徐春華（大連職業(yè)技術(shù)學院，遼寧大連116037）

牡丹花提取物抑菌作用的研究

徐春華
（大連職業(yè)技術(shù)學院，遼寧大連116037）

以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、單增李斯特氏菌、啤酒酵母、黑曲霉、青霉和黃曲霉作為供試菌株分析了牡丹花提取物的抑菌作用，并探討了該提取物抑菌效果與pH之間的關(guān)系，最后研究了牡丹花提取物的熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明：牡丹花提取物對細菌、酵母菌和霉菌都有明顯的抑制作用，且對細菌（MIC=0.2～0.3）的抑制效果優(yōu)于酵母菌（MIC=0.4）和霉菌（MIC=0.4）。相同pH下的HCl對供試細菌具有一定的抑菌作用，但是效果明顯低于牡丹花提取物。此外，牡丹花提取物的具有一定的熱穩(wěn)定性，在55℃以下抑菌活性不會受到影響，但會隨著溫度和處理時間的增加而降低，在90℃20min的條件下對供試菌株的抑菌作用全部消失。

牡丹花提取物；抑菌；pH；熱穩(wěn)定性

牡丹花（Paeonia suffruticosa Andr.）屬于芍藥科、芍藥屬植物，素有“花中之王”之稱，牡丹花的資源非常豐富，遍布我國的各個省市，其中主要的種植地有洛陽、菏澤、彭州和北京等［1］。牡丹花中含有大量的天然活性物質(zhì)，朱素英研究了牡丹花中多酚物質(zhì)的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)牡丹花多酚具有較強的DPPH自由基清除能力［2］。孫澤飛則對牡丹花中的黃酮類化合物進行了提取，并研究了此類物質(zhì)的抗氧化能力［3］。但是關(guān)于牡丹花天然提取物抑菌效果的研究則少有報道。本試驗利用水對牡丹花進行浸提，從而得到牡丹花的提取物，并進一步研究牡丹花提取物的抗菌特性、最低抑菌濃度（MIC）和熱穩(wěn)定性；并與相同pH下的HCl做對照，分析其抗菌作用與pH之間的內(nèi)在聯(lián)系，以期為牡丹花的綜合利用提供理論參考。

1　材料與儀器

1.1主要材料

牡丹花：選取完全盛開的牡丹花，且無腐敗變質(zhì)的花瓣。

供試菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli O157）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、沙門氏菌（Salmonella）、單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae hansen）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium）和黃曲霉（Aspergilus flaus）。

試劑：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（Nutrient Broth，NB）、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（Tryptose Soya Agar，TSA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）。

1.2試驗儀器

pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；真空干燥箱：南京平崗機械設(shè)備有限公司；真空泵：上海陽光泵業(yè)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：上海姚氏儀器設(shè)備廠。

2　方法

2.1牡丹花提取物的制備

根據(jù)向延菊［4］等的方法，利用水對牡丹花進行提取，牡丹花∶水為1∶5（g/mL），并將3次提取的牡丹花提取液合并，將牡丹花提取液在40℃下進行濃縮，隨后將牡丹花提取液放入真空干燥箱干燥，最后得到牡丹花提取物的干粉。

2.2供試菌株的純化培養(yǎng)

將100 μL的菌液接種到NB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，然后三區(qū)劃線，細使用TSA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h；霉菌使用PDA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h。挑取上述微生物的單菌落，在NB培養(yǎng)基中活化，離心取懸浮液，調(diào)節(jié)濃度在107CFU/mL。

如果瘙癢不能改善，可以應(yīng)用藥物，首先是選擇止癢外用藥，如含薄荷、樟腦的藥水或藥膏，及爐甘石洗劑等，這些物質(zhì)通過刺激神經(jīng)末梢傳遞冷感覺而掩蓋癢感。表面麻醉劑（如利多卡因）也有抗瘙癢作用。含低濃度的弱效糖皮質(zhì)激素藥膏如氫化可的松外用也可以止癢。

