禹海鑫，徐 梅，徐 寧，孫民琴，安榆林

(1.南通出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南通 226004； 2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 210009)

白條天牛DNA條形碼鑒定技術(shù)

禹海鑫1，徐 梅2，徐 寧1，孫民琴1，安榆林2

(1.南通出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南通 226004； 2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 210009)

白條天牛屬(鞘翅目：天?？?昆蟲是口岸植物檢疫工作中多次截獲的類群，為探討線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(mtDNA COI)基因的特定區(qū)段作為DNA條形碼鑒定白條天牛種類的可行性，嘗試應(yīng)用該技術(shù)對國內(nèi)外13種白條天牛進(jìn)行分子鑒定，測定各種類mtDNA COI基因序列(其中10種檢疫性白條天牛COI基因序列為國內(nèi)外首次測序)并進(jìn)行比對，采用MEGA 5.05構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明：基于mtDNA COI基因的DNA條形碼技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對白條天牛種類快速、準(zhǔn)確的鑒定。

白條天牛；COI基因；DNA條形碼；鑒定

白條天牛屬(Batocera)昆蟲屬于鞘翅目(Cleoptera)天?？?Cerambycidae)溝脛天牛亞科(Laniinae)白條天牛族(Batocerini)，是重要的林木害蟲[1-2]。該屬昆蟲在全世界共有60余種，廣泛分布于亞洲、非洲、澳大利亞及東歐部分地區(qū)。我國分布有云斑天牛(Batocerahorsfieldi(Hope))、橙斑白條天牛(BatoceradavidisDeyrolle)等12個(gè)種類[2-3]。除此12種外，其余種類在我國都沒有發(fā)生。白條天牛(非中國種)均被列為我國檢疫性昆蟲[4]。此外，該屬天牛全是林木業(yè)重要害蟲，以幼蟲在樹干及枝條的木質(zhì)部、韌皮部鉆蛀取食，可為害柳、楊、梨、櫟、女貞等多種闊葉樹種[1-2]。

近年來，隨著我國外向型經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，木材及木包裝的進(jìn)出口量劇增，國內(nèi)各口岸在進(jìn)境木材檢疫工作中也多次截獲白條天牛。例如，2009年嘉興乍浦口岸在馬來西亞進(jìn)口木材中首次截獲托氏白條天牛(Batocerathomsoni)[5]。2012年張家港口岸在進(jìn)境巴布亞新幾內(nèi)亞原木中截獲到白條天牛非中國種(Batoceralaena)[6]。另據(jù)媒體報(bào)道，2011年和2014年，江蘇吳江口岸先后在進(jìn)境原木中截獲了維多利亞白條天牛(Batoceravictoriana)和婆羅白條天牛(Batoceratigris)。此外，2013年張家港口岸又從來自非洲的原木中截獲到一種白條天牛(Batocerawyllei)。同年，東莞口岸在菲律賓黃蕊木中截獲到另一種白條天牛(Batocerasp.(non-Chinese))。

截至目前，昆蟲種類鑒定主要以形態(tài)學(xué)鑒定為主，形態(tài)學(xué)鑒定往往要求蟲體完整無殘缺。而通?？诎秾?shí)際截獲到白條天牛的卵、幼蟲和蛹或是肢體殘破的成蟲，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法顯然并不適用[7]。因此，需要尋找新的方法來解決傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定中遇到的難題?；诰€粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因(mtDNA COI)的DNA條形碼技術(shù)是當(dāng)前比較成熟的分子鑒定技術(shù)[8]。Stauffer等[9]利用該技術(shù)，快速鑒定了歐洲7種齒小蠹。常虹等[10]應(yīng)用該技術(shù)對齒小蠹屬不同種類進(jìn)行高效鑒定?；ㄦ旱萚11]通過該技術(shù)對大小蠹屬17個(gè)種類進(jìn)行分類鑒定。

本研究對白條天牛屬下多個(gè)種類的COI片段進(jìn)行測序和對比，分析這些DNA條形碼序列特征以及相互間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，以找到一種能夠準(zhǔn)確高效鑒定白條天牛種類的分子方法，為研究天牛科其它天牛種類的分子鑒定方法提供參考[10]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

