徐　楊　鄧麗麗　周　麗　蔡年輝　李德龍　段安安　許玉蘭

(西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

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云南松EST-SSR引物在其近緣種中通用性的研究

徐楊鄧麗麗周麗蔡年輝李德龍段安安許玉蘭

(西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

根據(jù)云南松EST序列設(shè)計(jì)了32對(duì)SSR引物，從中隨機(jī)選取7對(duì)引物，對(duì)不同群體云南松及細(xì)葉云南松、馬尾松等近緣種進(jìn)行了PCR，研究云南松EST-SSR引物在近緣物種中的通用性。結(jié)果表明：所選擇的7對(duì)引物對(duì)云南松不同群體及其近緣種的擴(kuò)增成功率均為100%；且7對(duì)引物在云南松不同群體的多態(tài)性比例均為100%，在細(xì)葉云南松、馬尾松、高山松、油松和思茅松等近緣種中分別為71.43%、85.71%、85.71%、85.71%和100%；云南松EST-SSR引物具有較高的通用性，且這些引物可用于分析云南松及其近緣種間的遺傳關(guān)系。

EST-SSR標(biāo)記；云南松；近緣種；通用性

云南松(Pinusyunnanensis)為松科(Pinaceae)松屬裸子植物，是我國(guó)西南地區(qū)荒山造林的先鋒樹(shù)種和主要用材樹(shù)種，具有生長(zhǎng)較快、材質(zhì)較好、耐干旱瘠薄、天然更新能力強(qiáng)等優(yōu)良品性[1]。

松屬樹(shù)種廣泛分布于北半球，我國(guó)產(chǎn)松屬樹(shù)種分布幾乎遍及全國(guó)，其中如馬尾松(Pinusmassoniana)、華山松(Pinusarmandii)、云南松、油松(Pinustabuliformis)等是森林生態(tài)系統(tǒng)和人工林的重要樹(shù)種，并且引進(jìn)了大量有造林發(fā)展前途的樹(shù)種，如濕地松(Pinuselliottii)、火炬松(Pinustaeda)、加勒比松(Pinuscaribaea)等[2]。我國(guó)于20世紀(jì)60—80年代開(kāi)展了馬尾松、火炬松、油松、云南松等遺傳改良工作[3-4]，但由于松樹(shù)的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，許多性狀的遺傳機(jī)制研究缺乏，極大地限制了其育種工作的開(kāi)展[5-6]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，建立在DNA基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記在松樹(shù)遺傳多樣性、親緣關(guān)系、遺傳作圖、基因定位以及標(biāo)記輔助選擇等方面的研究中已得到了廣泛應(yīng)用[5]。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR)在真核生物基因組中的含量非常豐富，具有多態(tài)性高、技術(shù)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、共顯性遺傳、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[7]。EST-SSR是基于表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag, EST)而建立的SSR標(biāo)記[8]，不僅具有SSR標(biāo)記的特點(diǎn)，同時(shí)具有信息量大、通用性好、開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快捷、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，尤其是以PCR為基礎(chǔ)的EST標(biāo)記[9-10]。近年來(lái)，許多物種大規(guī)模的cDNA隨機(jī)測(cè)序?yàn)镋ST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了重要來(lái)源[11]，但國(guó)內(nèi)在松屬樹(shù)種這方面的研究較少，且多從近緣樹(shù)種或公共數(shù)據(jù)庫(kù)中開(kāi)發(fā)EST-SSR引物。王曉鋒等[12]利用松屬5個(gè)樹(shù)種的EST序列開(kāi)發(fā)的馬尾松SSR引物，其在馬尾松中的擴(kuò)增成功率為60%～80%，且在屬內(nèi)、屬間均具有良好的通用性。劉公秉等[13]利用松屬EST序列開(kāi)發(fā)了39對(duì)馬尾松SSR引物，張悅等[14]進(jìn)一步利用這39對(duì)馬尾松EST-SSR引物對(duì)紅松基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明,馬尾松EST-SSR對(duì)紅松種間通用性為27.27%，所篩選的引物用于分析紅松種群遺傳多樣性。本研究擬通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的EST發(fā)掘SSR位點(diǎn)，并在設(shè)計(jì)的32對(duì)引物中隨機(jī)選取7對(duì)引物對(duì)3個(gè)云南松群體，細(xì)葉云南松(Pinusyunnanensisvar.tenuifolia)、高山松(Pinusdensata)、思茅松(Pinuskesiyavar.langbianensis)、油松、馬尾松各1個(gè)群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，旨在探討云南松EST-SSR標(biāo)記在近緣物種中的通用性以及云南松及其近緣物種間的親緣關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料來(lái)源與DNA提取

