宋　飏，黃　原

陜西師范大學生命科學學院，西安　710062

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DNA復合條形碼在太白山土壤動物多樣性研究中的應用

宋飏，黃原*

陜西師范大學生命科學學院，西安710062

DNA復合條形碼技術(metabarcoding)將DNA條形碼與高通量測序技術相結合，快速便捷地鑒定群落混合樣本中的物種，成為監(jiān)測群落中物種組成和豐富度的可靠方法。采用這一方法分析了秦嶺太白山5種不同生境的中小型土壤動物多樣性，共得到土壤動物3門9綱28目199科。群落組成分析顯示生境的變化對土壤動物群落組成有一定的影響。α多樣性分析顯示土壤動物群落豐富度指數最高的生境為針葉林，最低的為農田；土壤動物群落多樣性指數最高的生境為針葉林，最低的為落葉小葉林。群落相似性分析顯示高山草甸、針葉林和農田3種生境的土壤動物群落組成相似性較高，落葉小葉林和落葉闊葉林的土壤動物群落組成與這3種生境的差異較大，落葉小葉林與落葉闊葉林的土壤動物群落組成差異也較大。

DNA復合條形碼；太白山；土壤動物；生物多樣性

DNA復合條形碼技術(metabarcoding)是一種結合了DNA條形碼技術和高通量測序技術的快速鑒定混合樣本中物種的方法[1-3]。DNA條形碼技術通過一段短的DNA序列來鑒定物種，由Hebert等人于2003年提出[4]。傳統(tǒng)的Sanger測序只能對單一的DNA分子進行測序，而高通量測序技術可以分別對混合DNA中的每一條DNA分子進行測序。兩種技術的結合運用可以獲得混合樣本中大量的含有分類學信息的DNA片段的序列，然后將這些序列與合適的數據庫比對即可確定其代表的類群。隨著高通量測序技術的持續(xù)發(fā)展與分析軟件的不斷完善，在分析生物多樣性時，DNA復合條形碼技術可以作為代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法的一個選擇[2-3]。

DNA復合條形碼技術已普遍使用于微生物群落的研究，并且正越來越多的應用到動植物多樣性研究中[1,5]。在土壤動物方面：Douglas等人構建了7個節(jié)肢動物群落，通過對這些節(jié)肢動物群落的DNA復合條形碼研究證明了該方法可以精確估計群落內的系統(tǒng)發(fā)育多樣性和群落間的差異性[2]；Bienert等人對2個不同地點的土壤樣品進行了研究，發(fā)現這一方法能很好地區(qū)分這2個地點的蚯蚓群落組成，并且與使用傳統(tǒng)方法得到的結果一致[6]；Yang等人對基于該技術分析土壤小型動物多樣性的3種數據處理流程進行了分析比較，結果表明3種流程的處理結果基本一致[7]；魏攀利用該技術對小五臺山國家級自然保護區(qū)1m2草地中無脊椎動物多樣性進行了研究，共調查得到125種無脊椎動物[8]；Yang等人使用該方法對采自土壤和落葉層的樣本與采自地上的樣本進行了比較，結果表明，在研究生物多樣性格局時，兩類樣本可以得到相似的生態(tài)學信息[9]。此外，還有許多關于土壤線蟲的研究[10-12]。

目前, 科學界已經認識到土壤是地球上生物多樣性最豐富的生境之一[13]。雖然土壤生物多樣性的研究已有很長時間，但是，關于土壤生物多樣性本身的很多基礎科學問題仍然不清楚。從某種意義上說，對土壤生物多樣性的研究還處于初期階段[14]。

我國對土壤動物的研究主要集中在東北、亞熱帶地區(qū)、熱帶雨林地區(qū)以及新疆地區(qū)，對于中西部地區(qū)的土壤動物研究還很少[15-16]。太白山為秦嶺主峰，位于動物古北界與東洋界的交匯和過渡地帶，是華北、華中和橫斷山脈3個植物區(qū)系的交匯處，自然植被帶完整，生態(tài)系統(tǒng)復雜多樣，生物資源豐富，在海拔3400m以上存有完整的第四紀古冰川遺跡，是一個保存完好的自然生態(tài)系統(tǒng)，是我國生物多樣性保護的關鍵區(qū)域[17]。