本實(shí)驗(yàn)所用的天牛標(biāo)本均由江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心提供，所有標(biāo)本均由國內(nèi)權(quán)威天牛專家安榆林研究員鑒定，包括10種白條天牛(表1)，其中8種COI序列為國內(nèi)外首次測得。此外，從GenBank網(wǎng)站上下載了3種白條天牛的COI序列用于對比(表2)。

1.2 提取樣品基因組DNA

利用GenMagBio動(dòng)物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA磁珠提取試劑盒(北京金麥格公司)提取上述樣品的基因組DNA。提取方法為先用雙蒸水沖洗干凈用酒精浸泡過的蟲體肌肉組織(少于30 mg)，然后裝入1.5 mL離心管并置于MM400球磨儀中震蕩研磨(30次·s-1)30 s，再將磨碎組織離心10 min(12000 r·min-1)后，加入180 mL裂解緩沖液和20 mL的Proteinase K，放入55 ℃ 水中溫浴10 min，以使樣品組織充分裂解。加200 mL無水酒精、200 mL的緩沖液和20 mL磁珠，磁珠用來吸附基因組DNA。加入500 mL Wash Buffer去雜后，再加上20 μL Elution Buffer洗脫磁珠即得到基因組 DNA 溶液[10，12]。

1.3 COI片段擴(kuò)增和測序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系，包含DNA模板1 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)2 μL，10×buffer 2.5 μL，d NTPs (2.5 mmol·L-1) 1 μL，rTaq DNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.4 μL(TaKaRa公司)，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL(南京金斯瑞合成)，再加滅菌水至總體積25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：94 ℃預(yù)變性持續(xù)5 min，94 ℃下變性持續(xù)40 s，55 ℃退火溫度保持30 s，72 ℃下延長至1 min，設(shè)置32次循環(huán)，最后一步72 ℃下再延伸10 min即可，最后將PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞公司測序[12-13]。本實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增采用巢氏PCR，第1輪PCR反應(yīng)引物為J171和J131，第2輪PCR引物為J178和N211[14](表3)。采用巢式PCR擴(kuò)增，既減少了擴(kuò)出非目的基因條帶的可能性，又增加了PCR檢測的靈敏性和準(zhǔn)確性[12，14]。

表1 標(biāo)本采集地和采集日期

表2 GenBank下載的COI基因序列信息

表3 所用引物序列

1.4 序列分析

將上述測得序列導(dǎo)入SeqMan分析軟件中[15]進(jìn)行拼接和校正，并使用NCBI的“BLAST”工具確認(rèn)序列的方向及可信度。然后將所測序列與GenBank上下載的白條天牛序列一同輸入Clustal X 1.83軟件[16]進(jìn)行對比，再將序列比對結(jié)果導(dǎo)入Mega 5.05[17]中，算出各白條天牛種類間的轉(zhuǎn)換和顛換及比值(R)、變異位點(diǎn)(V)和保守位點(diǎn)(C)等值[10，13]，最后利用Mega 5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA凝膠電泳結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)對12個(gè)(10種)白條天牛昆蟲樣本基因組DNA進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示12個(gè)樣品均在525 bp處有清晰明亮特異性好的條帶，可滿足后續(xù)的基因測序需要(圖1)。

2.2 白條天牛DNA條形碼分析

2.2.1 COI序列特征分析 將上述各條序列輸入Mega 5.05后，均切為同等長度片段(434 bp)[14]。結(jié)果顯示，共有保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、自裔位點(diǎn)、簡約信息位點(diǎn)各114、320、18、302個(gè)。此外，統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)的堿基平均含量發(fā)現(xiàn)，A為28.4%，C為16.4%，G為25.7%，T為29.5%[10，12-13]。其中，A與T含量接近，且A+T含量為57.9%，要高于G+C含量(42.1%)，這也與昆蟲線粒體基因各堿基組成規(guī)律相吻合[14，18]。

