楊穎麗，馬　婷，呂麗榮，李翠祥，滕玉瑾

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州　730070)

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鹽脅迫對(duì)黃花補(bǔ)血草幼苗葉片抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的影響

楊穎麗，馬婷，呂麗榮，李翠祥，滕玉瑾

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070)

以鹽生植物黃花補(bǔ)血草幼苗為供試材料，研究了不同濃度NaCl(0,25,50,100,150mmol·L-1)脅迫下葉片抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)中抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化酶活性的變化．結(jié)果顯示：150mmol·L-1NaCl處理誘導(dǎo)幼苗葉片AsA和總抗壞血酸含量增加；所有鹽濃度誘導(dǎo)脫氫抗壞血酸(DHA)含量、GSH/氧化型谷胱甘肽(GSSG)比值升高，谷胱甘肽還原酶(GR)、抗壞血酸酶(AAO)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)活性增強(qiáng)，而AsA/DHA比值、GSSG含量和單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)活性降低．此外，低濃度鹽脅迫下幼苗葉片GSH含量升高，而高濃度鹽處理誘導(dǎo)葉片GSH含量降低．表明鹽脅迫下黃花補(bǔ)血草幼苗葉片提高了非酶抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化酶活性，增強(qiáng)了幼苗清除活性氧的能力，增強(qiáng)了對(duì)鹽脅迫的耐受能力．

鹽脅迫；黃花補(bǔ)血草；抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)；活性氧

黃花補(bǔ)血草(Limonium aureum(L)Hill)又稱黃花磯松、金色補(bǔ)血草、金匙葉草，是藍(lán)雪科補(bǔ)血草屬多年生泌鹽植物，具有耐干旱、耐鹽堿、耐土壤瘠薄的優(yōu)良特性，多分布于我國呼倫貝爾沙地、騰格里沙漠地區(qū)、甘肅河西走廊沙地和蘭州等地[1-2]．該物種具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在保護(hù)生態(tài)環(huán)境方面也有很好的生態(tài)價(jià)值[3]．目前，關(guān)于黃花補(bǔ)血草的組織培養(yǎng)[4]、化學(xué)成分[5]、器官結(jié)構(gòu)解剖學(xué)[6]等方面有較多的研究報(bào)道．我們在研究中發(fā)現(xiàn)，黃花補(bǔ)血草在鹽脅迫下通過積累滲透調(diào)節(jié)物和提高抗氧化酶活性，使其具有較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力，從而增強(qiáng)對(duì)鹽環(huán)境的適應(yīng)性[7]．但有關(guān)鹽脅迫對(duì)黃花補(bǔ)血草抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-DSH)循環(huán)影響的研究報(bào)道較少．

土壤鹽漬化問題廣泛存在于我國的西北地區(qū)，可導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化，并使農(nóng)作物的生長速率降低，農(nóng)作物產(chǎn)量減少．鹽脅迫是影響植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因子，也是阻礙農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的主要因素之一[8]．植物受到鹽脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，引起膜脂過氧化傷害．活性氧如不能被及時(shí)清除就會(huì)造成氧化脅迫，影響植物正常的生理功能[9]．植物體可通過維持AsA-GSH循環(huán)的快速有效運(yùn)轉(zhuǎn)，減輕逆境脅迫下植物的活性氧傷害[10]．AsA和GSH為AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中的抗氧化劑型非酶組成成分，而谷胱甘肽還原酶(GR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)為該系統(tǒng)中重要的酶促組成成分，在增強(qiáng)植物的抗氧化防御系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要的作用．除此之外，氧化型谷胱甘肽(GSSG)在GR的催化作用下生成GSH，而抗壞血酸酶(AAO)則是依賴于AsA的活性氧清除劑[11]．本研究以黃花補(bǔ)血草幼苗為供試材料，探究鹽脅迫對(duì)黃花補(bǔ)血草幼苗葉片內(nèi)AsA-GSH循環(huán)中抗氧化酶的活性和抗氧化物質(zhì)含量的影響，旨在進(jìn)一步了解鹽脅迫下植物體內(nèi)AsA-GSH循環(huán)的變化機(jī)制，為研究植物耐鹽性的生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)．

