田淑芬，路鳳珍，2，溫曉敏，2，張娜，陳三春，2（. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室，天津 30092；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

外源添加物對無核葡萄胚挽救及胚珠發(fā)育的影響

田淑芬1，路鳳珍1，2，溫曉敏1，2，張娜1，陳三春1，2
（1. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室，天津 300192；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

為了研究部分外源添加物對無核葡萄胚珠發(fā)育及胚培養(yǎng)的影響，以紅寶石無核×玫瑰香優(yōu)系、希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系雜交胚為試材，研究了6-BA不同處理濃度、不同甘氨酸濃度和不同活性炭用量對胚珠生長發(fā)育的影響。結(jié)果表明，0.5 mg/L 6-BA濃度處理的紅寶石無核×玫瑰香優(yōu)系胚發(fā)育率最高，為15.89%；紅寶石無核×玫瑰香優(yōu)系最適甘氨酸濃度為4.00 mmol/L，胚發(fā)育率13.33%，1.00 mmol/L甘氨酸濃度處理對希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系雜交胚發(fā)育率最高，為17.33%；兩組合最適活性炭濃度為1.0 g/L。

無核葡萄；6-BA；甘氨酸；活性炭；胚挽救

近年來，世界鮮食葡萄育種目標(biāo)趨于大粒、無核、優(yōu)質(zhì)、香氣、抗病。無核葡萄以其食用方便，且在鮮食和制干方面有獨特優(yōu)勢，一直以來備受消費者的喜愛。無核品種的主要育種方法為有性雜交育種，傳統(tǒng)雜交育種只能以有核品種為母本無核品種為父本，后代無核率低且選育一個無核品種所需的時間較長（10～20年），隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過胚挽救技術(shù)獲得無核葡萄新品種的方法被眾多育種者［1-6］所采用。胚挽救及輔助育種技術(shù)的廣泛應(yīng)用，大大加快了培育優(yōu)質(zhì)無核葡萄的育種進度。在無核葡萄胚挽救中，胚珠發(fā)育培養(yǎng)基組分是影響胚挽救效率的關(guān)鍵因素，唐冬梅等［7］研究發(fā)現(xiàn)，在Nitsch基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加6-BA能顯著提高雜交胚的萌發(fā)率。陶建敏等［8］利用5 mg/L與10 mg/L兩個濃度的6-BA，在花前兩周對火星無核進行處理，得到的有胚種子率大于60%。郭修武等［9］在MS、ER、改良Nitsch、White培養(yǎng)基中分別添加6-BA均能提高胚挽救效率。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上探索細胞分裂素6-BA濃度、不同甘氨酸濃度和不同活性炭濃度對紅寶石無核×玫瑰香優(yōu)系、希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系2個雜交組合胚珠生長發(fā)育的影響，旨在確定適宜無核葡萄紅寶石無核和希姆勞特為母本的胚挽救幼胚離體培養(yǎng)體系。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗于2015年5月至2016年5月在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心武清試驗基地、天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點實驗室進行。供試母本為紅寶石無核和希姆勞特，其中紅寶石無核是從皇帝×Pirovan075雜交后代選育出的晚熟無核品種。供試父本為玫瑰香優(yōu)系，是由天津農(nóng)科院葡萄研究中心采用生物分子標(biāo)記技術(shù)與田間營養(yǎng)系混合選種方法相結(jié)合對茶淀玫瑰香葡萄提純復(fù)壯，篩選出的玫瑰香優(yōu)系葡萄。親本特性見表1。

表1　 雜交親本特性

1.2試驗方法

1.2.1田間雜交及幼果采集

紅寶石無核×玫瑰香優(yōu)系、希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系雜交組合參照王愛玲等［10］的方法進行。

上述兩組合分別在授粉后29 d、25 d開始取樣。將采集的幼果帶回實驗室，剪去果柄，用自來水沖洗干凈后放入超凈工作臺消毒：先用70%酒精沖洗一次，用無菌水沖洗3次，放入次氯酸鈉中浸泡3 min，再用無菌水沖洗3次。用解剖刀切開漿果，取出胚珠，將其接種到發(fā)育培養(yǎng)基中進行胚珠發(fā)育培養(yǎng)。