本文選取18S核糖體小亞基RNA(18S rRNA)基因和細胞色素C氧化酶亞基I(COI)基因的部分序列作為分子標記，應用DNA復合條形碼技術對秦嶺太白山地區(qū)5種不同生境(高山草甸，針葉林，落葉小葉林，落葉闊葉林，農田)的中小型土壤動物多樣進行研究，并討論該方法目前應用于中小型土壤動物研究的優(yōu)缺，為進一步探討秦嶺中小型土壤動物多樣性格局以及秦嶺生物多樣性保護提供科學依據。

1　研究方法

1.1樣本的采集和分離

于2014年6月上旬在太白山自然保護區(qū)及周圍選取高山草甸、針葉林、落葉小葉林、落葉闊葉林和農田5種生境進行取樣。每種生境選取10m×10m的3個樣方，在每個樣方內隨機采取3份土樣，采樣深度為0—15cm。將土樣帶回實驗室，用Tullgren漏斗進行分離(40W白熾燈分離48 h)。將收集到的土壤動物保存在100%乙醇中，用于總DNA的提取。樣地詳細信息見表1。

表1　樣地詳細信息

*采樣時該地點GPS無法定位

1.2總DNA提取

將一個樣方分離到的所有土壤動物混合放入一個1.5mL離心管，使用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)進行總DNA提取，得到15份總DNA。將每種生境的3份總DNA進行等濃度混合，得到用于后續(xù)PCR的5份總DNA。

1.3PCR及測序

PCR反應體系為25μL，包括2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 12.5μL，滅菌超純水9.5μL，正向引物(10μmol/L)1.0μL，反向引物(10μmol/L)1.0μL，總DNA 1.0μL。

18S rRNA基因部分序列(大約350bp)的擴增使用正向引物#3：5′-GYGGTGCATGGCCGTTSKTRGTT-3′和反向引物#5_RC：5′-GTGTGYACAAAGGBCAGGGAC-3′[18]。為了同時對多個樣本進行測序，在每個樣本的正向引物5′端加上了7bp的barcode序列，用于后續(xù)分析中區(qū)分序列來自哪個樣本。PCR的循環(huán)程序為：95℃ 10min；10個循環(huán)：95℃ 10s，57℃ 30s(每個循環(huán)降低0.5℃)，72℃ 60s；30個循環(huán)：95℃ 10s，55℃ 30s，75℃ 60s；最后在72℃下延長5min。

COI基因部分序列(大約313bp)的擴增使用正向引物mlCOlintF：5′-GGWACWGGWTGAACWGT WTAYCCYCC-3′[19]和反向引物jgHCO2198：5′-TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3′[20](用N替換了原序列中的I)。同樣在每個樣本的正向引物5′端加上了7bp的barcode序列。PCR的循環(huán)程序為：16個循環(huán)：95℃ 10s，62℃ 30s(每個循環(huán)降低1℃)，72℃ 60s；25個循環(huán)：95℃ 10s，46℃ 30s，72℃ 30s；最后在72℃下延長5min。

每份總DNA擴增3次，然后將3份PCR產物等濃度混合。PCR產物的測序使用Illumina MiSeq平臺，采用250PE測序策略，由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.4數據處理

1.4.1原始數據處理

步長為1的5bp窗口從序列起始位置開始滑動，要求窗口中堿基平均質量≥Q20，低于該值則截斷序列。然后使用FLASH(http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)對通過質量過濾的序列進行拼接。使用Qiime[21]對拼接后的序列進一步過濾，舍棄含有N堿基、長度<150bp、barcode有錯配和引物錯配堿基數>1的序列。使用mothur[22]去除嵌合體序列，得到用于后續(xù)分析的序列。

1.4.2OTU聚類及注釋

使用Qiime將序列按相似度0.97聚類為OTU(Operational Taxonomic Unit)[23]，選取每個OTU最長的序列作為代表序列。將18S rRNA基因和COI基因的OTU代表序列分別與Silva[24]數據庫(115版)和BOLD[25]數據庫(截止到Release 5.00-v1)進行比對，獲得每個OTU的分類學信息。使用兩個標記的OTU列表生成物種列表，然后合并，刪去不屬于土壤動物的類群。使用Excel繪制目水平上的群落組成百分比堆積圖。使用R軟件VennDiagram程序包繪制Venn圖。

