山參磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶cDNA克隆及序列分析

馮　凱,李　勝,2,麻　銳,姜　銳,孫立偉,陳　偉，*

(1.吉林省中藥科技創(chuàng)新中心,北華大學(xué)化學(xué)與生物學(xué)院,吉林吉林 132013；2.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150040)

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山參磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶cDNA克隆及序列分析

馮凱1,李勝1,2,麻銳1,姜銳1,孫立偉1,陳偉1，*

(1.吉林省中藥科技創(chuàng)新中心,北華大學(xué)化學(xué)與生物學(xué)院,吉林吉林 132013；2.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150040)

磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(PHGPx)具有明顯的抗氧化活性,避免細(xì)胞膜受到過(guò)氧化損傷。本研究利用RACE技術(shù),克隆出山參phgpx基因全長(zhǎng)cDNA。序列分析表明:該克隆片段全長(zhǎng)490 bp,編碼162個(gè)氨基酸,有3個(gè)真核生物PHGPx特有的保守亞結(jié)構(gòu)域。該片段編碼的蛋白為跨膜親水性穩(wěn)定蛋白質(zhì),與柑橘、蓖麻等PHGPx氨基酸序列同源性分別為76%和75%。同時(shí)建立了9種植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶,基因克隆,山參

人參(PanaxginsengC.A. Mey)是草本藥食同源植物,《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載著其藥用精髓:“主補(bǔ)五臟,除邪氣,久服,輕身延年”?，F(xiàn)代學(xué)者用先進(jìn)的技術(shù)手段考察驗(yàn)證并確認(rèn)其記載的人參藥效正確,人參確有降血糖[1]、抗疲勞[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗衰老[5]、提高免疫力[6],提高認(rèn)知力[7]和調(diào)節(jié)血脂異常[8]等多種藥用功效。

目前廣泛認(rèn)為造成人體衰老的最主要原因之一是活性氧累積所造成的過(guò)氧化損傷[9]。人參有延年益壽的功效,因其含較高的抗氧化、抗衰老等活性成分[10]。山參又稱(chēng)野山參,與栽培人參屬同種,山參生長(zhǎng)年限長(zhǎng),生長(zhǎng)環(huán)境較為苛刻,但積累SOD等成分多于園參,這些研究顯示山參在抗氧化等方面遠(yuǎn)高于園參[11-13]。

磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase,簡(jiǎn)稱(chēng)PHGPx)是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶家族(GPX)中的一類(lèi)較小的單亞基球狀蛋白[14],也是體內(nèi)唯一一種能夠減少細(xì)胞膜氧化損傷的過(guò)氧化物酶[15-16]。PHGPX是最初從鼠和豬中分離純化出的一種“過(guò)氧化作用抑制蛋白”[17],對(duì)植物phgpx基因的研究首次出現(xiàn)在柑橘中[18],目前僅在煙草[19],苦瓜[20],蘿卜[21]等植物中有該基因的研究報(bào)道。人參是傳統(tǒng)中藥植物,具有明顯的抗氧化等功效,但目前沒(méi)有關(guān)于編碼人參抗氧化活性的phgpx基因的研究報(bào)道。本文首次使用RACE PCR克隆技術(shù),克隆出山參phgpx基因,通過(guò)該基因片段的特性分析,與其他同源植物基因的同源性分析,以期為山參及其它相近植物的基因克隆及抗氧化機(jī)制的研究提供參考和依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

30年山參,采自于吉林省白山市撫松縣沿江鄉(xiāng)楞場(chǎng)村(北緯42°48′1″東經(jīng)127°46′18″)。經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定,其為五加科植物人參,符合《2010版中華人民共和國(guó)藥典》(一部)的規(guī)定。pGM-T Tiangen產(chǎn)品;大腸桿菌菌種(Escherichiacoli)DH5α本實(shí)驗(yàn)室保存菌種;3′-Full RACE Core Sets with PrimeScriptTM RTase試劑盒,5′-Full RACE Kit with TAP試劑盒,凝膠回收試劑盒,質(zhì)粒提取試劑盒TaKaRa產(chǎn)品;DNA marker DL2000Promega產(chǎn)品;氨芐青霉素、IPTG和X-gal主要生化與分子生物學(xué)試劑寶泰克產(chǎn)品。DNA測(cè)序由上海生工公司完成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1山參cDNA第一片段的合成山參總RNA提取方法參照林燕玲改進(jìn)的Trizol方法進(jìn)行[22]。以山參總RNA為模版,進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?30 ℃ 10 min,42 ℃ 30 min,99 ℃ 5 min。根據(jù)已報(bào)道的基因保守序列設(shè)計(jì)兼并引物A:5′-tcaag/atggaacttt/ctccaagtt-3′、引物B:5′-atccttctca/gatgctc/aagagg-3′。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模版,用引物A、B擴(kuò)增目的基因第一片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后連接在pGM-T載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌,在含有氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,挑取白斑培養(yǎng),提取質(zhì)粒后送去測(cè)序。

