石志剛 萬如 李彥龍 王亞軍 馬婷慧

摘要：對(duì)寧夏枸杞主要品種psbA-trntH的DNA條形碼序列進(jìn)行分析，從分子水平對(duì)枸杞做出鑒定。采用改進(jìn)CTAB法提取枸杞葉片DNA，利用合成的特異引物對(duì)其葉綠體間隔序列進(jìn)行擴(kuò)增、克隆，對(duì)目的片段測(cè)序分析，克隆到枸杞主要品種psbA-trntH片段，并獲得其堿基序列（總長為545 bp）。

關(guān)鍵詞：枸杞屬；psbA-trntH；DNA測(cè)序；鑒定

中圖分類號(hào)：R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-1161（2016）06-0001-03

寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）是我國名貴的道地藥材，具有抗氧化、抗腫瘤、軟化血管、降脂、降糖、生精、保肝、明目、增強(qiáng)人體免疫力等療效[1-4]。寧夏自20世紀(jì)60年代起開展枸杞新品種育種工作，目前寧夏農(nóng)林科學(xué)院自主選育出寧杞1號(hào)、寧杞2號(hào)、寧杞3號(hào)、寧杞5號(hào)、寧杞6號(hào)、寧杞7號(hào)、寧農(nóng)杞9號(hào)等10余個(gè)新品種，國內(nèi)科技工作者也選育出柴杞1號(hào)、蒙杞1號(hào)、精杞1號(hào)等新品種。由于各品種之間常有相同的基原或?yàn)榻墸沟盟鼈冊(cè)谕庠谛螒B(tài)、習(xí)性、組織構(gòu)造以及所含的化學(xué)成分方面具有高度的相似性，傳統(tǒng)的鑒定方法已難以準(zhǔn)確鑒別。以DNA條形碼為工具對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的識(shí)別和鑒定已用于系統(tǒng)學(xué)研究和品種的鑒定。近些年來，國內(nèi)外許多學(xué)者都對(duì)植物中適合作為DNA條形碼的基因序列進(jìn)行了積極的探索與研究。psbA-trntH基因片段作為植物DNA條形碼最大的優(yōu)勢(shì)是進(jìn)化速率快，累積較多變異，從而能更好地鑒別親緣關(guān)系很近的物種[5-8]。目前，利用psbA-trntH基因序列測(cè)定鑒定寧夏枸杞品種的研究還未見報(bào)道，因此，本課題以寧夏枸杞主要品種為試材，對(duì)枸杞psbA-trntH基因片段序列進(jìn)行分析研究，以期為從分子水平鑒定枸杞品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為收集保存在寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞中心枸杞種質(zhì)資源圃內(nèi)的枸杞主要品種（見表1）。

1.2 試驗(yàn)儀器

PCR儀：Bio-Rad公司；DYY-12型電泳儀：北京六一儀器廠；DYCp231型電泳槽：北京六一儀器廠； UV-2550紫外可見分光光度儀；TOMOS3-18R Refrigerated Centrifuge；Alpha lnnotech凝膠成像儀；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒：Tiangen公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組總DNA的提取 參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的茄科植物nrDNA ITS序列，采用測(cè)序引物設(shè)計(jì)的軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。AHf：5，-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3；AHr：5，-CGCGCATGGTG

GATTCACAATCC-3。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3.3 目的基因的克隆及測(cè)序 以上述引物對(duì)7個(gè)供試材料的基因組DNA基因PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系15.0 μL：7.5 μL 2×Mix混合液，上下游引物各0.5 μL，2.0 μL模板DNA，4.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?） 94 ℃預(yù)變性3 min；2） 94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，36次循環(huán)；3） 72 ℃保溫10 min；4） 4 ℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA膠回收試劑盒對(duì)約550 bp的目標(biāo)條帶進(jìn)行回收。將回收產(chǎn)物與Lethal Based Fast Cloning Kit連接，T4 DNAlrgse，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，采用藍(lán)白斑法篩選陽性菌落。對(duì)陽性菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)后，送往生工生物工程公司（上海）完成。

1.3.4 序列分析 序列分析在NCBI網(wǎng)站及使用DNAMAN，DNAstar軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

利用DNAMAN軟件將試驗(yàn)測(cè)得的寧夏枸杞主要品種psbA-trntH序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的psbA-trntH進(jìn)行同源性比較，并對(duì)所測(cè)得的序列進(jìn)行對(duì)位排列，結(jié)果如圖1所示。

8個(gè)供試材料整個(gè)ITS序列長度變異范圍為545 bp，僅有寧杞3-2號(hào)有變異，變異位點(diǎn)9個(gè)，變異率1.7%，寧杞1，2，3-1，4，5，6，7號(hào)這7個(gè)沒有差異。

3 結(jié)論與討論

雖然DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于枸杞屬植物鑒定等方面已有一些報(bào)道[10-11]，但目前植物性中藥材的基因組序列絕大多數(shù)沒有測(cè)定，尤其是枸杞序列國內(nèi)未見報(bào)道。本課題利用psbA-trntH基因片段的保守區(qū)序列，自行設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出整個(gè)psbA-trntH基因片段，并完成了擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA堿基序列的測(cè)定，得到7個(gè)枸杞主要品種psbA-trntH基因片段的完整序列，經(jīng)過分析能夠鑒定出供試材料之間的差異，但是否可利用psbA-trntH基因片段序列在分子生物學(xué)水平對(duì)枸杞品種進(jìn)行鑒定有待進(jìn)一步篩選和研究。

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