蔗渣纖維素分解菌的篩選、鑒定及酶活的測定

黃惠娟，方界群，陳華文，陳迪文，黃 瑩，黃振瑞，江 永*

（1廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510316；2廣東省遂溪縣農(nóng)業(yè)局，廣東遂溪524300）

蔗渣纖維素分解菌的篩選、鑒定及酶活的測定

黃惠娟1，方界群1，陳華文2，陳迪文1，黃 瑩1，黃振瑞1，江 永1*

（1廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510316；2廣東省遂溪縣農(nóng)業(yè)局，廣東遂溪524300）

為充分利用蔗渣，篩選高效降解蔗渣的菌株，本文從堆肥中分離得到有顯著透明圈、可產(chǎn)纖維素酶的真菌8株，選其中3株測定了羧甲基纖維素酶（CMCase）和濾紙酶（FPA）活性。結(jié)果表明，菌株SC8的透明圈直徑、CMCase和 FPA活性均最大。經(jīng)菌落形態(tài)特征分析，初步鑒定菌株 SC8屬于曲霉屬（Aspergillus）。相關(guān)性分析表明，所篩選菌株在纖維素透明圈直徑的大小與CMCase、FPA酶活性成極顯著正相關(guān)（p＜0.01）。

蔗渣；纖維素分解菌；纖維素酶；濾紙酶活

0　前言

蔗渣是制糖工業(yè)的主要副產(chǎn)品，是一種重要的可再生生物質(zhì)資源。中國是僅次于巴西和印度的第3大甘蔗種植大國，南方蔗區(qū)甘蔗總產(chǎn)量7000多萬t，蔗渣的產(chǎn)量達(dá)到700萬t［1］。蔗渣的成分以纖維素，半纖維素以及木質(zhì)素為主，蛋白質(zhì)、淀粉和可溶性糖含量較少。由于蔗渣的木質(zhì)化程度高、蔗莖表皮存在硅化細(xì)胞，養(yǎng)分不協(xié)調(diào)以及轉(zhuǎn)化利用技術(shù)手段落后等原因，目前蔗渣多數(shù)被糖廠作為燃料提供鍋爐熱能，部分用于造紙和纖維板等，但其利用率和附加值低，不僅造成了資源的浪費(fèi)，而且還帶來了環(huán)境的污染。另外，甘蔗人工收獲后蔗葉大部分被廢棄于蔗田，干燥后大部分被農(nóng)民焚燒（如不燒掉將影響下一季的生產(chǎn)管理），不僅浪費(fèi)資源而且嚴(yán)重污染環(huán)境，如能通過技術(shù)手段使得在下一季甘蔗生產(chǎn)管理時蔗葉已經(jīng)腐化，那么可以避免蔗葉被焚燒，而且蔗葉腐爛后能提高蔗田土壤有機(jī)質(zhì)，改善土壤理化性質(zhì)，提高土地生產(chǎn)力。雖然正在推廣的甘蔗機(jī)械化收獲能將蔗葉切斷粉碎后回田，但蔗葉的纖維含量高，自然腐爛時間周期長，急需技術(shù)手段加速其腐化速度，從而為加快蔗葉回田推廣速度奠定基礎(chǔ)。

纖維素分解菌含有纖維素酶，可將蔗渣等纖維素分解為糖類，具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前得到的纖維素酶，無論是來自動物、植物還是微生物，還不能滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需要［2］。纖維素酶活力較低，生產(chǎn)周期長，纖維素酶復(fù)合物的分子量十分龐大，單個酶組分沒有水解纖維素的能力，菌株的纖維素酶活力仍然較低，這些原因一直是阻礙纖維素酶大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的瓶頸問題［3］。因此，篩選分離得到理想的蔗渣纖維素分解菌，對于提高蔗渣養(yǎng)分資源循環(huán)高值化利用和解決環(huán)境污染問題具有重要意義。本研究綜合利用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）透明圈測定法和胞外酶活測定法，針對蔗渣纖維素降解問題，進(jìn)行了纖維素分解菌的篩選和鑒定，并測定了其部分酶活力。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1纖維素分解菌分離樣品

以蔗渣與雞糞等自然堆肥材料為分離樣品，當(dāng)堆體溫度上升到45℃時，采集中層樣品于無菌器皿中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） 2 g、（NH4）2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41 g、NaCl 0.5 g，蒸餾水1000 mL。制成固體平板培養(yǎng)基時加入瓊脂20 g。

