI+Sham group and MI+RSD group．Bilateral renal sympathectomy or sham operation were performed in RDN group and MI+RSD group or MI+Sham group，separately.Electrical stimulation and HE staining method were used to assess the situation of renal sympathetic denervation at the preoperative and/or postoperative and 4 weeks post-MI，ELISA method was adopted to evaluate the plasma levels of AngiotensinⅡ（AngⅡ），Aldosterone（ALD）and Norepinephrine（NE）.Results 22 rats were used for renal sympathetic operation，the total RDN mortality was 18.1%and the RDN success rate was 81.9%.Electrical stimulation induced to obvious sympathetic response pre-operation of RDN，and the above reaction disappeared after RDN.HE staining showed the complete sympathetic nerve outside the outer membrane of the renal arteries，which could not be observed 4 weeks post-RDN，renal artery walls were normal at that time.Compared with MI+Sham group，the plasma levels of AngⅡ，ALD and NE were significantly decreased in MI+RDN group（P＜0.01）.Conclusion Rat renal sympathetic animal model made in this study，has a good operability，security，practicability and effectiveness.It can be used to basic studies to evaluate renal sympathetic related diseases.

Rats； Renal sympathetic denervation； Chemical ablation； Model

JIANG Xue-jun，E-mail：xjjiang@whu.edu.cn

中央高校專項科研項目基金（項目編號：2042015kf0074）

430060 湖北省武漢市，武漢大學人民醫(yī)院心血管內(nèi)科心血管病湖北省重點實驗室武漢大學心血管病研究所

蔣學俊，E-mail：xjjiang@whu.edu.cn

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．10．020

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2016）10-0940-05

2016-04-26）