本研究材料中3個(gè)云南松群體分別采自云南麗江(PYLJ)、寧蒗(PYNL)、元謀(PYYM)，細(xì)葉云南松(PYVT)、馬尾松(PM)、高山松(PD)、油松(PT)和思茅松(PKVL)各1個(gè)群體分別采自廣西樂(lè)業(yè)、貴州玉屏、云南香格里拉、河南盧氏和云南普洱，且每個(gè)群體隨機(jī)選取10～15株個(gè)體。DNA提取選擇植株的新鮮針葉，采用白青松等[15]的改良CTAB法。

1.2EST-SSR引物設(shè)計(jì)

通過(guò)建立云南松幼嫩針葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，搜尋SSR位點(diǎn)，分析分布特征[16]。同時(shí)為提高引物成功擴(kuò)增的概率，將篩選條件進(jìn)一步提高。選擇SSR位點(diǎn)的重復(fù)單元為2個(gè)堿基、3個(gè)堿基、4個(gè)堿基，重復(fù)次數(shù)分別為9、6、5次，并且SSR位點(diǎn)側(cè)翼序列長(zhǎng)度≥50 bp，由北京華諾時(shí)代科技有限公司根據(jù)條件設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)要求GC含量為40%～60%，最適GC含量50%；退火溫度58～63 ℃，最適退火溫度60 ℃；引物長(zhǎng)18～22 bp，最適長(zhǎng)度20 bp，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100～400 bp，最適長(zhǎng)度200 bp，且無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二聚體、錯(cuò)配和引物二聚體。引物命名為PYSSR加序號(hào)(如PyTr01、PyTr02……)。

1.3 EST-SSR通用性檢測(cè)及多態(tài)性評(píng)價(jià)

在32對(duì)引物中隨機(jī)選取7對(duì)引物對(duì)云南松及其近緣種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，來(lái)檢測(cè)云南松EST-SSR引物在近緣種中的通用性。PCR反應(yīng)體系為30 μL，其中包括ddH2O 21.5 μL，10×Ex Taq buffer 3 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 2 μL，10 mmol/L的引物各1 μL，模板DNA 1 μL，Ex Taq 0.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性2 min； 95 ℃變性30 s，55～60 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃條件下延伸10 min。由北京華諾時(shí)代科技有限公司進(jìn)行梯度PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)確定每對(duì)引物的最佳PCR條件。本研究采用熒光PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法，擴(kuò)增后的產(chǎn)物在ABI3730(Applied Biosystem)上進(jìn)行檢測(cè)，獲得各位點(diǎn)的擴(kuò)增片段。

1.4數(shù)據(jù)分析

將檢測(cè)結(jié)果原始文件導(dǎo)入GENEMARKER，選用LIZ500內(nèi)標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，按位點(diǎn)導(dǎo)出峰圖，將結(jié)果匯總錄入到EXCEL中，利用Convert1.3.1軟件將多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)換格式，用Popgen32軟件計(jì)算樣品的遺傳相似度(genetic similarity，GS)和遺傳距離(genetic distance，GD)，以此進(jìn)行聚類分析構(gòu)建聚類樹(shù)，不同引物組合見(jiàn)表1。