1　材料與方法

1.1植物材料的培養(yǎng)及處理

將籽粒飽滿的黃花補(bǔ)血草(Limonium aureum(Linn)Hill)種子(由甘肅省民勤縣沙生植物園提供)浸泡在10%的次氯酸鈉溶液中10min，并分別用無菌水沖洗3次，75%的乙醇浸泡約30s，無菌水連續(xù)沖洗5～7次后，將種子移到1/4Hoagland固體培養(yǎng)基中，在其萌發(fā)4d后，挑選生長程度接近的幼苗依次轉(zhuǎn)入含有0,25,50,100和150mmol·L-1NaCl的1/4Hoagland固體培養(yǎng)基上(每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù))，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，光暗周期12h/12h，光照強(qiáng)度1 500～2 000lx，晝夜溫度(25±2)℃，處理21d后取葉片進(jìn)行各生理指標(biāo)的檢測．

1.2AsA,DHA和總抗壞血酸(AsA+DHA)含量的測定

參照Kampfenkel等[12]的方法測定AsA和AsA+DHA含量．1g幼苗葉片加入4mL6%的三氯乙酸(TCA)冰浴研磨，13 000r·min-1離心10min后，提取上清液備用.AsA含量檢測時(shí)，取0.2mL上清液依次加入0.6mL0.2mol·L-1磷酸緩沖液(PBS，pH7.4)、0.2mLH2O、1.0mL10%TCA、0.8mL42%磷酸和0.8mL4%2,2′-聯(lián)吡啶，最后加入3%三氯化鐵(FeCl3)，42 ℃水浴40min后于525nm處測定OD．AsA+DHA含量測定時(shí)，在0.2mL上清液中依次加入0.2mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)和0.4mL0.2mol·L-1PBS(pH7.4)，于42 ℃水浴15min，加入0.2mL0.5%N-乙基馬來酰亞胺(NEM)，室溫放置1min，而后重復(fù)AsA含量的檢測方法,以nmol·g-1鮮重(FW)為單位．DHA的含量為AsA+DHA和AsA的差值，并計(jì)算AsA/DHA比值．

1.3GSH和GSSG含量的測定

依據(jù)Hissin和Hilf[13]的方法，用熒光光度計(jì)檢測GSH和GSSG含量，1g葉片加入3.75mL0.1mol·L-1PBS(pH8.0，含有5mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉(EDTA))和1mL25%磷酸，冰浴研磨，并以15 000r·min-1離心30min．GSH測定時(shí)，0.5mL上清中加入4.5mL0.1mol·L-1PBS(pH8.0，含有5mmol·L-1EDTA)，取稀釋的上清100μL，加入1.8mL0.1mol·L-1PBS(pH8.0，含有5mmol·L-1EDTA)和100μL0.1%的鄰苯二甲醛，混勻后室溫放置15min，于420nm發(fā)射光和350nm激發(fā)光下測定熒光值．GSSG測定時(shí)，在0.5mL上清中加入200μL0.04mol·L-1NEM，室溫放置30min后，加入4.3mL0.1mol·L-1NaOH，混勻后于420nm發(fā)射光和350nm激發(fā)光下測定熒光值．GSH和GSSG含量均以ng·mg-1FW為單位．

1.4GR,AAO,MDHAR和DHAR活性的測定

參照Foster[14]的方法檢測GR的活性．0.5g葉片，加入2mL50mmol·L-1Tris-HCl(pH7.5，含0.1mmol·L-1EDTA和0.1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP))，12 000r·min-1離心30min，取上清液150μL加入3mL50mmol·L-1Tris-HCl(pH7.5，含3mmol·L-1MgCl2，0.5mmol·L-1GSSG和0.15mmol·L-1NADPH)中，混勻后立即于340nm處以30s為間隔做3min時(shí)間掃描.以1min內(nèi)OD340值變化的0.1為一個(gè)酶活單位(U)．

參照Shen等[15]的方法檢測AAO的活性．1g葉片材料加入4mL50mmol·L-1PBS(pH7.2，含2mmol·L-1EDTA，2mmol·L-1DTT，20%甘油和2%PVP)，10 000r·min-1離心30min，上清液用于檢測蛋白含量．AAO測定時(shí)，取0.1mL上清加入2.5mL50mmol·L-1PBS(pH5.6，含1mmol·L-1AsA和5mmol·L-1EDTA)，混勻后在265nm處以20s為間隔做2min時(shí)間掃描.以1min內(nèi)OD265值變化的0.1為一個(gè)酶活單位(U)．參照Ma和Cheng[16]的方法檢測MDHAR和DHAR的活性．MDHAR測定時(shí)，0.1mL上清中加入2.9mL50mmol·L-1Hepes-NaOH(pH7.6，含0.1mmol·L-1NADH，0.25mmol·L-1AsA和0.3U抗壞血酸氧化酶)，混勻后于340nm處以20s為間隔做2min時(shí)間掃描.以1min內(nèi)OD340值變化的0.01為一個(gè)酶活單位(U)．DHAR測定時(shí)，取0.1mL上清加入2.9mL100mmol·L-1Hepes-NaOH(pH7.0，含2.5mmol·L-1GSH和0.6mmol·L-1DHA)，混勻后于265nm處以20s為間隔做2min時(shí)間掃描.以1min內(nèi)OD265值變化的0.01為一個(gè)酶活單位(U)．