1.1.3試劑

0.05mol/L pH 4.8醋酸鈉緩沖液；0.025 mol/L CMC-HAc緩沖液；DNS試劑（酒石酸甲鈉22.75 g，3，5-二硝基水楊酸0.7875 g，氫氧化鈉5 g，結(jié)晶酚0.625 g，無水硫酸鈉0.625 g，攪拌溶解，冷卻后定容至250 mL）；0.1％葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2方法

1.2.1蔗渣纖維素分解菌的篩選、純化及纖維素水解透明圈的測定

稱取新鮮蔗渣堆肥物料20 g，放入盛有200 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振蕩20 min。靜置后吸取上層清液稀釋成 10-1、10-2、10-3和10-4倍的菌液，各取200 μL分別涂布到羧甲基纖維素鈉平板培養(yǎng)基上進(jìn)行初篩分離，平板置于45℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待形成單菌落，分別挑取單菌落進(jìn)行劃線分離。將分離出的菌株點(diǎn)種到羧甲基纖維素鈉平板培養(yǎng)基上，45℃培養(yǎng)3天。用1 g/L的剛果紅染色10 min，再用1 mol/L NaCl沖洗，測量透明圈的直徑。

1.2.2菌株復(fù)篩和粗酶液的提取

參照包衎等方法［4］，略有修改。取粗篩菌種在羧甲基纖維素培養(yǎng)基試管斜面上45℃活化3天。將5 mL無菌水滴加到試管斜面中。振蕩，制備成菌懸液。吸取菌懸液1 mL接入25 mL CMC液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，45℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)4天，所得發(fā)酵液經(jīng)4℃、5000 r/min離心30 min，收集上清液作為粗酶液用于酶活力的測定。

1.2.3酶活測定

1.2.3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取 0.1％標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液分別制成 0.01％、0.02％、0.04％、0.06％和 0.08％的葡萄糖溶液。與DNS沸水浴5 min后取出冷卻，加蒸餾水定容至6 mL混勻，以蒸餾水作為空白對照，測定各試管內(nèi)的OD540值，以不同濃度的葡萄糖溶液作為橫坐標(biāo)，OD540值作為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2羧甲基纖維素酶（CMCase）活力的測定

采用DNS法［5］，取0.5 mL上述粗酶液加入試管中，加入2 mL 0.025 mol/L CMC-HAc緩沖液，在45℃下酶反應(yīng)30 min。試管中加入2.5 mL 3，5-二硝基水楊酸終止酶反應(yīng)。充分搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至15 mL。以變性酶為空白對照，測定 OD540值，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)求得含糖量。

1.2.3.3濾紙酶活力（FPA）的測定

試管中加入0.5 mL粗酶液和2 mL 0.025 mol/L CMC-HAc緩沖液，于45℃水浴中預(yù)熱5 min后加入50 mg濾紙條（新華定量濾紙，l cm×6 cm），保溫1 h，加入2.5 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑終止酶反應(yīng)。充分搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至15 mL。以變性酶為空白對照，測定OD540值，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)求得含糖量。

酶活定義為每分鐘催化纖維素水解生成l μmol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位IU。按下式算出濾紙酶活力：

酶活=還原糖濃度×15×稀釋倍數(shù)/（t×0.5×180）

式中，稀釋倍數(shù)指測定酶活時酶液的稀釋倍數(shù)；t為酶反應(yīng)時間（min）；180為葡萄糖分子量，15指15 mL定容體積，單位為g；0.5指0.5 mL粗酶液參加反應(yīng)。

1.3數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Excel 2010和SPSS 17統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1蔗渣纖維素分解菌的篩選和鑒定

從蔗渣堆肥中經(jīng)過剛果紅透明圈法篩選分離到8株具有降解纖維素能力的真菌，依次命名為SC1～SC8（暫定名），其透明圈直徑大小如表1所示。其中SC8菌株生長速度較快且長勢旺盛，在剛果紅培養(yǎng)基上形成的透明圈最大，降解纖維素的能力較強(qiáng)。該菌株在平板培養(yǎng)基上菌落呈圓形，邊緣平整，具輻射狀皺紋，質(zhì)地絲絨狀到絮狀，表面粗糙，布滿一層孢子粉，孢子呈暗綠色（圖1 A），在剛果紅纖維素培養(yǎng)基平板上能形成明顯的透明圈（圖1 B）。根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征，按《真菌分類鑒定手冊》和《真菌分類學(xué)》進(jìn)行檢索，初步鑒定SC8為曲霉屬（Aspergillus）。