1.2.2目的基因的3′RACE克隆據(jù)第一片段序列信息,設(shè)計(jì)3′ RACE outer 引物:5′-acttttccaagtt cctggtgg-3′;inner 引物:5′-agatggcaatgttgtcgatcg-3′,分別與3′-Full RACE試劑盒下游引物配合,以山參總RNA為模板進(jìn)行3′ RACE的outer PCR和inner PCR程序,程序按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)TA克隆后送去測(cè)序。

1.2.3目的基因的5′ RACE克隆據(jù)第一片段序列信息,設(shè)計(jì)5′ RACE outer 引物:5′-agcgatcgacaa cattgccatc-3′;inner 引物:5′-accttctcgatgctcagaggagag-3′;以山參總RNA為模板,參照5′-Full RACE說(shuō)明書(shū)進(jìn)行5′ RACE的outer PCR和inner PCR程序,PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)TA克隆后送去測(cè)序。

1.2.4序列拼接和分析使用工具EMBOSS(http://emboss.bioinformatics.nl/)對(duì)序列進(jìn)行人工拼接。用工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/),NCBI CD-Search service(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi),SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和DNAStar7.10(美國(guó)DNAstar公司)、DNAMAN5.2(美國(guó)Lynnon Biosoft公司)等軟件對(duì)序列進(jìn)行分析,用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1山參phgpx基因的PCR擴(kuò)增

經(jīng)RACE方法克隆出的山參PHGPx基因經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)結(jié)果如下,5′RACE回收產(chǎn)物大約50 bp(圖1A),3′RACE回收產(chǎn)物大約460 bp(圖1B)。

圖1　RACE PCR電泳圖 Fig.1　RACE PCR electrophoresis 注:Marker:DL2000,圖A 1:5′RACE產(chǎn)物,圖B 1:3′RACE產(chǎn)物。

目的基因片段同T載體連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后取陽(yáng)性克隆送去測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用在線工具EMBOSS 拼接,拼接得到山參PHGPx(PgPHGPx)基因全長(zhǎng)序列為490 bp含有一個(gè)起始密碼子ATG和一個(gè)終止密碼子TAG,編碼162個(gè)氨基酸。

2.2山參PHGPx基因的蛋白特性分析

利用在線工具ProtParam對(duì)PgPHGPx氨基酸序列進(jìn)行理化特性分析,結(jié)果表明PgPHGPx的分子量為18.0375 ku,理論等電點(diǎn)為8.56。其中極性氨基酸(Trp、Tur、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Thr、Asp、Gly、Lys、Arg、His)54.3%,蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)估算值為28.5,屬于穩(wěn)定蛋白類(lèi)。

2.3山參PHGPx基因保守結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列分析

利用NCBI CD-Search service工具對(duì)PgPHGPx蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析表明,其含有谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GSH-peroxidase結(jié)構(gòu)域和類(lèi)似硫氧還蛋白類(lèi)超家族結(jié)構(gòu),在第41個(gè)氨基酸位置具有催化殘基(圖2)。應(yīng)用DNAMAN5.2進(jìn)行phgpx基因的氨基酸序列同源性比較,結(jié)果表明,不同植物phgpx基因同源性差異較大,山參phgpx基因與柑橘(Citrushybridcultivar,ABL67656.1)、蓖麻(Ricinuscommunis,XP_002509790.1)、菠菜(Spinaciaoleracea,BAA22194)的phgpx基因氨基酸同源性分別為76%、75%、70%,均含有PHGPx特有的3個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域(圖3)。植物物種的不同,其體內(nèi)的磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的同源性也會(huì)較低(大約50%～80%),這一結(jié)果明顯比動(dòng)物磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶同源性(90%以上)低很多,這或許是在表明植物在進(jìn)化的過(guò)程中,其磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶也出現(xiàn)了相應(yīng)的功能分化[22]。