以上酶活性單位均用U·mg-1protein表示．

1.5蛋白含量的測定

參照Bradford[17]的方法檢測蛋白含量，在波長595nm處測定吸光值，并以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算蛋白含量．

1.6數(shù)據(jù)分析

利用SPSS17.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，并用Excel和CorelDraw9.0進(jìn)行制圖與圖表處理．每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用Duncan多重比較的方法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)顯著性水平為0.05．

2　結(jié)果與分析

2.1鹽脅迫對(duì)黃花補(bǔ)血草幼苗葉片AsA,DHA,AsA+DHA含量和AsA/DHA比值的影響

如表1所示，在25,50和100mmol·L-1NaCl脅迫下，黃花補(bǔ)血草幼苗葉片中AsA含量沒有顯著變化，而在最高濃度150mmol·L-1NaCl處理下，葉片中AsA的含量顯著增加，相比于對(duì)照組升高了19.51%．

幼苗葉片中DHA的含量與對(duì)照組相比均有不同程度的升高，并分別升高了8.96%，11.94%，2.99%和20.90%(表1)，可見在150mmol·L-1NaCl脅迫下這一趨勢較為顯著．

幼苗葉片中AsA+DHA含量在25和50mmol·L-1NaCl脅迫下沒有明顯的變化，而在100mmol·L-1NaCl脅迫下減小，150mmol·L-1NaCl脅迫下增大，與對(duì)照組相比分別變化了6.71%和20.13%(表1)．

由表1可知，25,50和100mmol·L-1NaCl脅迫誘導(dǎo)幼苗葉片的AsA/DHA比值顯著降低，而150mmol·L-1NaCl脅迫不影響AsA/DHA比值．

2.2鹽脅迫對(duì)黃花補(bǔ)血草幼苗葉片GSH,GSSG含量和GSH/GSSG比值的影響

由圖1A可知，鹽脅迫誘導(dǎo)黃花補(bǔ)血草幼苗葉片中的GSH含量呈先升高后降低的變化趨勢．與對(duì)照組相比較，25和50mmol·L-1NaCl處理誘導(dǎo)幼苗葉片中GSH含量分別升高約4.9%和16.99%，而在100和150mmol·L-1NaCl處理下，幼苗葉片中GSH含量分別降低約15.59%和16.46%．不同的是，幼苗葉片中的GSSG含量在鹽處理下呈現(xiàn)逐漸減小的變化趨勢(圖1B)，在25,50,100和150mmol·L-1NaCl處理下，較對(duì)照組分別降低約13.42%,20.13%,28.19%和28.86%.此外，所有鹽濃度均導(dǎo)致幼苗葉片的GSH/GSSG比值升高，且在50mmol·L-1NaCl處理時(shí)達(dá)到最大值(圖1C)．

表1　不同濃度NaCl對(duì)黃花補(bǔ)血草幼苗葉片AsA,DHA,AsA+DHA含量和AsA/DHA比值的影響

注：不同字母表示差異顯著P<0.05．

圖1　不同濃度NaCl對(duì)黃花補(bǔ)血草幼苗葉片GSH、GSSG和GSH/GSSG比值的影響Fig 1　Effects of different NaCl concentrations on GSH,GSSG and GSH/GSSG in L aureum seedling leaves

2.3鹽脅迫對(duì)黃花補(bǔ)血草幼苗葉片GR,AAO,MDHAR和DHAR活性的影響

由表2可知，所有鹽濃度誘導(dǎo)黃花補(bǔ)血草幼苗葉片GR活性顯著增強(qiáng)，此效應(yīng)具有濃度依賴性．與未處理幼苗相比，25,50,100和150mmol·L-1NaCl脅迫誘導(dǎo)幼苗葉片中的GR活性分別增強(qiáng)約1.76倍、1.76倍、2.24倍和4.59倍．

黃花補(bǔ)血草幼苗葉片的AAO活性在25,50和100mmol·L-1NaCl脅迫下顯著增強(qiáng)，且分別升高為對(duì)照組的1.67倍、1.84倍和1.42倍，但在最高濃度(150mmol·L-1)NaCl處理時(shí)與對(duì)照比沒有明顯變化(表2)．

幼苗葉片的MDHAR活性在鹽處理下較對(duì)照均有所降低，但50mmol·L-1NaCl處理時(shí)的變化與對(duì)照比無明顯差異，而25,100和150mmol·L-1NaCl處理下分別降低約45.4%,49.58%和70.08%.