2.2.2 堿基替換規(guī)律 用Mega 5.05分析各位點(diǎn)的堿基替換規(guī)律[19]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位點(diǎn)轉(zhuǎn)換主要出現(xiàn)在A與G間，顛換主要出現(xiàn)在T與A間，R值為0.75。對密碼子各位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，在第3位點(diǎn)上容易發(fā)生轉(zhuǎn)換與顛換，而且轉(zhuǎn)換與顛換值比較接近(R=0.80)[10]。此外，第1、2位點(diǎn)的R值分別為0.66、0.80(表4)。

表4 核甘酸堿基替換值

2.2.3 遺傳距離 據(jù)Kimure 2-parameter模型計(jì)算13種白條天牛樣品遺傳距離，利用Bootstrap值(1000次)檢驗(yàn)[20]。結(jié)果顯示，相同物種內(nèi)的遺傳距離數(shù)值在0.000～0.049內(nèi)，其中B.lineolata距離最小，為0；B.horsfieldi距離最大，為0.049；而同一物種雌雄個(gè)體內(nèi)的遺傳距離則介于0.007～0.049之間，其中B.aeneonigra距離較小，為0.007；B.gerstaecheri距離較大，為0.026。不同種間的遺傳距離介于0.002～1.423之間，平均遺傳距離為0.733，其中B.gerstaecheri(m)與B.numitor之間遺傳距離最小，為0.002；B.gerstaecheri(fm)與B.lineolata之間遺傳距離最大，為1.423(表5)。此結(jié)果表明，白條天牛屬下同一物種及同物種雌雄個(gè)體之間遺傳距離稍小；而多數(shù)同屬不同種類的遺傳差距較大，呈現(xiàn)出了較為顯著的遺傳差異性。

表5 基于Kimure 2-parameter模型白條天牛屬種內(nèi)種間遺傳距離

*：1為B.rubus；2為B.aeneonigra(fm)；3為B.aeneonigra(m)；4為B.bruyni；5為B.celebiana；6為B.davidis；7為B.gerstaecheri(fm)；8為B.gerstaecheri(m)；9為B.gigas；10為B.magica；11為B.numitor；12為B.victoriana；13為B.wallacei；14為B.horsfieldi1；15為B.horsfieldi2；16為B.lineolata1；17為B.lineolata2。

2.2.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 利用MEGA 5.05軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明，B.aneonigra(fm)與B.aneonigra(m)聚為一支，說明B.aneonigra雌雄蟲個(gè)體之間的親緣關(guān)系最近，這也與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。B.aneonigra又與B.gerstaecheri(fm)、B.gerstaecheri(m)、B.victoriana、B.numitor、B.brutyni和B.magica聚在一起，說明它們之間的系統(tǒng)進(jìn)化距離較近。B.celebiana與B.gigas聚為同一小支后又與B.wallace聚為一支，說明此三者間的親緣關(guān)系較近。整體來看，上述9種(11頭)天牛又同聚為一大支，除B.numitor外，余下8種都屬于我國未有分布的白條天牛屬(非中國種)種類。此外，在我國已有分布的白條天牛屬4個(gè)種類的天牛(6頭)：B.rubus、B.horsfieldi、B.davidis和B.lineolata也聚為一大支，其中相同種類的白條天牛個(gè)體分別聚為一小支。上述結(jié)果表明，非中國種與多數(shù)中國種的白條天牛種類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且不同種類的白條天牛間遺傳差距較大，因此該段COI基因適合作DNA條形碼，用于上述白條天牛的分子鑒定。

