黃　倩，葉聰瑩，劉小川,b

(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.生物工程研究所，杭州 310018)

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薏苡胚油脂分子標(biāo)記鑒定及遺傳多樣性分析

黃倩a，葉聰瑩a，劉小川a,b

(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.生物工程研究所，杭州 310018)

薏苡被譽為“世界禾本科之王”。它作為藥食兩用植物，特別以薏苡中性油脂為主要有效成分，用于輔助抗癌的藥物，已在美FDA獲準(zhǔn)Ⅲ期臨床。利用34個多態(tài)性豐富的RAPD分子標(biāo)記，分析了23份不同地理來源的薏苡種質(zhì)的遺傳多樣性，結(jié)果獲得405個多態(tài)性片段，通過UPGMA聚類分析法，23份供試薏苡資源被分為5種類型，分類結(jié)果與地理來源和種質(zhì)系譜一致。薏苡胚油脂分子標(biāo)記鑒定中，胚油脂含量檢測發(fā)現(xiàn)23份種質(zhì)平均值僅為3.47%，但LG013中卻高達8.99%，同時，發(fā)現(xiàn)長度約為1050 bp的片段為LG013的特有條帶。經(jīng)克隆和特異引物的鑒定，結(jié)果顯示在600 bp處LG013擁有特異性代表條帶，可作為該品種鑒定和知識產(chǎn)權(quán)保護的重要依據(jù)。

薏苡；胚油脂；分子標(biāo)記；RAPD；遺傳多樣性

0　引　言

薏苡(Coixlacryma-jobiL.)別名水玉米(東北)，草珠子(山東)，晚念珠(福建)等[1]，為一年生或多年生C4草本植物[2]。作為世界上最受青睞的藥、食同源植物之一，薏苡被譽為 “世界禾本科之王”，歐洲人甚至將薏苡視為“生命健康之禾”。它的營養(yǎng)價值很高，薏苡中含有豐富的蛋白質(zhì)，含量約為14.26%；脂肪含量約為5.56%，所含的脂肪中，多為油酸、亞油酸這些對人體有益的不飽和脂肪酸；纖維含量約為0.44%；同時含有鋅、鈉、鐵、鈣、鎂、銅、錳、鍶等8種微量元素，鋅含量為43.24 μg/g，鈉含量為118.64 μg/g，鐵含量為212.90 μg/g，鈣含量為749.00 μg/g，鎂含量為1193.60 μg/g，銅含量為11.70 μg/g，錳含量為36.06 μg/g，鍶含量為0.64 μg/g；薏苡仁中含有約為0.2%的中性油脂，中性油脂證實具有抗癌功效[3-4]。

薏苡具有很高的藥用價值，它作為藥材，在很早以前就已被我們的祖先廣泛使用，我國就將薏苡作為治療肥胖[5]、腸炎[6]、小兒厭食癥[7]、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[8]、濕疹、扁平疣、坐骨神經(jīng)痛、傳染性軟疣、尖銳濕疣、慢性闌尾炎等疾病的藥物[5-11]。在薏苡眾多的藥用價值中，最引人注目的是薏苡仁中性油脂防、治癌癥[9-10]這一藥用價值。早在1961年之際，當(dāng)時的研究工作者就從薏苡中提出來了薏苡仁酯，即薏苡仁中性油脂，后發(fā)現(xiàn)薏苡仁中性油脂有抑制癌細胞增殖和擴散[11]，促進癌細胞凋亡[12]的功效。這個已經(jīng)在人喉癌細胞Hep-2細胞凋亡實驗[13]和人鼻咽癌細胞凋亡[14]實研究中得到了證實。