1.2.2試驗處理

試驗選取兩組合的雜交胚珠為試材，每個處理重復(fù)3次。接種30 d后調(diào)查胚珠發(fā)育率，然后進行剝胚處理，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計胚萌發(fā)率。

胚珠發(fā)育培養(yǎng)基：Nitsch+1.5 mol/L IAA+0.5 mol/L GA3+60 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂。

（1）胚珠發(fā)育基中添加不同濃度6-BA。以紅寶石無核×玫瑰香優(yōu)系雜交胚珠為試驗材料，發(fā)育培養(yǎng)基分別添加0.2 mg/L、0.5 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L濃度的6-BA，空白試驗為CK。

（2）不同甘氨酸濃度。以紅寶石無核×玫瑰香優(yōu)系、希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系雜交胚珠為試材，在胚珠發(fā)育階段，甘氨酸濃度設(shè)定為：1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0mmol/L、6.0 mmol/L和CK共5個處理。

（3）不同活性炭濃度。以參試兩組合的雜交胚珠為試材，在發(fā)育基本培養(yǎng)基上，分別添加0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L濃度的活性炭。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2016對數(shù)據(jù)進行處理，SPSS 17.0軟件進行方差分析（P＜0.05）。

胚發(fā)育率/%=（發(fā)育胚數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度6-BA對雜交胚珠發(fā)育率的影響

在發(fā)育培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA，對紅寶石無核×玫瑰香優(yōu)系胚珠發(fā)育率的影響不同（表2）。添加6-BA試驗組的發(fā)育率均高于對照組，說明6-BA對胚珠發(fā)育具有促進作用。如表2所示，添加0.5 mg/L 6-BA的胚發(fā)育率可達到15.89%，顯著高于其他試驗組，說明在發(fā)育培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加0.5 mg/L 6-BA適用于紅寶石無核×玫瑰香優(yōu)系的胚珠發(fā)育。

2.2不同甘氨酸濃度對雜交胚珠發(fā)育率的影響

添加不同濃度甘氨酸的胚發(fā)育培養(yǎng)基，對量組合胚挽救效率的影響不同（表3）。結(jié)果表明：添加甘氨酸能顯著提高胚珠發(fā)育率，紅寶石無核×玫瑰香優(yōu)系在4.00 mmol/L水平上，胚的發(fā)育率可達13.33%，顯著高于其他處理組。希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系在1.00 mmol/L、2.00 mmol/L水平上胚的發(fā)育率顯著，分別為17.27%、17.33%。說明添加甘氨酸能顯著提高胚珠發(fā)育率，不同雜交組合適宜的甘氨酸濃度不同。

表2　6-BA對紅寶石無核×玫瑰香雜交胚珠發(fā)育率的影響

表3　不同甘氨酸濃度對雜交胚珠發(fā)育率的影響

2.3不同活性炭濃度對胚珠發(fā)育生長的影響

不同濃度的活性炭處理對胚珠發(fā)育的影響不同（表4）。結(jié)果表明：添加活性炭可以顯著提高胚的發(fā)育率，不添加的僅為5.56%。添加活性炭的最佳濃度為1.0 g/L，兩組合雜種胚珠的發(fā)育率均最高，分別為17.33%、15.69%，這說明添加1.0 g/L活性炭對胚的生長發(fā)育有明顯促進作用。

表4　不同活性炭濃度對胚珠發(fā)育生長的影響

3　討論與結(jié)論

適宜的外源激素的種類及適當(dāng)?shù)呐浔葘ε咧楹团叩呐囵B(yǎng)效果有著重要影響。對激素的敏感程度會隨著葡萄的品種變化和胚的發(fā)育程度的變化而呈現(xiàn)顯著差異。多數(shù)學(xué)者認為，培養(yǎng)基中附加合適的外源激素對胚的發(fā)育有促進作用。唐冬梅［11］的研究認為添加0.2 mg/L 6-BA比不加6-BA的無核葡萄胚挽救成功率高，郭印山等［12-13］認為，幼胚的發(fā)育可能需要相對較低濃度的6-BA，采用White培養(yǎng)基+2.0 mg/L IBA+0.9 mg/L 6-BA+0.7 mg/L GA3培養(yǎng)87-1×京秀，成苗率高達95.08%。劉佳［14］研究表明，金星無核葡萄胚發(fā)育階段適宜的6-BA濃度是1.0 mg/L。劉巧等［15］研究不同6-BA濃度對抗寒無核葡萄的影響，認為添加低濃度水平的6-BA有助于促進胚發(fā)育、萌發(fā)和成苗，且不同雜交組合對6-BA的敏感程度不同。本試驗的研究結(jié)果表明，紅寶石無核×玫瑰香優(yōu)系最適6-BA濃度為0.5mg/L，胚發(fā)育率可達到15.89%，顯著高于其他試驗組。