所有鹽脅迫均誘導(dǎo)幼苗葉片DHAR的活性顯著增強(qiáng)，且在25,50,100和150mmol·L-1NaCl脅迫下，分別增強(qiáng)為對(duì)照組的1.63倍、3.81倍、3.75倍和2.43倍．

表2　不同濃度NaCl對(duì)黃花補(bǔ)血草幼苗葉片GR,AAO,MDHAR和DHAR活性的影響

注：不同字母表示差異顯著P<0.05．

3　討論

鹽脅迫對(duì)植物的破壞作用主要是通過滲透脅迫、離子毒害、營養(yǎng)失衡，并導(dǎo)致鹽脅迫的次級(jí)反應(yīng)如氧化脅迫等的產(chǎn)生[18]．AsA-GSH在植物抵抗氧化脅迫、清除活性氧自由基方面具有重要作用[10]，其中AsA含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA比值)及其相關(guān)代謝合成酶的活性變化與植物對(duì)生態(tài)環(huán)境脅迫的響應(yīng)息息相關(guān)[19]．鹽處理(NaCl)羅勒葉片30d后，對(duì)AsA+DHA含量沒有影響，且葉片內(nèi)AsA含量和AsA/DHA比值保持不變[20]．而NaCl脅迫下番茄幼苗葉片AsA含量顯著提高，AsA/DHA比值降低[21]．本研究中NaCl脅迫下黃花補(bǔ)血草幼苗葉片AsA，DHA和AsA+DHA的含量在25,50和100mmol·L-1NaCl脅迫下并沒有發(fā)生明顯變化，而在最高濃度(150mmol·L-1)處理時(shí)均明顯升高，但AsA/DHA比值在25,50和100mmol·L-1NaCl處理時(shí)均顯著低于對(duì)照組(表1)．表明高濃度鹽脅迫下黃花補(bǔ)血草幼苗通過增加葉片中AsA和DHA的積累，調(diào)節(jié)葉片內(nèi)的氧化還原狀態(tài)來響應(yīng)鹽脅迫，使幼苗的抗逆境脅迫能力增強(qiáng)．

GSH與AsA都是植物調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的必需代謝物，在植物抗氧化防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22]．有研究者指出，AsA/DHA和GSH/GSSG的比值變化可能與植物的耐鹽性有關(guān)，有助于植物有效防止氧化損傷，在植物細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激方面比AsA和GSH的含量更具有重要意義[23]．鹽脅迫導(dǎo)致葡萄葉片中GSH含量、GSH/GSSG比值明顯降低，而GSSG含量明顯升高[24]．而水稻幼苗葉片中GSH含量在150 和250mmol·L-1NaCl脅迫下顯著增加，GSH/GSSG比值在兩種鹽濃度處理下顯著下降[25]．本研究中黃花補(bǔ)血草幼苗葉片GSH含量在低濃度(25和50mmol·L-1)NaCl脅迫下升高，而高濃度(100和150mmol·L-1)NaCl脅迫下降低，此外，所有鹽濃度均誘導(dǎo)幼苗葉片GSH/GSSG比值的升高，此效應(yīng)在(25和50mmol·L-1)NaCl處理時(shí)更加顯著，但幼苗葉片中GSSG含量在鹽脅迫下呈下降趨勢．這些結(jié)果表明，在鹽脅迫下黃花補(bǔ)血草幼苗葉片通過提高GSH的含量和GSH/GSSG的比值，并降低GSSG的含量，來維持細(xì)胞相對(duì)穩(wěn)定的氧化還原平衡，增強(qiáng)幼苗清除活性氧的能力，從而提高了植株抗鹽脅迫的能力，緩解了鹽脅迫對(duì)幼苗造成的傷害，而高鹽濃度下GSH含量降低可能是由于GSH的合成代謝過程受到了破壞．