表1　8株菌株的透明圈直徑大小

圖1　蔗渣纖維素分解菌的菌落形態(tài)（A）及在剛果紅纖維素培養(yǎng)基上形成的透明圈（B）

2.2菌株羧甲基纖維素酶（CMCase）和濾紙酶（FPA）活力的測定

從表1中挑選出透明圈較大的菌株 SC2、SC6 和SC8進(jìn)行羧甲基纖維素酶活力和濾紙酶活力的測定。從表2可見，菌株的CMCase和FPA酶活力由高到低依次為SC8＞SC2＞SC6，該結(jié)果與透明圈直徑大小的結(jié)果相一致。SC8的CMCase和FPA酶活力分別為SC6的3.88倍和2.07倍。

2.3菌株透明圈和酶活力的關(guān)系

相關(guān)性分析表明（表3），菌株在剛果紅纖維素培養(yǎng)基上形成的透明圈大小與CMCase和FPA酶活力成極顯著正相關(guān)（p＜0.01），且CMCase和FPA酶活力之間也成極顯著正相關(guān)。可見，通過菌株在剛果紅纖維素培養(yǎng)基上形成的透明圈大小可初步判斷其降解纖維素能力的強(qiáng)弱。

表2　菌株的CMCase和FPA酶活力

3　討論

剛果紅羧甲基纖維素（CMC）平板透明圈篩選法是目前分離纖維素分解菌公認(rèn)的比較快速、簡捷的方法。該法可用于識別產(chǎn)纖維素酶的菌株，還可用于初步判定酶活性高低。產(chǎn)酶越多，透明圈越大，產(chǎn)酶越快，透明圈出現(xiàn)越早。透明圈的大小與CMCase酶活、FPA酶活具有一定的相關(guān)性。岳思君等研究結(jié)果表明，水解圈的大小直接反映 CMC酶活的大小，但FPA酶活與剛果紅纖維素平板水解圈大小、CMC酶活不成線性關(guān)系［6］。本文結(jié)果顯示，所篩選分離得到的菌株透明圈的大小與CMCase酶活、FPA酶活存在極顯著正相關(guān)。

表3　菌株透明圈與酶活力的相關(guān)性分析

近年來已發(fā)現(xiàn)的能降解纖維素的微生物超過了200種，但對纖維素分解能力較強(qiáng)的真菌主要?dú)w屬于木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和枝頂孢霉屬（Acremonium）［7］。本文從蔗渣中篩選分離得到的真菌SC8經(jīng)初步鑒定為曲霉屬。鐘國祥等［8］從霉變蔗葉中分離到1株纖維素降解菌，并對其培養(yǎng)條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該菌產(chǎn)酶的最適溫度為為 40℃，最適 pH 為5.5。楊培新等［9］從長期堆放廢棄竹筍殼的土壤中分離到1株產(chǎn)纖維素酶的曲霉屬真菌，并且通過單因素試驗(yàn)從不同碳源、氮源濃度和培養(yǎng)基初始 pH 值3個因素優(yōu)化了該菌在液體發(fā)酵中產(chǎn)纖維素酶的條件，結(jié)果表明，比未優(yōu)化對照酶活力提高了15.02％。

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，是起協(xié)同作用的多組分酶系。目前，認(rèn)為纖維素酶由3種不同功能的水解酶組成：外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶［10］。研究表明，不同的微生物所產(chǎn)纖維素酶不同，多種微生物混合培養(yǎng)可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，明顯提高纖維素的降解效率［11-13］。另外，影響酶活力的因素較多，如酶的濃度、底物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、pH值、反應(yīng)溫度等［14-15］。本文從蔗渣堆肥中篩選得到8株纖維素分解菌，初步分析了其部分酶學(xué)性質(zhì)，但菌株間的復(fù)合方式、相互作用以及發(fā)酵影響因素還有待進(jìn)一步研究。

［1］王允圃，李積華，劉玉環(huán)，等.甘蔗渣綜合利用技術(shù)的最新進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（16）：370-375.