氨基酸是胚形成和發(fā)育必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)。不同種類的氨基酸對胚發(fā)育的影響不同，一般認為，半胱氨酸（Cys）、絲氨酸（Ser）、谷氨酞胺（Gln）、天冬酞胺（Asn）、甘氨酸（Gly）能夠促進葡萄胚珠內(nèi)胚的發(fā)育。10 mmol/L甘氨酸有利于幼胚的發(fā)育和成苗［16］，田莉莉［17］研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酸對底來特×北醇和愛莫無核×北醇胚發(fā)育和成苗都有促進作用。本研究結(jié)果表明，雜交組合不同，最佳甘氨酸濃度也不相同，紅寶石無核×玫瑰香優(yōu)系最適濃度為4.00 mmol/L，胚發(fā)育率13.33%，1.00 mmol/L甘氨酸濃度處理對希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系雜交胚發(fā)育率最高，為17.33%，2.00 mmol/L水平上胚發(fā)育率次之。

活性炭可通過吸附發(fā)生作用，對大多植物的幼胚培養(yǎng)都有明顯的促進作用［18］。胚珠中含有酚類物質(zhì)，在培養(yǎng)過程中易發(fā)生氧化作用而導(dǎo)致胚珠褐化。在培養(yǎng)基中加入一定量的活性炭可吸附有害物質(zhì)，防止胚珠褐化［19］，但是活性炭的吸附作用屬非選擇性吸附，其在吸附有害物質(zhì)的同時也會吸附營養(yǎng)物質(zhì)，所以需要控制活性炭的濃度。田莉莉［17］研究發(fā)現(xiàn)，添加1.5 g/L的活性炭，有利于提高胚的發(fā)育率和成苗率。夏培培等［20］研究了活性炭對木納格葡萄胚挽救的影響，結(jié)果表明，隨著活性炭濃度的增加，胚萌發(fā)率為先增后減趨勢，濃度為0.5 g/L時，萌發(fā)率達到最高。在本試驗中添加適宜濃度的活性炭（1.0 g/L）可以顯著提高胚的發(fā)育率，濃度過高會吸附營養(yǎng)物質(zhì)，胚發(fā)育率降低。

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Effect of exogenous additives on embryo rescue and development of ovules of seedless grape

TIAN Shufen1，LU Fengzhen1，2，WEN Xiaomin1，2，ZHANG Na1，CHEN Sanchun1，2
（1. Grape Research Center， Tianjin Academy of Agricultural Sciences/Tianjin enterprise Key Laboratory of grape genetics and breeding， Tianjin 300192， China； 2. College of life science， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China）

The young ovules from Ruby Seedless×Muscat Hamburg， Himrod×Muscat Hamburg were taken as experimental materials， to investigate the effects of exogenous additives （6-BA， glycine and activated carbon）on ovule and embryo development of seedless grape. The results showed that the concentration of 0.5 mg/L 6-BA treatment gained the highest embryo development rate from Ruby Seedless×Muscat Hamburg， which was 15.89%；4.00 mmol/L glycine was the optimum concentrations for Ruby Seedless×Muscat Hamburg and 1.00 mmol/L glycine concentration was the best for Himrod ×Muscat Hamburg， the embryo development rate were 13.33% and 17.33%， respectively. The optimum concentration of activated carbon was 1.0 g/L for two combinations.

seedless grapes； 6-BA； glycine； activated carbon； embryo rescue

S663.1

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2016.05.006

2016-08-02

天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金（15010）

田淑芬（1966-），女，博士，研究員，主要從事葡萄栽培與選育種方面的研究。E-mail： tianshufen@263.net