1.4.3α多樣性分析

使用R軟件vegan程序包對各樣本的Chao1豐富度指數，ACE豐富度指數，Shannon-Wiener多樣性指數和Simpson多樣性指數進行計算。

1.4.4群落相似性分析

使用R軟件vegan程序包對各樣本之間的Bray-Curtis距離進行計算，然后使用ape程序包基于Bray-Curtis距離對樣本進行主坐標分析(Principal Coordinates Analysis; PCoA)。

1.4.5 聚類分析

根據物種列表，使用R軟件pheatmap程序包將科水平上的分類信息進行聚類分析并繪制Heatmap圖。

圖1　各樣本在科水平的Venn圖Fig.1　Venn diagram for families of samplesA: 高山草甸represents alpine meadow，B: 針葉林represents coniferous forest，C: 落葉小葉林represents deciduous small-leaved forest，D: 落葉闊葉林represents deciduous broad-leaved forest，E: 農田represents farmland

2　結果

2.1原始數據處理與OTU聚類

經最初的質量過濾與拼接后得到611959序列，其中18S rRNA基因309167條，COI基因302792條。經Qiime與mothur進一步過濾后得到用于后續(xù)分析的序列，共437313條，其中18S rRNA基因211436條，COI基因225877條。合格序列聚類后，18S rRNA基因共得到1653個OTU，COI基因共得到2138個OTU。

2.2種類組成

本文的土壤動物分類參照《中國土壤動物檢索圖鑒》[26]。調查共鑒定到土壤動物3門9綱28目199科，其中18S rRNA基因鑒定到2門8綱23目101科，COI基因鑒定到3門7綱16目128科，兩者共同鑒定到2門6綱12目31科。高山草甸包含21目136科，針葉林包含20目141科，落葉小葉林包含21目122科，落葉闊葉林包含21目138科，農田包含23目132科。各樣本所包含的類群及各類群在各樣本中所含序列條數見附表。

對各樣本做Venn圖(圖1)可得，各樣本在科水平共有的類群數為84，在高山草甸、針葉林、落葉小葉林、落葉闊葉林、農田各自總類群數中所占比例分別為61.76%、59.57%、68.85%、60.87%、63.64%。高山草甸獨有的類群數為9，占其總類群數6.62%；針葉林獨有的類群數為13，占其總類群數9.22%；落葉小葉林獨有的類群數為7，占其總類群數5.74%；落葉闊葉林獨有的類群數為10，占其總類群數7.25%；農田獨有的類群數為7，占其總類群數5.30%。

圖2　目水平上各類群的序列豐度在各樣本中所占的百分比　Fig.2　Percentage of sequence aboundance of taxa for order in each sanple

如圖2所示，在目水平上，真螨目、彈尾目和蜘蛛目的豐度在各個樣本中都較高，其中蜘蛛目在落葉小葉林中所占比例達64.62%。鱗翅目在高山草甸、針葉林和農田中的豐度較高，而在落葉小葉林和闊葉林中豐度較低。半翅目在高山草甸、針葉林和落葉小葉林中豐度較高，而在落葉闊葉林和農田中豐度較低。雙尾目在落葉闊葉林中所占比例達61.04%，而在其他生境中含量較低。條馬陸目在針葉林中含量較高，鞘翅目在農田中含量較高。其余類群在各生境中含量均較低。

2.3α多樣性分析

各生境的土壤動物群落Chao1豐富度指數為：針葉林>落葉小葉林>落葉闊葉林>高山草甸>農田；ACE豐富度指數為：針葉林>落葉闊葉林>高山草甸>落葉小葉林>農田；Shannon-Wiener多樣性指數為：針葉林>高山草甸>農田>落葉闊葉林>落葉小葉林；Simpson多樣性指數為：針葉林>高山草甸>農田>落葉闊葉林>落葉小葉林。各生境多樣性指數見表2。

2.4群落相似性分析

Bray-Curtis距離可以作為衡量群落間相似性的指標，Bray-Curtis距離越小，表示兩個樣本的群落組成越相似。表3為各樣本之間的Bray-Curtis距離。根據各樣本之間的Bray-Curtis距離，可以做PCoA分析。樣本的相似性越高，它們在PCoA圖中的距離就越近。圖3為根據各樣本間的Bray-Curtis距離，選取貢獻率最大的主坐標組合所做的PCoA圖。圖3顯示土壤動物群落組成在高山草甸、針葉林、農田3種生境中的相似性較高，落葉小葉林和落葉闊葉林的土壤動物群落組成與這3種生境的相似性較低，落葉小葉林與落葉闊葉林之間的土壤動物群落組成相似性也較低。