［2］谷嵩，劉昱輝.纖維素酶的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（25）：7736-7737.

［3］BAL R， CHAUDHARI K， SIVASANKER S.Vapour phase O-methylation of 2-naphthol over the solid bases alkali-loaded silica and Cs-loaded MCM-41 ［J］.Catalysis Letters， 2000， 70（1-2）：75-78.

［4］包衎，王曉輝，張偉瓊，等.纖維素分解菌的選育及酶活測定［J］.生物學(xué)雜志，2007（2）：56-58.

［5］毛文韜，吳雪蓮，辜夕容，等.縉云山馬尾松林地土壤真菌的纖維素酶活性研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，28（3）：1192-1196.

［6］岳思君，李學(xué)斌，李愛華，等.高酶活纖維素分解菌分離篩選的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（1）：11-12.

［7］劉淑霞，王鴻斌，趙蘭坡，等.幾種纖維素分解菌在有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008（3）：991-996.

［8］鐘國祥，姚健，張誠，等.纖維素降解菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015（6）：85-89.

［9］楊培新，鄭銳東，羅集豐，等.1株產(chǎn)纖維素酶真菌的篩選鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015（1）：186-191.

［10］RABINOVICH M L， MELNICK M S， BOLOBOVA A V.The structure and mechanism of action of cellulolytic enzymes ［J］.Biochemistry （Mosc）， 2002， 67（8）：850-871.

［11］王海濱，韓立榮，馮俊濤，等.高效纖維素降解菌的篩選及復(fù)合菌系的構(gòu)建［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2015（4）：421-431.

［12］崔宗均，樸哲，王偉東，等.一組高效穩(wěn)定纖維素分解菌復(fù)合系 MC1的產(chǎn)酶條件［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004（2）：296-299.

［13］SCHWARZ W H.The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria ［J］.Appl Microbiol Biotechnol， 2001， 56（5-6）：634-649.

［14］許鳳華，翟珊珊，劉亭亭，等.高效纖維素降解真菌的篩選及粗酶活性［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（21）：7-10.

［15］昌艷萍，耿超，李春蕾，等.高活性秸稈降解菌群的構(gòu)建及產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013（1）：134-137.

（本篇責(zé)任編校：李金玉）

Screening， Identification and Enzyme Activity Assay of Bagasse Celluloytic Microbes

HUANG Hui-juan1， FANG Jie-qun1， CHEN Hua-wen2， CHEN Di-wen1， HUANG Ying1， HUANG Zhen-rui1，JIANG Yong1
（1Guangzhou Sugarcane Industrial Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery，Guangzhou 510316；2Guangdong Suixi County Bureau of Agriculture， Suixi 524300）

In order to make full use of bagasse， this study was conducted to screen high efficient bagasse degradation microorganisms from compost.8 strains of fungi with significant transparent circles and cellulase activity were screened and 3 of them were selected to determine the activity of carboxymethyl cellulase （CMCase） and filter paper activity （FPA）.The results showed that the size of transparent circle and the activity of CMCase and FPA of SC8 were the highest among the 8 screened strains.Based on morphology analysis， the fungus SC8 was initially classified into the genus of Aspergillus.Correlation analysis showed that the size of transparent circle was in significant positive correlation with the activity of CMCase and FPA （p＜0.01）.

Bagasse； Celluloytic microbes； Cellulase； Filter paper activity

S566.1

A

1005-9695（2016）03-0042-04

2016-04-14；

2016-06-13

南方高蓄能作物養(yǎng)分資源綜合管理創(chuàng)新能力建設(shè)（2015B070701001）；南方高稈作物農(nóng)用化學(xué)品減量化關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新能力建設(shè)（2014B070706005）；現(xiàn)代甘蔗育種創(chuàng)新能力建設(shè)（2014B070705002）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系甘蔗專項(xiàng)（CARS-20-3-1）作者簡介：黃惠娟（1985-），女，助理農(nóng)藝師，主要從事功能微生物篩選利用及科研管理等工作；Email：iue123@163.com

江永（1961-），男，碩士，研究員，主要從事甘蔗耕作與栽培、廢棄物資源化利用等工作；Email：gz510316@sina.com

黃惠娟，方界群，陳華文，等.蔗渣纖維素分解菌的篩選、鑒定及酶活的測定［J］.甘蔗糖業(yè)，2016（3）：42-45.