2015年，以薏苡中性油脂為主要成分的“康萊特注射液”特效抗癌藥，首次通過美國FDA認證，進入Ⅲ期臨床階段，是目前唯一一個在美國得到FDA認可的中草藥。目前薏苡胚油脂含量檢測異常困難，NCBI數(shù)據(jù)庫也缺乏薏苡這一小物種基因序列信息，國內(nèi)沒有人做薏苡胚油脂相關(guān)方面工作。本研究主要目的，是通過RAPD分子標(biāo)記分析所收集的23種(LG001～LG023)薏苡種質(zhì)的遺傳多樣性，并嘗試對薏苡胚油脂性狀進行分子標(biāo)記鑒定，為薏苡油脂含量種質(zhì)資源改良及分子育種研究奠定基礎(chǔ)。

1　實驗部分

1.1材料

供試材料為23份不同地理來源的薏苡種質(zhì)材料，由浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所收集(表1)。

表1　供試薏苡的編號及粒色

1.2方法

1.2.1薏苡胚油脂含量的計算

根據(jù)胚壓前質(zhì)量、胚壓后質(zhì)量、種粒重可計算得到23份薏苡胚油脂含量I：

胚油脂含量I=

(1)

其中：胚壓前質(zhì)量(g)測量是以小刀輕柔刮取薏苡胚(盡量刮干凈)后稱重；胚壓后質(zhì)量(g)測量是用力擠壓兩塊透明板(中間墊有3層濾紙，薏苡胚置上)后，種粒重(g)測量直接稱重得出。

1.2.2DNA的提取

各供試材料取30粒，經(jīng)45 d萌發(fā)、成小苗至10 cm左右，各稱取2.0 g鮮嫩的薏苡葉片用液氮研磨，采用改良的CTAB法[15]提取DNA。用65℃提前預(yù)熱的CTAB液裂解細胞(NaCl使用濃度700 mM)，氯仿異戊醇抽提(取上清)，經(jīng)RNA酶消化，-20℃預(yù)冷異丙醇沉淀DNA(放冰上沉淀20 min)，70%乙醇洗滌后，用ddH2O溶解。所有DNA樣本經(jīng)Nano Drop2000測定濃度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組質(zhì)量合格后，用ddH2O稀釋到10 ng/μL，-20 ℃保存、備用。

1.2.3RAPD擴增、電泳及EB染色

RAPD引物：薏苡作為小作物，在NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有薏苡基因組的任何信息[16]，從玉米、小麥、水稻等(薏苡與它們親緣關(guān)系近，同為禾本科)近源種的256個RAPD引物中共篩選出34個擴增條帶清晰、穩(wěn)定的RAPD引物，由上海生工合成(表2)。

表2　RAPD引物序列信息

PCR反應(yīng)體系：使用BIO-RAD S1000TMThermal擴增儀，10 μL反應(yīng)體系：30 ng DNA模板，1.0 μL 10×Taq Buffer(Takara，Dalian，China)，0.8 μL dNTP 2.5 mM(Takara，Dalian，China)，0.4 μL Mg2+25 mM(Takara，Dalian，China)，0.1 μL RAPD primer 20 uM(Sangon，Shanghai，China)，0.1 μL rTaq enzyme 5 U/μL(Takara，Dalian，China)，補ddH2O至10 μL。PCR反應(yīng)程序：(94℃，3 min)預(yù)變性，[(94℃，30 s)變性；(t℃，45 s)退火，具體t℃參考表2，RAPD引物TM值；(72℃，2 min)延伸]34個循環(huán)，繼續(xù)延伸(72℃，10 min)，4℃，保存。電泳及EB染色：經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，15 min EB染色、漂洗后，紫外燈下觀察實驗結(jié)果并保存圖片，記錄相關(guān)信息。

1.2.4RAPD聚類分析

RAPD聚類分析是以23份供試薏苡RAPD標(biāo)記結(jié)果圖為依據(jù)，統(tǒng)計結(jié)果圖中所有擴增條帶，并以此建立Microsoft Excel數(shù)據(jù)庫，若有條帶記為1，沒有條帶則記為0。按UPGMA聚類分析法，Ntedit錄入數(shù)據(jù)，NTSYS-pc2.10e聚類分析軟件分析數(shù)據(jù)，獲得系統(tǒng)聚類圖。

