基于代謝組學(xué)技術(shù)研究澤瀉對高脂血癥大鼠防治的生物化學(xué)作用機(jī)制

苗　華

(西北大學(xué) 體育教研部, 陜西 西安　710069)

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·生命科學(xué)·

基于代謝組學(xué)技術(shù)研究澤瀉對高脂血癥大鼠防治的生物化學(xué)作用機(jī)制

苗華

(西北大學(xué) 體育教研部, 陜西 西安710069)

利用代謝組學(xué)方法鑒定澤瀉對高脂飼料誘導(dǎo)的高脂血癥治療的尿液生物標(biāo)示物和闡明生物化學(xué)作用機(jī)制。超高壓液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用測定對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組尿液,采用偏最小二乘判別分析法研究對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組之間的代謝物譜差異,鑒定了14個(gè)生物標(biāo)示物,高脂血癥模型組高脂飼料上調(diào)了大鼠尿液硬脂酸酰胺、油酸酰胺、3-甲基尿苷、十六烷酰胺、吲哚-3-甲酸和肌酐,同時(shí)下調(diào)了二十四碳六烯酸、3-氧-甲基多巴、吲哚-3-甲酸葡糖苷酸、多巴胺、尿酸、苯丙氨酸、左旋肉堿和甲基肌苷。澤瀉提取物逆轉(zhuǎn)了這些異常上調(diào)和下調(diào)的生物標(biāo)示物。澤瀉提取物改善了由高脂飼料造成的異常的脂肪酸代謝、氨基酸代謝和嘌呤代謝。代謝組學(xué)技術(shù)能夠應(yīng)用于高脂血癥及其澤瀉對其治療的生物化學(xué)作用研究。

高脂血癥;代謝組學(xué);澤瀉;超高壓液相色譜;質(zhì)譜;脂肪酸代謝;氨基酸代謝;嘌呤代謝

隨著生活節(jié)奏的加快和飲食結(jié)構(gòu)的改變,高脂血癥已成為影響人類健康的主要疾病之一。高脂血癥是高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥的統(tǒng)稱。高脂血癥是指由各種原因?qū)е碌难獫{中膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇過高和高密度脂蛋白膽固醇過低等脂代謝異常。高脂血癥容易導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(頭部的腦動(dòng)脈、心臟的冠狀動(dòng)脈、腎臟動(dòng)脈等阻塞),是心腦血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。隨著中藥對高脂血癥治療研究進(jìn)步,中藥在治療高脂血癥和防治心腦血管相關(guān)疾病方面顯現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢,因其療效顯著、持續(xù)且副作用小而備受關(guān)注,具有廣闊的應(yīng)用前景。我們以前的研究顯示大黃、茯苓和茯苓皮對高脂飼料誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠有較好的治療作用[1-4],中藥澤瀉性寒,味甘、淡,歸腎、膀胱經(jīng)。具有利水滲濕、化濁降脂、泄熱通淋等功效,可用于小便不利、熱淋澀痛、水腫脹滿等癥,藥理研究證明澤瀉具有利尿、抑制動(dòng)脈粥樣硬化和抗腎結(jié)石的活性[5-7],同時(shí)還有保肝、抗炎、降低血壓以及抗高血脂等作用[7]。代謝組學(xué)是通過考察生物體系受刺激或擾動(dòng)前后(如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后)代謝產(chǎn)物圖譜及其動(dòng)態(tài)變化研究生物體系的代謝網(wǎng)絡(luò)的一種技術(shù)。代謝組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于高脂血癥診斷、藥物療效與藥物作用機(jī)理等方面[8-10]。我們以前的初步研究顯示澤瀉對高脂血癥大鼠有較好的防治作用[11],本文利用代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步研究澤瀉提取物防治高脂血癥的生物化學(xué)作用機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)對象與方法

1.1澤瀉乙醇提取物

澤瀉樣品經(jīng)過干燥、粉碎后,根據(jù)報(bào)道方法,采用95%乙醇制備澤瀉乙醇提取物[11]。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠24只,隨機(jī)分成3組,對照組:正常食料喂養(yǎng);高脂血癥模型組:高脂飼料喂養(yǎng);澤瀉提取物治療組:高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)灌胃澤瀉乙醇提取物10g/(kg·d-1),根據(jù)以前我們報(bào)道的給藥和治療方案獲得大鼠的尿液[11]。

1.3代謝組學(xué)方法

在完成在美國Waters AcquityTM液相色譜儀和XevoTMG2 QTof質(zhì)譜儀測得尿液。超高壓液相色譜和質(zhì)譜條件參考我們報(bào)道的方法[11]。

1.4數(shù)據(jù)分析

對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組大鼠尿液樣品經(jīng)色譜分離、質(zhì)譜采集后生成初始結(jié)果RAW文件,經(jīng)Markerlynx XS 軟件進(jìn)行色譜峰自動(dòng)識(shí)別和峰匹配,產(chǎn)生含保留時(shí)間、質(zhì)荷比及響應(yīng)強(qiáng)度信息的代謝產(chǎn)物列表;將該矩陣列表導(dǎo)入Markerlynx軟件進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析和載荷圖分析。所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,兩組間差異比較,采用t檢驗(yàn),P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著性。

2　結(jié)果和討論

2.1正常組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組大鼠尿樣的代謝組學(xué)分析

在正離子模式下,采用UPLC-MS方法采集大鼠對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組尿樣的數(shù)據(jù)。圖1為正離子模式下典型的大鼠對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組尿樣的BPI色譜圖。其顯示對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組存在一定的差別,MakerLyxn軟件對所采集的對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組尿樣的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取和峰匹配,共識(shí)別出3 160個(gè)離子信息。