2.3牡丹花提取物對供試菌株抑菌效果的測定

利用濾紙片法［5］測定牡丹花提取物的抑菌效果，選取內(nèi)孔直徑為6 mm的濾紙片，每個平皿中均勻放置4個濾紙片，并加入100 μL 5%的待測菌液，重復(fù)3次［5］。作為對照，選取相同體積的無菌蒸餾水和相同pH的鹽酸溶液作為對照。在上述試驗中供試細菌采用TSA培養(yǎng)基，酵母菌和霉菌采用PDA培養(yǎng)基。

2.4牡丹花提取物MIC的測定

把牡丹花提取物加入到TSA和PDA培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)濃度到0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.70%，并以加入相同體積無菌蒸餾水和相同pH的HCl的培養(yǎng)基作為對照組，吸取10 μL107CFU/mL的供試菌液進行涂布接種，在28℃的條件下培養(yǎng)48 h，然后進行平板計數(shù)，上述每個梯度做3個平行。最后進行抑菌率的計算，公式如下：抑菌率/%=1 g作用后的菌落數(shù)×100/7，當抑菌率為100%時對應(yīng)的提取物濃度即為牡丹花提取物的MIC。

2.5牡丹花提取物熱穩(wěn)定性試驗

將MIC的牡丹花提取物進行熱穩(wěn)定處理，分別在50、70、90、110℃下分別處理10、20、30 min后計算牡丹花提取物在不同處理條件下的抑菌率，試驗方法如2.4。

3　結(jié)果與分析

3.1牡丹花提取物對供試菌株的抑菌效果及MIC

牛津杯法分析牡丹花提取物對供試菌株的抑菌效果見表1。

表1　牡丹花提取物對供試菌種的抑制作用Table 1　The inhibition of peony extract to tested strains

由表1所知，0.3%的牡丹花提取物對細菌、酵母菌和霉菌都有明顯的抑菌作用，其中對細菌的抑菌效果優(yōu)于對酵母菌和霉菌的抑菌效果。在供試細菌中，牡丹花提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特氏菌的抑菌效果較強，抑菌圈直徑均達到14 mm以上，而對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑為12 mm～14 mm；對啤酒酵母和所有霉菌的抑制作用大致相同，抑菌圈均在10 mm～12 mm。在對照組中，pH 為3.35的HCl溶液對細菌有一定的抑菌效果，抑菌圈在8 mm～12 mm之間，其中對大腸桿菌的抑菌效果最強，但是pH為3.35的HCl溶液對酵母和霉菌沒有抑菌效果。作為空白對照組，無菌蒸餾水對供試細菌、酵母菌和霉菌都沒有抑菌作用。以上結(jié)果表明牡丹花提取物對細菌、酵母菌和霉菌都具有明顯的抑菌作用。

3.1.2牡丹花提取物對供試菌株的MIC

牡丹花提取物對供試菌株的MIC見表2。

由表2的結(jié)果可知，牡丹花提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特氏菌的MIC為0.2；對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的MIC為0.3；對黑霉菌、青霉和黃曲霉的MIC為0.4。上述結(jié)果表明牡丹花提取物對細菌的抑菌作用優(yōu)于酵母和霉菌，其中大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特氏菌的MIC相同且最低，這些結(jié)果與表1中的試驗結(jié)果的趨勢一致，進步一說明了試驗結(jié)果的可靠性。

表2　牡丹花提取物對供試菌種的抑菌率Table 2　The bacteriostatic rate of peony extract to tested strains %

3.2熱穩(wěn)定性分析

熱穩(wěn)定性分析見表3。

由表3可知，牡丹花提取物具有一定的熱穩(wěn)定性，在55℃條件下處理30 min不會影響其抑菌活性。但是在較高溫度的條件下牡丹花提取物的抑菌效果會受到影響，在60℃下處理10 min能降低牡丹花提取物抑菌效果的12.9%～40.5%。牡丹花提取物效果隨著處理溫度的提高而降低，當溫度達到90℃時，處理10 min時，對金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和3種霉菌失去了抑菌作用，當處理20 min時對所有的供試菌株的抑菌率為0；當110℃處理10 min時，牡丹花提取物對所有的供試菌株失去了抑菌作用。這說明牡丹花提取物中的抑菌活性物質(zhì)在高溫的作用下失活。

表3　牡丹花提取物在不同熱處理情況下的抑菌率Table 3　The bacteriostatic rate of peony extract to tested strains under different heat treatments %