1.2.5克隆、引物設(shè)計及鑒定

克?。簩⒅亟M載體(1050 bp目的片段DNA/載體PMD-18T)導(dǎo)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中表達；在LB固體板(含100 μg/ml Amp)上挑選陽性單克隆菌落；經(jīng)菌液PCR(M13+/M13-引物)檢測合格后，送上海生工測序。根據(jù)測序結(jié)果，使用Primer5.0軟件，設(shè)計引物F：TCTGGTGAGG GGAGTCACA，R：TCTGGTGAGGCATGGTGT。采用TD PCR程序?qū)曹优哂椭繕?biāo)記進行鑒定。

2　結(jié)果與分析

2.1薏苡胚油脂含量分析

薏苡胚油脂含量的檢測常使用HPLC法、紫外光譜法、層析法，這些方法雖有效但操作起來非常復(fù)雜，目前仍缺乏便捷、有效的檢測薏苡胚油脂含量的手段。利用物理壓榨法(1.2.1)，通過公式(1)計算可得到23份供試薏苡胚油脂含量百分比(%)具簡單、有效的特點。表3可知，23份供試薏苡資源的胚油脂含量在1.728%～8.994%之間，LG013是這23份供試薏苡中胚油脂含量最高的品種，高達8.994%，23個種質(zhì)資源的平均值僅為3.47%。其中，LG013、LG010、LG001、LG023、LG005、LG015、LG007、LG017、LG006這9個供試薏苡資源胚油脂含量明顯高于平均值3.47%，可能與薏苡種質(zhì)、地理來源有關(guān)。23份供試薏苡的胚油脂含量的檢測結(jié)果為薏苡胚油脂含量種質(zhì)資源的相關(guān)研究，尋找優(yōu)良的薏苡種質(zhì)品種奠定基礎(chǔ)。

表3　供試薏苡胚油脂含量百分比

2.2RAPD標(biāo)記分析

薏苡作為小作物，在NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有薏苡基因組的任何信息，從玉米、小麥、水稻等(薏苡與它們親緣關(guān)系近，同為禾本科)近源種的256個RAPD引物中共篩選出34個擴增條帶清晰、穩(wěn)定的RAPD引物進行RAPD分析。利用34個多態(tài)性豐富的RAPD分子標(biāo)記，結(jié)果共獲得405個多態(tài)性片段，平均每個RAPD分子標(biāo)記擴增得到11個多態(tài)性片段。其中，在S44引物的體外擴增結(jié)果中，如圖1所示，發(fā)現(xiàn)第400個多態(tài)性片段，分子量約為1050 bp，LG013(23個供試薏苡胚油脂含量最高，達8.99%)在此處有特異條帶，其它22份薏苡此處均沒有任何條帶。使用割膠回收試劑盒Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Cat#9762)將此帶割膠回收，并克隆、測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計引物F：TCTGGTGAGGGGAGTCACA，R：TCTGGTGAGGCATGGTGT用來作為鑒定薏苡胚油脂性狀分子標(biāo)記。

圖1　S44引物對23份供試薏苡標(biāo)記結(jié)果

2.3種質(zhì)間聚類分析

RAPD標(biāo)記聚類結(jié)果圖中，RAPD遺傳相似系數(shù)，其變幅為0.55～0.96。其中LG019/LG020薏苡品種的相似系數(shù)最高，達到0.96。采用UPGMA(Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Means)聚類分析法，以0.75遺傳相似系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)將23種供試薏苡資源劃分為5大類(表4)：第I類包括LG012(黃白色)、LG004(棕色)；第II類包括LG013(黃白色)、LG015(黑褐色)、LG023(黃白色)、LG007(黑褐色)、LG009(黃白色)、LG014(黃白色)、LG002(黃白色)、LG022(黃白色)、LG005(黑褐色)、LG003(黃白色)、LG016(深棕色)、LG011(深棕色)；第III類包括LG021(棕色)、LG008(灰色)；第Ⅳ類包括LG017(黃白色)、LG018(黑褐色)、LG001(深棕色)；第Ⅴ類包括LG019(黃白色)、LG020(棕色)、LG006(深棕色)、LG010(黃白色)。LG013是23種薏苡胚油脂含量最高的品種，高達8.99%，屬于第II類。從圖2和表4可看出，第Ⅰ類和第Ⅳ類遺傳距離較近，第Ⅱ類和Ⅴ類遺傳距離較近，第Ⅲ類遺傳距離呈現(xiàn)多樣化，這一分類結(jié)果與種質(zhì)系譜和地理來源一致。(圖2、表4)