3 小結(jié)與討論

近年來，DNA條形碼技術(shù)在昆蟲種類檢疫鑒定中得到越來越廣泛的運(yùn)用。其中，線粒體COI基因作為一種條形碼基因，其所含的遺傳信息既相對保守又有足夠的變異，已廣泛運(yùn)用于昆蟲種類鑒別[21]。例如，黃麗莉等[22]利用基于線粒體COI基因的DNA條形碼技術(shù)實(shí)現(xiàn)了6個(gè)不同地理種群的茶黃薊馬與其他4種常見薊馬的快速種類鑒定。肖永剛等[23]利用基于線粒體COI基因的DNA條形碼技術(shù)完成了17種菱蠟蟬亞科的昆蟲種類鑒定。另外，李京[24]通過研究天牛科66種天牛的線粒體基因序列特征，初步弄清楚了其各類群之間的親緣關(guān)系。鄭絲竹[25]對天?？?個(gè)亞科160種天牛進(jìn)行了基于COI基因序列的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，并據(jù)此初步建立天?？焖倏煽糠肿予b定技術(shù)體系。

近年來，我國口岸截獲的天?？评ハx多以卵、幼蟲及蛹蟲態(tài)和肢體殘缺成蟲形態(tài)出現(xiàn)，用傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法存在著極大的困難?；诰€粒體COI基因的DNA條形碼技術(shù)具有準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)，在昆蟲種類鑒定中得到越來越廣泛的應(yīng)用，很大程度上克服了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的缺陷[26]。但是目前該技術(shù)在白條天牛屬昆蟲種類鑒定中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。本研究通過將最新測序的10種白條天牛COI基因與GenBank下載的白條天牛COI基因序列進(jìn)行比對研究，證明了DNA條形碼技術(shù)適于白條天牛屬各種類的鑒定及部分非中國種與中國種類的區(qū)分鑒別。另外，本研究在國內(nèi)外首次對包括B.aneonigra，B.gerstaecheri等在內(nèi)的8種檢疫性白條天牛COI基因序列進(jìn)行測序，這不僅為白條天牛屬昆蟲DNA條形碼數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了有益的補(bǔ)充完善，也為下一步將DNA條形碼技術(shù)廣泛應(yīng)用于口岸檢疫性天牛的分子鑒定工作提供參考。

[1]劉瑩，熊賽，任杰群，等.中國白條天牛屬比較形態(tài)學(xué)研究(鞘翅目，天?？疲瑴厦勌炫喛?，白條天牛族)[J].動(dòng)物分類學(xué)報(bào)，2012，37(4)：701-711.

[2]陳乃中.中國進(jìn)境植物檢疫性有害生物：昆蟲卷[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009：186-194.

[3]劉瑩.中國白條天牛族分類及比較形態(tài)學(xué)研究[D].重慶：西南大學(xué)，2013：1-6.

[4]農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第862號)[EB/OL].[2011-12-06].http：//www.moa.gov.cn/sjzz/zzj/zcfgzzj·g-1fxwj/201112/t20111206_2424113.htm.

[5]張紅英，王學(xué)，王凱，等.馬來西亞原木上截獲的托氏白條天牛[J].植物檢疫，2009，23(3)：32-34.

[6]鄭慶偉.江蘇口岸在國內(nèi)首次截獲一種檢疫性白條天牛[J].農(nóng)藥市場信息，2012(29)：1-3.

[7]劉勇，宋毓，李曉宇.基于線粒體COI基因的DNA條形碼技術(shù)在昆蟲分子鑒定中的應(yīng)用[J].植物檢疫，2010(2)：46-47.

[8]Hebert P D，Cywinska A，Ball S L，et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proceedings of the Royal Society B：Biological Sciences，2003，270(1512)：313-321.

[9]Stauffer C.A molecular method for differentiating sibling species within the genus Ips[C]∥Gregoire JC，Liebhold AM，Stephen FM，et al.Integrating Cultural Tactics into the Management of Bark Beetle and Reforestation Pests.USDA Forest Service General Technical Report，NE-236，Radnor，PA.1997：87-91.

[10]常虹，郝德君，肖榮堂，等.基于線粒體COI基因的齒小蠹屬昆蟲DNA條形碼研究[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2012，55(9)：1075-1081.

[11]花婧，鄭斯竹，安榆林，等.基于線粒體COI基因的大小蠹屬昆蟲DNA條形碼研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(3)：30-32.

