李獻(xiàn)文　仇鐵峰　丁明　金建華江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，呼吸內(nèi)科，江蘇常州00江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇常州00

hTERT mRNA在肺癌中的作用△

李獻(xiàn)文1仇鐵峰2#丁明3金建華1
江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)人民醫(yī)院1腫瘤內(nèi)科，2呼吸內(nèi)科，江蘇常州213002
3江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇常州212002

目的探討人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomeraseReverse transcriptase，hTERT）在肺癌患者外周血微轉(zhuǎn)移中的診斷價(jià)值。方法選取確診為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的患者40例，選擇同期診斷為肺部良性疾病的患者20例為研究對(duì)象，在未進(jìn)行任何治療前收集各研究對(duì)象的外周血，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)血hTERT mRNA并進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。結(jié)果①NSCLC患者外周血中hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于肺良性疾病患者（P<0.05）；②40例NSCLC患者外周血中hTERT mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率分別為58.2%，20例肺良性疾病患者h(yuǎn)TERT mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為5%，明顯低于肺癌組患者（均P＜0.001）；③經(jīng)分析，患者的hTERT mRNA與肺癌分期（TNM）具有顯著的關(guān)系（P=0.004），但是，患者的年齡、性別、吸煙、腫瘤的組織學(xué)類型及分化程度對(duì)hTERT mRNA的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)論外周血hTERT mRNA表達(dá)在肺癌細(xì)胞分子標(biāo)志物的NSCLC臨床診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

肺癌；hTERT

Key worddss::lung cancer;hTERT

Oncol Prog,2016,14(1)

肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，且呈急劇上升趨勢(shì)。其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占所有肺癌的80%，小細(xì)胞肺癌（SCLC）約占20%[1]。至2014年全球每年新增肺癌患者人數(shù)已達(dá)120萬(wàn)，我國(guó)肺癌發(fā)病率每年增長(zhǎng)26.9%，且自診斷為肺癌后，其5年生存率﹤15%[1-2]。雖然手術(shù)是治療NSCLC的主要方法，但65%的NSCLC患者在診斷時(shí)已存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而20%的患者無(wú)轉(zhuǎn)移[3]。其中，Ⅰ期NSCLC患者中有30%～40%的患者接受根治性手術(shù)治療后均出現(xiàn)不同程度的復(fù)發(fā)狀況，并且最終導(dǎo)致死亡[4-5]。經(jīng)專家分析可知，其死亡?原因?yàn)榘┘?xì)胞擴(kuò)散至其他內(nèi)臟所致。

肺癌預(yù)后生物學(xué)因子，即腫瘤標(biāo)志物在肺癌中已展開了廣泛研究，但仍未形成定論。端粒是維持真核系染色體末端完整及防止其異常的結(jié)構(gòu)。人端粒酶是由人端粒酶RNA，其相關(guān)蛋白和hTERT共同構(gòu)成。端粒酶存在于端粒的合成過(guò)程中，它是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，TTAGGG的合成就是依靠這種端粒酶進(jìn)行合成的，其編碼基因主要位于3q26.3位置。端粒酶不僅作為一種逆轉(zhuǎn)錄酶而存在，且它在催化hTERT等方面還存在著顯著的作用。所以本研究就hTERT mRNA在肺癌中的作用進(jìn)行深入的探討，以便為臨床提供指導(dǎo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1病例資料

選取自2011年7月至2012年6月于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院確診為NSCLC的患者40例作為肺癌組。肺癌組患者中，男性25例，女性15例，年齡為42～80歲，平均年齡65歲；年齡≥60歲的患者有25例，﹤60歲的患者有15例。對(duì)肺癌組40例患者采用國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)2009年修訂的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定，評(píng)定結(jié)果為：Ⅰ～Ⅱ期患者23例，Ⅲ～Ⅳ期患者17例。根據(jù)病理類型分為鱗癌患者29例，腺癌患者11例。低分化癌患者14例，中高分化癌患者26例?；颊呶鼰煍?shù)量≥600支/年的患者23例，患者吸煙數(shù)量﹤600支/年的患者17例。本研究患者均無(wú)接受過(guò)任何藥物治療，在此抽取患者的外周血作為檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