圖2　PgPHGPx結(jié)構(gòu)域分析Fig.2　Analysis of PgPHGPx domain

圖3　PgPHGPx與其他植物的PHGPx的氨基酸序列比較Fig.3　Comparison of PHGPx amino acid sequencesbetween PgPHGPx and other plants

用ProtScale程序?qū)gPHGPx親水性預(yù)測(cè)表明,PgPHGPx氨基酸親水性殘基所占比例大于疏水性殘基,數(shù)值為-11.3(圖4),因此可以推測(cè)該酶是親水性的,其疏水性氨基酸主要作用與疏水性底物PLOOH結(jié)合,這與前人其他物種的該酶報(bào)道一致[14]。

圖4　PgPHGPx親疏水性預(yù)測(cè)分析Fig.4　PgPHGPx hydrophilicity predictive analysis

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)由SOPMA來(lái)完成。結(jié)果表明該蛋白含有16.67%的α-螺旋,29.01%的延伸鏈,13.58%的β-轉(zhuǎn)角和40.74%的無(wú)規(guī)則卷曲(圖5)。

圖5　PgPHGPx蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5　Secondary structure prediction of PgPHGPx protein sequence

2.4山參PHGPx系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將PgPHGPx與其他植物的磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶進(jìn)行氨基酸水平的聚類(lèi)分析(圖6)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)除山參外還包括柑橘(Citrushybridcultivar,ABL67656.1)、楊樹(shù)(Populustrichocarpa,XP-002299536)、蓖麻(Ricinuscommuris,XP-002509790)、菠菜(Spinaciaoleracea,BAA22194)、水稻(Oryzasativa,NP-001057006)、大豆(Glycinemax,ACU14410.1)、大黃(Rheumaustrale,ACH63236.1)、高粱(Sorghumbicolor,XP-002436614)和擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP-194915.2)等9種植物。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,山參磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶與大戟科植物蓖麻的磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(XP-002509790)同源性較近,說(shuō)明它們具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)和功能,這與前人報(bào)道也一致[14]。

圖6　山參PgPHGPx與其他植物PHGPx的進(jìn)化Fig.6　Evolutionary of PgPHGPx and other plants PHGPx

3　結(jié)論

山參磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含有真核生物磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶所特有的3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域,是穩(wěn)定蛋白,其親水性殘基所占比例遠(yuǎn)大于疏水性殘基,因此可以推測(cè)該酶是親水性的。這些數(shù)據(jù)為山參磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶對(duì)抗氧化作用的強(qiáng)弱分析提供了依據(jù),豐富了山參相關(guān)活性酶對(duì)損傷細(xì)胞的修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等方面的基因庫(kù)。通過(guò)氨基酸序列建構(gòu)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),顯示山參與其他植物的同源關(guān)系,這些數(shù)據(jù)為以后其他植物phgpx基因克隆提供了理論依據(jù)。

[1]El-Abhar H S,Schaalan M F. Phytotherapy in diabetes:Review on potential mechanistic perspectives[J]. World J Diabetes,2014,5(2):176-197.

[2]徐云鳳,趙雨,邢楠楠,等. 人參蛋白對(duì)小鼠的抗疲勞作用的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2011,32(11):406-407.

[3]Tung-Kwang L,Roberta M J,Ron R A,et al. Radioprotective potential of ginseng[J]. Mutagenesis,2005,20(4):237-243.

[4]Patrick Y K Y,Nai K M,Yuen K C,et al. Pharmacogenomics and the Yin/Yang actions of ginseng:anti-tumor,angiomodulating and steroid-like activities of ginsenosides[J]. Chinese Medicine,2007,2(6):1-21.

[5]Hu W,Jing P,Wang L,et al. The positive effects of Ginsenoside Rg1 upon the hematopoietic microenvironment in a D-Galactose-induced aged rat model[J]. BMC Complement Altern Med,2015,15:119-127.

[6]Soowon K,Hyeyoung M. Ginseng,the ‘Immunity Boost’:The Effects of Panax ginseng on Immune System[J].J Ginseng Res,2012,36(4):354-368.

[7]Tan X,Gu J,Zhao B,et al. Ginseng improves cognitive deficit via the RAGE/NF-κB pathway in advanced glycation end product-induced rats[J]. J Ginseng Res,2015,39(2):116-124.