4　討論

本研究結(jié)果顯示牡丹花提取物對細菌、酵母菌和霉菌都具有顯著的抑菌作用，其中對細菌的抑菌效果優(yōu)于酵母菌和霉菌，而在細菌中對大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特氏菌的抑菌效果最強。牡丹花提取物的耐熱性試驗表明，該提取物的抑菌效果會隨著溫度的提高而降低，這可能是因為牡丹花提取物中的成分主要有多酚、黃酮類化合物、花青素和有機酸等成分，這些主要的活性成分在高溫的作用下會發(fā)生蛋白質(zhì)變性或者揮發(fā)，從而導(dǎo)致牡丹花提取物有效成分的失活。因此在該提取物的制備和使用的過程中一定要避免高溫對牡丹花提取物成分的破壞，溫度應(yīng)該控制在65℃以下。

考慮到pH也能抑制微生物的生長，將pH3.35的HCl和牡丹花提取物（pH=3.35）對供試菌株的抑制效果進行比較，發(fā)現(xiàn)牡丹花提取物的抑菌效果明顯優(yōu)于相同pH下HCl的抑菌效果。同時我們發(fā)現(xiàn)pH3.35的HCl對供試細菌有一定的抑制作用，這說明牡丹花提取物對供試細菌的抑菌作用一方面是因為酸的作用，另一方面可能是因為該提取物中有效成分的作用，如提取物中的有機酸能夠過細胞的細胞膜改變了細胞內(nèi)的pH導(dǎo)致了微生物的死亡［6］，而提取物中的多酚成分能夠改變微生物膜結(jié)構(gòu)的通透性，使得微生物細胞液外泄導(dǎo)致微生物死亡［7］。因此這也牡丹花提取物對較低pH下能夠生存的酵母菌和霉菌有抑菌作用，而pH3.35的HCl對酵母菌和霉菌沒有抑制作用的原因。

［1］李凱，周寧，李赫宇.牡丹花、牡丹籽成分與功能研究進展［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33（3）：228-230

［2］朱素英.牡丹花多酚提取優(yōu)化與抗氧化性［J］.生物技術(shù)，2014（3）：78-82

［3］孫澤飛.牡丹花類黃酮成分及抗氧化能力分析［D］.咸陽：西北農(nóng)林科技大學，2015

［4］向延菊，白紅進，張美娥，等.黑果枸杞果實提取物的抑菌效果研究［J］.食品研究與開發(fā)，2016（1）：26-29

［5］趙立.香蕉皮單寧的提取及抑菌活性研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2009（6）：369-371

［6］ Kim T J，Silva J L，Weng W L，et al.Inactivation of Enterobacter sakazakii by water-soluble muscadine seed extracts.［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，129（3）：295-299

［7］錢麗紅，陶妍，謝晶.茶多酚對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機理［J］.微生物學通報，2010，37（11）：1628-1633

Study on Bacteriostasis of Peony Extract

XU Chun-hua
（Dalian Vocational Technology College，Dalian 116037，Liaoning，China）

In this study，Staphylococcus aureus，Escherichia coli O157，Bacillus cereus，Salmonella，Listeria monocytogenes，Saccharomyces cerevisiae Hansen，Aspergillus niger，Penicillium and Aspergilus flaus were chosen as the tested strains to analyze the antibacterial activity of the peony extract，explore the relationship between pH and bacteriostatic effect of peony extract，finally study the thermal stability of the peony extract.The results showed that the peony extract had obvious inhibitory effect to the bacteria，yeast and mold，and the ability against bacteria（MIC=0.2-0.3）was better than that against yeast（MIC=0.4）and mold（MIC=0.4）.The HCl with the same pH had certain bacteriostasis to tested bacteria，but the effect was significantly lower than the peony extract.In addition，the peony extract had certain thermal stability，bacteriostatic activity of which was not affected under 55℃，and was reduced with the increase of temperature and treatment time，under the condition of 90℃for 20 min，the antibacterial activity of peony extract was lost.

peonyextract；bacteriostasis；pH；thermalstability

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.037

徐春華（1980—），女（漢），講師，碩士，研究方向：微生物。

2016-04-11