另外，在確定肺癌組患者的同時(shí)，選取20例肺部具有輕微病變（主要包括一些輕微的炎癥等病變，其中肺炎7例，慢性支氣管炎6例，結(jié)核性胸膜炎4例，膿胸、氣胸、肺結(jié)節(jié)病各1例）的患者作為肺部良性疾病組。該組患者中，有男性14例，女性6例，年齡18～75歲，平均年齡55歲，此組患者無(wú)癌變現(xiàn)象。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成總RNA提?。涸诨颊呖崭?fàn)顟B(tài)下抽取患者4 ml外周血，在抽取的新鮮外周血中加入EDTA-Na進(jìn)行抗凝。采取密度梯度離心分離的方法將淋巴細(xì)胞分離出來(lái)。進(jìn)而將分離好的分離液在無(wú)RNase的條件下采用Trizol試劑對(duì)其進(jìn)一步地提取分離，最終提取的RNA為總RNA。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA中的R值，根據(jù)公式A260/A280計(jì)算出RNA的總濃度。采用Fermentas公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的合成要求對(duì)cDNA進(jìn)行合成，并且將得到的總RNA與合成的cDNA在-20℃的冰箱中進(jìn)行保存。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)根據(jù)上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)及合成引物序列如下：β-actin F（5'-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3'），β-actinR（5'-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3'）；hTERT F（5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'），hTERTR （5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3'）。熒光定量檢測(cè)：在10 μl的反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)條件：在95℃的高溫條件下進(jìn)行預(yù)變性30 s，該操作循環(huán)進(jìn)行40次（95℃變性6 s、58℃退火15 s、74℃延伸25 s）；溶解條件：在95℃的高溫條件下進(jìn)行溶解60 s、在58℃的高溫條件下進(jìn)行高溫溶解25 s、在95℃的高溫條件下進(jìn)行溶解30 s。

1.2.3熒光定量PCR產(chǎn)物鑒定步驟：hTERT PCR的產(chǎn)物取5 μl，6×loading Buffer混勻，將該產(chǎn)物加樣在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行混合，通100 V的恒壓進(jìn)行電泳30 min，最后采用EB染色，取染色片在凝膠成像系統(tǒng)下攝片，觀察條帶。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

相對(duì)定量值計(jì)算公式：2-△△Ct。△Ct為樣本和內(nèi)參△Ct均值，△△Ct=△Ct（-對(duì)照組Ct均值-改組內(nèi)參Ct均值）。本研究采用2-△△Ct表示cDNA中包含的所要檢測(cè)的基因含量。應(yīng)用SPSS16-.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組之間mRNA測(cè)定值的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher’s Exact Test檢驗(yàn)，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1hTERT mRNA實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線

肺癌患者外周血中hTERT mRNA（圖1），當(dāng)Ct水平≤36時(shí)，其熒光定量的擴(kuò)增曲線呈典型的S形曲線，溶解曲線也會(huì)呈現(xiàn)為單峰相。而肺部良性疾病組標(biāo)本，Ct水平>36時(shí)也未見典型S形波形，即使擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)也沒(méi)有典型S形曲線出現(xiàn)，多為略有翹起的不規(guī)則波浪線。

圖1　部分患者標(biāo)本的hTERT mRNA實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線

2.2hTERT熒光定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

肺癌組患者h(yuǎn)TERT mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率分別為58.2%，部分標(biāo)本高表達(dá)hTERT mRNA，而肺部良性疾病組基本不表達(dá)hTERT mRNA，陽(yáng)性表達(dá)率僅為5%，明顯低于肺癌組患者（P﹤0.001，圖2），所得的條帶大小和定量結(jié)果是基本一致的。

圖2　各組外周血hTERT擴(kuò)增結(jié)果

2.3 hTERT mRNA在兩組患者外周血中的相對(duì)表達(dá)量

hTERT mRNA在兩組患者外周血中的相對(duì)表達(dá)量不同，在NSCLC患者中的表達(dá)量為（3.02± 0.12），而肺良性疾病患者表達(dá)量為（2.43±1.12），兩組的表達(dá)量差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.562，P ﹤0.05）。