[8]Lee H,Kim M,Shin S S,et al. Ginseng treatment reverses obesity and related disorders by inhibiting angiogenesis in female db/db mice[J]. J Ethnopharmacol,2014,155(2):1342-1352.

[9]Giorgio M. Oxidative stress and the unfulfilled promises of antioxidant agents[J]. Ecancermedicalscience,2015,9:556-564.

[10]Eunson H,Zheng-wang S,Taek H L,et al. Enzyme-processed Korean Red Ginseng extracts protects against skin damage induced by UVB irradiation in hairless mice[J]. J Ginseng Res,2013,37(4):425-434.

[11]孫思成,王占斌,張慶來(lái),等. 野山參的培育技術(shù)[J]. 林業(yè)科技,2001,26(3):55-56,59.

[12]衛(wèi)勇第,宋長(zhǎng)春,吳廣宣,等. 野山參與園參、西洋參中氨基酸的對(duì)比分析[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1989,15(3):252-253.

[13]王豐,劉進(jìn)元. 水稻谷胱甘肽磷脂氫過(guò)氧化物酶的表達(dá)、純化及晶體生長(zhǎng)條件初篩[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(9):1701-1706.

[14]雷明光,張舒,張冰,等. 谷胱甘肽磷脂氫過(guò)氧化物酶研究進(jìn)展[J].生物學(xué)通報(bào),2005,40(5):1-3.

[15]Avery A M,Avery S V. Saccharomyces cerevisiae expresses three phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidases[J]. J Biol Chem,2001,276(36):33730-33735.

[16]Imai H,Nakagaw Y. Biological significance of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase(PHGPx,GPx4)in mammalian cells[J]. Free Radic Bio Med,2003,34(2):145-169.

[17]Ursini F,Maiorino M,Gregolin C,et al. The seleno enzyme phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase[J]. Biochim Biophys Acta,1985,839(1):62-70.

[18]Tzahar T B,Hayyim G B,Holland D,et al. A stress-associated citrus protein is a distinct plant phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase[J]. FEBS Lett,1995,366(2-3):151-155.

[19]Criqui M C,Jamet E,Pamentier Y,et al. Isolation and characterization of a plant cDNA showing homology to animal glutathione peroxidases[J]. Plant Molecular Biology,1992,18(3):623-627.

[20]李文君,劉進(jìn)元,趙南明. 苦瓜谷胱甘肽磷脂氫過(guò)氧化物酶cDNA的克隆及其特征分析[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2001,28(6):908-911.

[21]Yang X D,Liu J Y. Radish phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase gene structure and upstream regulatory sequence ananlysis[J]. Prog.Biochem.Biophys,2005,32(7):649-656.

[22]林燕玲. 人參根、莖、葉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析[D].長(zhǎng)春:長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),2013.

Cloning and sequence analysis of wild ginseng phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase cDNA

FENG Kai1,LI Sheng1,2,MA Rui1,JIANG Rui1,SUN Li-wei1,CHEN Wei1,*

(1.Science and Technology Innovation Center of Jilin Traditional Chinese Medicine,College of Chemistry and Biology,Beihua University,Jilin 132013,China;2.Alkali Soil Natural Environmental Science Center,Northeast Forestry University,Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field(SAVER),Ministry of Education,Harbin 150040,China;)

Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase(PHGPx)has significant antioxidant activity,avoiding the harm by peroxidation in the cell membrane. To clone the full-length cDNA encodingPHGPxgene from Panax ginseng,the RACE technology was used in this study. The sequence analysis showed that:the full length of the cloned fragment was 490 bp. It encoded 162 amino acids and contained 3 sub-conservative domains which were specific in eukaryonic phospholipid hydroperodixe glutathione peroxidase. The encoding protein was a stable non-transmembrane hudrophilic protein. The sequence of amino acids was similar with PHGPx of citrus and castor,homologous rates of amino acids were 76% and 75%. And then,the phylogenetic tree of nine plants was constructed.

Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase;gene clone;Panax ginseng

2015-11-05

馮凱(1976-),男,碩士,講師,研究方向:植物分子生物學(xué),E-mail:fengk544@163.com。

陳偉(1983-),女,博士,講師,研究方向:植物分子生物學(xué),E-mail:chenw352@126.com。

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(201201144)；吉林省人參轉(zhuǎn)化關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(20140519016JH)；吉林省中藥生物技術(shù)科技創(chuàng)新中心(20130604039TC)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0152-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.023