表1　云南松EST-SSR及引物序列及重復(fù)單元信息

2　結(jié)果與分析

2.1EST-SSR標(biāo)記的通用性與多態(tài)性

在32對(duì)設(shè)計(jì)合成的EST-SSR引物中隨機(jī)選擇7對(duì)引物，以云南松、細(xì)葉云南松、馬尾松、高山松、油松和思茅松共8個(gè)群體為試材進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果7對(duì)引物在8個(gè)群體中均能得到有效擴(kuò)增產(chǎn)物，通用性達(dá)100%。在云南松3個(gè)群體和思茅松中7對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物均表現(xiàn)為多態(tài)性，多態(tài)性比例為100%；在馬尾松和高山松中除引物PyTr09外其余6對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物均表現(xiàn)為多態(tài)性，在油松中除引物PyTr20外其余6對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物均表現(xiàn)為多態(tài)性，多態(tài)性比例為85.71%；在細(xì)葉云南松中除引物PyTr20、PyTr26外其余5對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物均表現(xiàn)為多態(tài)性，多態(tài)性比例為71.43%。表明云南松EST-SSR引物在云南松近緣種中可通用，并且均具有較高的多態(tài)性。

2.2遺傳參數(shù)及聚類分析

利用Popgene軟件中的共顯性標(biāo)記分析功能，對(duì)不同位點(diǎn)上采集的等位基因數(shù)據(jù)計(jì)算8個(gè)群體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，結(jié)果見(jiàn)表2～3。

表2　云南松及其近緣種間遺傳相似性系數(shù)

表3　云南松及其近緣種間遺傳距離

從表2中可以看出，3個(gè)云南松群體間的遺傳相似系數(shù)最高，其次為細(xì)葉云南松與云南松群體間，油松、馬尾松與云南松間的遺傳相似系數(shù)較小，但最小值也為0.826 5，表明云南松與這幾個(gè)物種的親緣關(guān)系較近。根據(jù)云南松及其近緣種間的遺傳距離的UPGMA聚類分析(圖1)，結(jié)果表明，在遺傳距離0.15處可以將其分為2組，3個(gè)云南松群體與細(xì)葉云南松組成1個(gè)小組，和另1個(gè)小組高山松、思茅松和油松共同組成第1組；馬尾松單獨(dú)為第2組。

3　結(jié)論與討論

SSR引物的通用性取決于近緣分類群之間微衛(wèi)星側(cè)翼序列的保守性和進(jìn)化過(guò)程中微衛(wèi)星的穩(wěn)定性，遺傳距離近的物種SSR引物的通用性更高[17]。EST-SSR引物相對(duì)基因組SSR引物在近緣種的通用性高[18]，張悅等[14]發(fā)現(xiàn)EST-SSR引物在松屬的亞屬內(nèi)轉(zhuǎn)移率較高，而在亞屬間的轉(zhuǎn)移率較低。本研究中云南松、細(xì)葉云南松、思茅松、馬尾松、高山松和油松均屬于油松組，從云南松EST-SSR引物在云南松近緣種中的擴(kuò)增結(jié)果看，7對(duì)云南松EST-SSR引物均可以在云南松近緣種中有效擴(kuò)增，可擴(kuò)增率為100%。從擴(kuò)增的多態(tài)性來(lái)看，在思茅松中7對(duì)EST-SSR引物均表現(xiàn)出多態(tài)性，在馬尾松、高山松和油松中有6對(duì)引物表現(xiàn)出多態(tài)性，在細(xì)葉云南松中有5對(duì)引物表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性比例為71.4%～100%。因此，云南松EST-SSR引物在云南松近緣種中有較高的通用性。Shepherd等[19]研究表明火炬松EST-SSR引物在近緣種中的通用率為75%，同樣具有很高的通用性。