表2　各生境多樣性指數

2.5聚類分析

Heatmap圖可以直觀地將數據值的大小以顏色的深淺表示出來，同時可根據需要將數據進行物種或樣本間的相似性聚類。圖4為使用歐式距離和最長聚類法所作的Heatmap圖，展現了科水平各類群在各樣本中的豐度分布，同時也在科水平對各樣本進行了聚類?？梢钥吹?，高山草甸與針葉林首先聚類，然后與農田聚類，然后與落葉闊葉林聚類，最后與落葉小葉林聚類。

表3　各樣本之間的Bray-Curtis距離

圖3　PCoA分析Fig.3　PCoA analysis　A: 高山草甸 represents alpine meadow，B: 針葉林represents coniferous forest，C: 落葉小葉林represents deciduous small-leaved forest，D: 落葉闊葉林represents deciduous broad-leaved forest，E: 農田represents farmland

圖4　 聚類分析Heatmap圖Fig.4　 Heatmap of cluster analysisA： 高山草甸represents alpine meadow，B： 針葉林represents coniferous forest，C： 落葉小葉林represents deciduous small-leaved forest，D： 落葉闊葉林represents deciduous broad-leaved forest，E: 農田represents farmland

3　結論與討論

從類群列表來看，兩個分子標記鑒定到的類群沒有完全重疊，兩者共同鑒定到的類群只有31科。而18S rRNA基因單獨鑒定到70科，COI基因單獨鑒定到97科，遠大于它們共同鑒定到的類群數。即使是在目水平上，兩者鑒定到的類群也有很大的區(qū)別。這是由于不同分子標記的通用引物在不同類群中的擴增能力不同與數據庫的覆蓋度不同造成的[18-19,27]。因此單獨使用一種分子標記來鑒定樣本中含有的類群會造成對類群數的低估，同時使用多種分子標記可以更全面的鑒定樣本中所含類群[10,28]?？紤]到數據庫的可用性，對于后生動物來說，較好的分子標記有COI、18S rRNA和28S rRNA基因[18,25,29-30]。

盡管采樣地點的海拔跨度高達2500m以上，生境類型發(fā)生了劇烈的變化，但從各樣本群落組成來看，在目水平，真螨目、彈尾目和蜘蛛目在各生境中所占的比例都較大，在科水平，5種生境的共有類群達84種，在各生境類群數中所占比例大多超過60%(在針葉林中為59.57%)，這表明太白山中小型土壤動物中大多數類群為廣布類群。另外，各生境均含有類群數低于10%的特有類群，表明海拔與生境的變化會對太白山中小型土壤動物的群落組成造成一定的影響。這與以往的研究結果一致[31-33]。

在α多樣性分析中，雖然Chao1指數與ACE指數同為豐富度指數，但它們的排序結果卻有細微的差別，落葉小葉林中的土壤動物群落Chao1指數排在落葉闊葉林和高山草甸之前，而ACE指數卻排在了落葉闊葉林和高山草甸之后。這是因為ACE指數的計算公式中加入了一個定義“優(yōu)勢”類群的閾值，這個閾值在vegan程序包中為類群包含10條序列，而Chao1指數并沒有這個規(guī)則[34]。因此可以推斷落葉小葉林土壤動物群落中包含較多的低豐度類群(所含序列數<10)。在DNA復合條形碼技術中，Shannon-Wiener和Simpson多樣性指數是基于一個類群所含序列數計算的，而不是基于一個類群的個體數。Carew等人[28]指出，在一個樣本中，一個物種的序列數和個體數是正相關的，但序列的頻率并不能完美的反映物種的頻率。Piol等人[35]的研究也表明該技術的定量潛力有限，只有定性的研究是可靠的。因此，Shannon-Wiener和Simpson多樣性指數僅能作為一個參考，不能通過這兩個指數很好的判斷土壤動物群落的多樣性。定量問題是目前該技術用于土壤動物研究的局限性。