[12]常虹.口岸截獲小蠹科昆蟲DNA條形碼技術(shù)研究[D].南京：南京林業(yè)大學(xué)，2013：10-26.

[13]常虹，郝德君，肖榮堂，等.基于線粒體COI基因齒小蠹屬Ips昆蟲DNA條形碼研究[C]∥江蘇省昆蟲學(xué)會(huì)第十三次會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集.揚(yáng)州：2012：21-24.

[14]鄭斯竹，張凱，楊曉軍，等.墨天牛屬昆蟲COI基因比較及系統(tǒng)學(xué)初步研究[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，2015(2)：12.

[15]Parchman T L，Geist S K，Grahnen J A，et al.Transcriptome sequencing in an ecologically important tree species：assembly，annotation，and marker discovery[J].BMC Genomics，2010(11)：180.

[16]Chenna R，Sugawara H，Koike T，et al.Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs[J].Nucleic Acids Research，2003(31)：3497-3500.

[17]Kumar S，Nei M，Dudley J，et al.Mega：abiologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequence[J].Brief Bioinform，2008，9(4)：299-306.

[18]Liu H，Beckenbach A T.Evolution of the mitochondrial cytochromeoxidase gene among 10 orders of insects[J].Molecular Phylogenetics and Evolution，1992(1)：41-52.

[19]Tamura K，Peterson D，PetersonN，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular Biology and Evolution，2011，28(10)：2731-2739.

[20]Felsenstein J.Confidence limits on phylogenies：an approach using the bootstrap[J].Evolution，1985(39)：783-791.

[21]余道堅(jiān)，鄧中平，陳志舜，等.昆蟲分子標(biāo)記基因和序列及應(yīng)用[J].植物檢疫，2003，17(3)：156-159.

[22]黃麗莉，闕海勇，車飛.茶園茶黃薊馬及其近似種的DNA條形碼鑒定[J].植物檢疫，2014，28(6)：68-72.

[23]肖永剛，陳祥盛.基于線粒體COI基因的17種菱蠟蟬亞科DNA條形碼研究(半翅目：蠟蟬總科：菱蠟蟬科)[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2014，33(2)：44-50.

[24]李京.天?？凭€粒體基因特征與形態(tài)發(fā)育初步研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013：19-53.

[25]鄭絲竹.天牛科基因條形碼構(gòu)建及分子快速鑒定技術(shù)研究[D].南京：南京林業(yè)大學(xué)，2012：35-84.

[26]彭居俐，王緒楨，何舜平.DNA條形碼技術(shù)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].水生生物學(xué)報(bào)，2008，32(6)：916-919.

Establishment of DNA Barcode of Species ofBatocera(Coleoptera：Cerambycidae)

YU Hai-xin1，XU Mei2，XU Ning1，SUN Ming-qin1，AN Yu-lin2

(1.NantongEntry-ExitInspectionandQuatantineBureau，Nantong226004，Jiangsu，China；2.JiangsuEntry-ExitInspectionandQuatantineBureau，Nanjing210009，Jiangsu，China)

Species of the genusBatocera(Coleoptera：Cerambycidae) are often intercepted and captured in quarantine at port.To explore the feasibility of identifyingBatoceraspecies rapidly andaccurately by DNA barcode of special sequence in mitochondrial cytochrome c coxidase subunit I (mtDNA COI)，we attempted to apply this technology to identify 13Batoceraspecies at home and abroad.The COI sequences of 13 species were sequenced (including 10 species were sequenced in the world for the first time)and compared.The phylogenetic tree was established by MEGA 5.05.The results indicated thatBatoceraspecies can be identified rapidly and accurately through DNA barcode based on mtDNA COI gene.

Batocera；mtDNA COI gene；DNA barcoding；identification

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.02.017

2015-08-27；

2015-10-10

江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014KJ48)

禹海鑫(1984—)，男，河南泌陽人，南通出入境檢驗(yàn)檢疫局農(nóng)藝師，博士，從事昆蟲分子及形態(tài)鑒定研究。E-mail：haixin.007@163.com。

S763

A

1002-7351(2016)02-0090-05