本研究利用云南松幼嫩針葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用EST開(kāi)發(fā)的引物隨機(jī)選擇7對(duì)EST-SSR引物，探討云南松及其近緣種間的親緣關(guān)系與蔡麗娟等[20]和洑香香等[17]的研究結(jié)果比較一致。其中云南松與細(xì)葉云南松聚為一小組，吳兆錄認(rèn)為原始云南松適應(yīng)濕熱生境形成細(xì)葉云南松[21]，細(xì)葉云南松作為云南松的地理變種，相較其他近緣種的遺傳距離更近。云南松、細(xì)葉云南松、思茅松、高山松和油松聚為一組，遺傳距離較近。管中天[22]、Wang等[23-25]根據(jù)形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、等位酶、cpDNA等方面的研究均表明高山松是云南松與油松的天然雜種。虞泓等[26]、盧孟柱等[27]和Eckert等[28]分別在遺傳學(xué)和分子學(xué)水平上的研究表明云南松、油松、高山松和思茅松的遺傳距離較小，與本研究結(jié)果相一致。云南松與其近緣種高山松、思茅松、馬尾松以及變種細(xì)葉云南松在地理分布上相鄰或重疊，兩者發(fā)生著明顯的基因滲入雜交，它們之間的關(guān)系變得更加密切而錯(cuò)綜復(fù)雜[26,29]。馬尾松單獨(dú)作為一組，Eckert等[28]的研究表明馬尾松是較早分化出來(lái)的物種，但進(jìn)化緩慢，其他幾種則分化較晚。

Laosatit等[30]研究表明EST-SSR標(biāo)記在親緣關(guān)系近的物種間通用性高，在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種或?qū)匍g通用性明顯降低。本研究中云南松及其近緣種間的親緣關(guān)系較近，且云南松的EST-SSR引物在近緣種中的通用性較高，多態(tài)性引物比例也較高。隨著我國(guó)松屬樹(shù)種遺傳改良計(jì)劃的逐漸深入，為云南松近緣樹(shù)種SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供了一條捷徑。將為云南松及其近緣樹(shù)種在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)等研究中發(fā)揮作用，具有重要的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯張坤)

The Transferability Analysis of Microsatellite Markers from Expressed Sequence Tags ofPinusyunnanensisto its Close Related Species

Xu Yang, Deng Lili, Zhou Li, Cai Nianhui, Li Delong, Duan An′an, Xu Yulan

(Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province, Southwest Forestry University, Kunming Yunnan 650224, China)

The transferability ofPinusyunnanensisEST-SSR markers to different populations ofP.yunnanensisand its related species was studied by 7 SSR primers randomly selected 32 SSR primers, which were designed based on ESTs. Polymerase chain reaction (PCR) to genomic DNA fromP.yunnanensis、P.yunnanensisvar.tenuifolia、P.massoniana、P.densata、P.tabulaeformisandP.kesiyavar.langbianensiswere tested using 7 SSR primers. The amplification percentage of selected primers to different populations ofP.yunnanensisand its related species were 100%. The percentage of polymorphism of 7 SSR primers was 100% of different populations inP.yunnanensis, and its related species were 71.43%, 85.71%, 85.71%, 85.71% and 100%, respectively. These results indicated that theP.yunnanensisEST-SSR marker was highly transferable to its related species, and these primers can be used to analyze the genetic relationship between theP.yunnanensisand its related species. This study effectively proved that EST-SSR fromP.yunnanensiswas valuable for genetic analysis and linkage mapping study amongP.yunnanensisand its related species.

EST-SSR marker;Pinusyunnanensis; related species; transferability

2015-10-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360189)資助。

許玉蘭( 1979—)，女，博士，副教授。研究方向：林木遺傳育種。Email: xvyulan@163.com。

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.01.003

S718.46

A

2095-1914(2016)01-0016-05

第1作者：徐楊( 1991—)，男，碩士生。研究方向：林木遺傳育種。Email:xuyang191@126.com。