圖2　RAPD標(biāo)記聚類結(jié)果

類群編號種質(zhì)ILG012、LG004ⅡLG013、LG015、LG023、LG007、LG009、LG014、LG002、LG022、LG005、LG003、LG016、LG011ⅢLG021、LG008ⅣLG017、LG018、LG001ⅤLG019、LG020、LG006、LG010

2.4分子標(biāo)記鑒定結(jié)果分析

利用上下游引物F/R(F：TCTGGTGAGG GGAGTCACA，R：TCTGGTGAGGCATGGTG)，使用Touchdown PCR對薏苡胚油脂含量性狀的分子標(biāo)記進行鑒定，結(jié)果表明LG013有600 bp特異性條帶，其它22份薏苡此處均沒有條帶(圖3)。這可能與胚油脂含量密切相關(guān)，并可作為該品種特異性條帶， F/R可用于該品種鑒定、專利申請和高含量胚油脂性狀的分子鑒定。

圖3　F/R引物鑒定23份供試薏苡結(jié)果

3　結(jié)　論

本研究利用34個RAPD引物，對23份供試薏苡種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，采用UPGMA聚類分析法，以0.75遺傳相似系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)將23種供試薏苡資源劃分為5大類，這個結(jié)果與23份薏苡地理來源、種質(zhì)系譜相一致，為薏苡種質(zhì)資源相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。LG013胚油脂含量高達8.99%，為23份供試薏苡胚油脂含量最高的品種(平均值僅為3.47%)且分子鑒定結(jié)果表明LG013有600 bp特異性條帶，可用于該品種鑒定、專利申請和高含量胚油脂性狀的分子鑒定。相關(guān)薏苡胚油脂性狀的分子鑒定仍需要F2代薏苡群體的進一步鑒定，才能真正確定F/R引物作為相關(guān)薏苡胚油脂性狀的分子鑒定。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Identification of Embryo Oil Molecular Marker and Genetic Diversity Analysis of Coix

HUANGQiana，YECongyinga，LIUXiaochuana,b

(a. Institute of Bioengineering; b.College of life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China)

Job’s-tears, which are the honored as the “king of grass family of the world”, can be used as medical and edible plants. Especially, the neutral grease, major effective component in coix, can be used as auxiliary anticancer medicine and has been approved for phase-III clinic by FDA of America. Here, this paper analyzed the genetic diversity of 23 coix germplasms from varied geographic sources by using 34 RAPD molecular markers with rich polymorphism and obtained 405 polymorphic segments; according to the UPGMA clustering methodology, 23 coix sources for experiment were divided into 5 categories and the classification result was consistent with the geographic sources and germplasm genealogy. According to the identification the coix embryo grease molecular marker, it is found in the detection of embryo grease content that the average of 23 germplasms is merely 3.47% but the embryo grease content in LG013 reaches up to 8.99%; meanwhile, the fragment with a length of about 1050 bp is the excusive strip of LG013. After identification of clone and specific primer, the result shows that LG013 has a specific representative strip in 600 bp and this can be used as an important basis for the variety identification and intellectual property protection.

coix; embryo grease; molecular marker ; RAPD; genetic diversity

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.05.023

2015-12-07

黃倩(1990-)，女，湖北武漢，碩士研究生，主要從事分子遺傳育種方面的研究。

劉小川，E-mail: xcliu@zstu.edu.cn

Q321

A

1673- 3851 (2016) 03- 0458- 05 引用頁碼： 050705