鹽脅迫下植株體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量自由基引起植株代謝失衡，AsA和GSH在鹽脅迫下的再生，使得AsA-GSH循環(huán)快速高效運(yùn)轉(zhuǎn)，進(jìn)而維持了植物較強(qiáng)的氧化還原力和高水平的抗氧化物質(zhì)，使過量產(chǎn)生的活性氧可以及時(shí)被清除[26]．GR，AAO，MDHAR和DHAR是AsA-GSH系統(tǒng)中重要的酶促組成成分，控制著植物細(xì)胞中抗壞血酸的含量．文獻(xiàn)報(bào)道，鹽處理增強(qiáng)了菜豆葉片GR的活性，降低了其葉片MDHAR和DHAR的活性．不同的是，水稻幼苗葉片的GR，MDHAR和DHAR活性在鹽脅迫下均逐漸增強(qiáng)[23,25]．除此之外，非生物脅迫誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片中AAO活性增強(qiáng)，隨著脅迫時(shí)間的延長，酶活性又慢慢降低[11]．本實(shí)驗(yàn)鹽脅迫誘導(dǎo)黃花補(bǔ)血草幼苗葉片GR和DHAR的活性增強(qiáng)，MDHAR活性降低，而幼苗葉片AAO的活性在25,50和100mmol·L-1NaCl條件下顯著增強(qiáng)，但150mmol·L-1NaCl處理不影響AAO的活性．這些結(jié)果表明，GR活性的增強(qiáng)有效實(shí)現(xiàn)了黃花補(bǔ)血草幼苗體內(nèi)AsA的再生，在清除活性氧的過程中起到重要的作用．此外，在AsA-GSH循環(huán)中，AsA也可通過MDHAR和DHAR利用NADPH和GSH作為電子供體由DHA再生[25]．因此，黃花補(bǔ)血草幼苗葉片中較高的DHAR活性保證了幼苗葉片中AsA含量的增加，促進(jìn)了AsA的再生，實(shí)現(xiàn)抗壞血酸的循環(huán)再利用，而幼苗葉片AAO活性的增強(qiáng)賦予了幼苗在鹽脅迫下較強(qiáng)的活性氧清除能力．由此可見，保持較高的抗氧化酶活性可清除過量活性氧，且能較好地維持AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的完整性，這也可能是黃花補(bǔ)血草幼苗耐NaCl脅迫的主要原因之一．

綜上可知，鹽脅迫下黃花補(bǔ)血草幼苗葉片可能通過提高非酶抗氧化物質(zhì)AsA，GSH含量和GSH/GSSG比值，并增強(qiáng)GR，DHAR和AAO等抗氧化酶活性，進(jìn)而增強(qiáng)幼苗的抗氧化能力，緩解了NaCl對(duì)幼苗造成的氧化損傷．

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(責(zé)任編輯俞詩源)

Effects of salinity stress on ascorbate-glutathione cycleintheleavesofLimonium aureum(L)Hillseedlings

YANGYing-li,MATing,LüLi-rong,LICui-xiang,TENGYu-jin

(CollegeofLifeScience,NorthwestNormalUniversity.Lanzhou730070,Gansu,China)

HalophyteLimonium aureum(L)Hillseedlingsareusedtoinvestigatethechangesofantioxidantsubstancecontentsandantioxidantenzymeactivitiesassociatedwithascorbate-glutathione(AsA-GSH)cycleinresponestodifferentNaClconcentrations(0,25,50,100,150mmol·L-1).Theamountofascorbicacid(AsA)andtotalascorbicacidcontentsriseduetoonly150mmol·L-1NaCl.Differently,allsalinityconcentrationsleadtotheincreasesofdehydroascorbate(DHA)content,GSH/oxidizedglutathione(GSSG)andglutathionereductase(GR),ascorhicoxidas(AAO)anddehydroascorbatereductase(DHAR)activities,butthedecreasesofAsA/DHA,GSSGlevelandmonodehydroascorbatereductase(MDHAR)activities.Inaddition,GSHcontentincreasesinresponsetolowNaClconcentrationsbutdecreasestohighsalinityintheleavesofLimonium aureum(L)Hillseedlings.Takentogether,salinitystressresultsintheincreasesofnon-enzymaticantioxidantlevelsandantioxidantenzymeactivitiesintheleavesofLimonium aureum(L)Hillseedlings,whichmightenhancetheabilityofreactiveoxygenspeciesscavengingandstrengthenseedlingresistancetosaltstress.

saltstress;Limonium aureum(L)Hill;ascorbate-glutathionecycle;reactiveoxygenspecies

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.03.016

2015-10-20;修改稿收到日期:2015-11-12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31360094，31470464)

楊穎麗(1971—)，女，甘肅漳縣人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師．主要研究方向?yàn)橹参锷砼c分子生物學(xué).

E-mail:yangyingli2006@sohu.com

S512.1+2

A

1001-988Ⅹ(2016)03-0084-06