2.4外周血hTERT mRNA與臨床特征的關(guān)系

外周血hTERT mRNA的陽(yáng)性例數(shù)與年齡、性別、吸煙與否、組織類型、分化層度無(wú)顯著差異，僅與臨床分期方面具有顯著差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表1）

3　討論

在肺癌治療過(guò)程中，常見的臨床問(wèn)題是出現(xiàn)局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后不良的主要原因。如果能在早期評(píng)估其預(yù)后狀況并采取相應(yīng)的治療措施，那么肺癌的病死率可能會(huì)大大降低。Pellatt等[6]提出血循環(huán)中的生物標(biāo)志物對(duì)腫瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、治療效果和腫瘤復(fù)發(fā)均有監(jiān)測(cè)作用。研究人員正在試圖采取非侵入性方式從標(biāo)本，如血漿、痰液中找到腫瘤標(biāo)志物，以期在早期診斷和隨訪患者時(shí)，及時(shí)對(duì)腫瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，患者的腫瘤組織中、血循環(huán)中均存在異常的DNA[7]。

癌癥的發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及基因和一些演變過(guò)程，其最終是由于細(xì)胞的再生與凋亡發(fā)生失調(diào)的結(jié)果。因此，維持正常的組織細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，可以有效地減少癌癥的發(fā)生，端粒酶在維持細(xì)胞平衡方面起著重要的作用。對(duì)于健康人類，端粒酶活動(dòng)只能在生殖細(xì)胞、造血細(xì)胞、激活淋巴細(xì)胞和其他潛在的增殖細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[8]。但是在腫瘤細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)大量的端粒酶[9]。此外，80%的NSCLC患者中可檢測(cè)到端粒酶活性[10]，且和TNM分期密切相關(guān)。病情進(jìn)展較快的肺癌患者具有較高的端粒酶活性[10]。本實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR結(jié)果證明，hTERT mRNA在肺癌患者外周血中的表達(dá)率較高，并且癌癥的TNM分期與其表達(dá)層度具有顯著關(guān)系，但是hTERT mRNA的表達(dá)與患者的年齡、性別、吸煙、腫瘤的組織學(xué)類型及分化程度方面無(wú)明顯相關(guān)性。綜上所述，端粒酶的激活是肺癌過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟，與肺癌TNM分期相關(guān)，因此可以作為早期肺癌患者的分子標(biāo)志物，對(duì)腫瘤的早期診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供幫助，但是其與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后的相關(guān)性仍需進(jìn)一步探索。

表1　外周血hTERT mRNA與臨床特征的關(guān)系

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TheRole of hTERT mRNAin lung cancer△

LI Xian-wen1QIU Tie-feng2#DING Ming3JIN Jian-hua11
Department of Medical Oncology,2Respiratory Medicine,Wujin Affiliated Hospital of Jiangsu University,Changzhou 213002,Jiangsu,China3Department ofRespiratory Medicine,Affiliated Hospital of Jiangsu University,Changzhou 212002,Jiangsu,China

ObjeccttiivveeTo investigate the diagnostic value of human telomeraseReverse transcriptase(hTERT)micrometastases in peripheral blood of patients with lung cancer.MeetthhooddThe peripheral blood sample of 40 cases of NSCLC lung cancer,and 20 cases of benign lung lesions were collected before startingRespective treatment,and theReal-time PCR method was applied to detect and evaluate the hTERT mRNA.Reessuulltt(1)TheRelative mRNA expression level of hTERT in NSCLC patients were significantly higher than those in benign lung disease patients(P<0.05).(2)The positiveRate of mRNA expression of hTERT in peripheral blood from 40 patients with NSCLC were 58.2%,while that of hTERT expression in peripheral blood from patients with benign lung disease were 5%,which was markedly lower compared with NSCLC patients(P<0.001).(3)For patients with NSCLC,the tumor TNM stage was significantly correlated with positiveRate of hTERT mRNA expression(P=0.004),whereas there were no correlations between the positiveRate of hTERT mRNA expression and age,gender,smoking,histopathlogical type and tumor cell differentiation degree.Coonncclluu--ssiioonnThe hTERT mRNAexpressions in peripheral blood could be used as a molecular marker for diagnosis of NSCLC.

R563

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.01.20

常州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（CY2011901）#

（corresponding author），郵箱：qiutiefeng@163.com

2015-11-17）