從各樣本之間的Bray-Curtis距離與PCoA圖來看，針葉林與高山草甸的土壤動物群落組成最為相似，針葉林與農田次之。針葉林、高山草甸與農田三者的土壤動物群落組成相似性較高，而落葉小葉林和落葉闊葉林的土壤動物群落組成與這3種生境的相似性都較低，落葉小葉林和落葉闊葉林的土壤動物群落組成相似性也較低。聚類分析得到了與PCoA分析相符的結果。這種相似性的形成可能與各生境中的氣溫和土壤的理化條件相關[32]，有待后續(xù)的實驗。

根據以往的土壤動物研究可知，在一次調查中會得到成千上萬的土壤動物，且土壤動物包含的類群很多，鑒定這些土壤動物需要多人長時間作業(yè)。對于其它的環(huán)境樣本，也存在同樣的問題。而通過DNA復合條形碼技術，則可以快速簡便的完成大量樣本的分類鑒定，與傳統(tǒng)方法相比，省時省力，這也是該技術的優(yōu)勢所在。隨著高通量測序技術的不斷發(fā)展和分析方法的不斷完善，DNA復合條形碼技術的高成本效益和全面性將使更容易的大尺度監(jiān)測生物多樣性趨勢成為可能[36-37]。

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The application of DNA metabarcoding in the study of soil animal diversity in Taibai Mountain

SONG Yang, HUANG Yuan*

CollegeofLifeScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi′an710062,China

DNA metabarcoding which couples DNA barcoding with high-throughput sequencing technology enables quick and easy identification of species in a multiple sample, and has become a reliable method for surveying species composition and richness of a community. Taibai Mountain is the main peak of the Qinling Mountains. It is a well-preserved natural ecological system, and is a key area of biodiversity protection in China. Surveys on the diversity of soil meso-microanimals in Taibai Mountain will enrich the data of soil fauna composition and provide scientific basis for biodiversity protection in China. In this paper, we used the metabarcoding approach to analyze the diversity of soil meso-microanimals in 5 different habitats of Taibai Mountain in the Qinling Mountains. These habitats include alpine meadow, coniferous forest, deciduous small-leaved forest, deciduous broad-leaved forest, and farmland. We set 3 plots of 10 m × 10 m in each habitat, and 3 soil samples were collected randomly from each plot, the sampling depth was 0—15cm under ground. A Tullgren funnel was used to separate soil animals from soil samples. Soil animals from the same plot were transferred to 1.5-mL centrifuge tubes and the total DNA was extracted. The universal primers for the fraction of 18S rRNA and COI genes were used to amplify specific barcoding sequences. Sequencing of PCR amplicons was performed on a MiSeq Illumina sequencing platform. Raw data was analyzed using the Qiime and Mothur software to obtain the OTUs list and species list. Ecological analysis was performed using software R. A total of 199 families from 28 orders, 9 classes, and 3 phyla for soil animals were observed. Community composition analysis showed that habitat changes have some effect on the soil animal community composition. Alpha diversity analysis showed that the highest community richness index for soil animals is the coniferous forest and the lowest is the farmland; in addition, the highest community diversity index for soil animals is the coniferous forest and the lowest is the deciduous small-leaved forest. The community similarity analysis showed that the soil animal community composition in alpine meadow, coniferous forest, and farmland has a high similarity. The soil animal community composition in deciduous small-leaved forest and deciduous broad-leaved forest greatly differed from that in alpine meadow, coniferous forest, and farmland. The difference between the soil animal community composition in deciduous small-leaved forest and deciduous broad-leaved forest also differed greatly. The results of cluster analysis was in conformity with the community similarity analysis.

DNA metabarcoding; Taibai Mountain; soil animals; biodiversity

國家自然科學基金(31172076, 31372192)

2014-12-12; 網絡出版日期:2015-10-30

Corresponding author.E-mail: yuanh@snnu.edu.cn

10.5846/stxb201412122475

宋飏，黃原.DNA復合條形碼在太白山土壤動物多樣性研究中的應用.生態(tài)學報,2016,36(14):4531-4539.

Song Y, Huang Y.The application of DNA metabarcoding in the study of soil animal diversity in Taibai Mountain.Acta Ecologica Sinica,2016,36(14):4531-4539.