2.2對照組、高脂血癥模型組和澤瀉提取物治療組大鼠尿樣的多元統(tǒng)計(jì)分析

為了更好地了解對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化,在正離子模式下,我們采用PLS-DA分析方法對對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組大鼠尿樣代謝譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組大鼠尿液的PLS-DA分析結(jié)果顯示對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組明顯的分開,對照組與高脂血癥模型組距離較遠(yuǎn),通過澤瀉治療后的高脂血癥模型組明顯的接近對照組,證明澤瀉對高脂血癥有明顯的治療作用(圖2A)。

圖1　正常對照組(A)、高脂血癥模型組(B)和澤瀉提取物治療組(C)尿液的BPI色譜圖Fig.1　Urinary BPI chromatograms obtained from the control group (A) and hyperlipidemia group (B) and Alisma orientale treatment group (C)

圖2　對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組尿液的PLS-DA投影圖(A)和作為選擇生物標(biāo)示物的PLS-DA 載荷投影圖(B)Fig.2　PLS-DA score plot based on the urinary metabolic profiling of the control group and hyperlipidemia group and Alisma orientale treatment group (A) and PLS-DA loading plot used in biomarkers selection (B)

2. 3生物標(biāo)示物結(jié)構(gòu)鑒定

鑒定內(nèi)源性代謝產(chǎn)物是代謝組學(xué)研究的重要部分。基于UPLC-MS的代謝組學(xué)方法主要通過精確質(zhì)量數(shù)、質(zhì)譜碎片信息、同位素分布和標(biāo)準(zhǔn)品對照確定代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)[12-14]。表1顯示了對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組大鼠尿液中鑒定的14個(gè)生物標(biāo)示物、變化趨勢及其代謝途徑。鑒定的代謝產(chǎn)物主要包括脂肪酸、氨基酸、3-甲基尿苷、吲哚-3-甲酸、肌酐、多巴胺、尿酸等,這些內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的異常變化表明了在高脂血癥大鼠中高脂飼料干擾了脂肪酸代謝、氨基酸代謝和嘌呤代謝等,這些結(jié)果和我們以前的研究一致[15]。澤瀉提取物對這些紊亂的代謝產(chǎn)物起到不同程度的逆轉(zhuǎn)作用,改善了異常的脂肪酸、氨基酸和嘌呤代謝途徑。

表1　對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組大鼠尿液中鑒定的14個(gè)生物標(biāo)示物、變化趨勢及其代謝途徑

注:a對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組的鑒定的代謝產(chǎn)物升高(↑)或降低(↓),高脂血癥模型組與對照組比較:*P<0.05;**P<0.01;澤瀉提取物治療組與高脂血癥模型組比較:#P<0.05,##P<0.01

2.4生物標(biāo)示物相關(guān)系數(shù)分析

為了研究澤瀉提取物對高脂血癥的防治效果,我們應(yīng)用相關(guān)系數(shù)分析研究鑒定的生物標(biāo)示物和對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組的關(guān)系。圖3顯示了鑒定的14個(gè)代謝產(chǎn)物在對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組的變化趨勢。變化趨勢朝上的是和對應(yīng)組正相關(guān),反之,朝下的是和對應(yīng)組負(fù)相關(guān)。生物標(biāo)示物3，7，12，13和14是和對照組正相關(guān);生物標(biāo)示物1，2，4，5，6，8，9和11是和對照組負(fù)相關(guān),這些結(jié)果證明14個(gè)代謝產(chǎn)物正常的代謝變化趨勢。生物標(biāo)示物1，2，3，4，5，6，8和9是和高脂血癥模型組正相關(guān);生物標(biāo)示物7，10，11，12，13和14是和高脂血癥模型組負(fù)相關(guān),這些結(jié)果證明高脂飼料造成了高脂血癥,高脂血癥和這14個(gè)生物標(biāo)示物的異常代謝有關(guān)。在澤瀉提取物治療組生物標(biāo)示物1，2，3，4，5，6，8，9，12和14是和澤瀉提取物治療組正相關(guān);生物標(biāo)示物7，10，11和13是和澤瀉提取物治療組負(fù)相關(guān),高脂血癥組大鼠的生物標(biāo)示物經(jīng)過澤瀉提取物治療恢復(fù)到了對照組的生物標(biāo)示物的變化趨勢,澤瀉提取物治療組生物標(biāo)示物的整體變化趨勢和對照組的變化趨勢一致,表明澤瀉提取物對高脂血癥大鼠有較好的改善作用。

圖3　對照組、高脂血癥模型組及澤瀉提取物治療組的PLS-DA相關(guān)性系數(shù)分析Fig.3　Correlation coefficient analysis of PLS-DA from control and hyperlipidemia and Alisma orientale treatment groups

2.5生物標(biāo)示物生物化學(xué)代謝途徑分析

高脂血癥模型組高脂飼料上調(diào)了大鼠尿液硬脂酸酰胺、油酸酰胺、3-甲基尿苷、十六烷酰胺、吲哚-3-甲酸和肌酐,同時(shí)下調(diào)了二十四碳六烯酸、3-氧-甲基多巴、吲哚-3-甲酸葡糖苷酸、多巴胺、尿酸、苯丙氨酸、左旋肉堿和甲基肌苷。生物標(biāo)示物硬脂酸酰胺、油酸酰胺、十六烷酰胺和二十四碳六烯酸的代謝異常表明高脂飼料導(dǎo)致大鼠脂肪酸代謝紊亂。生物標(biāo)示物油酸酰胺、硬脂酸酰胺和十六烷酰胺是脂肪酰胺水解酶的底物,脂肪酰胺水解酶的生物活性影響水解酶的相對比率[16]。因此在澤瀉提取物治療組下調(diào)硬脂酸酰胺、油酸酰胺和十六烷酰胺可能造成上調(diào)的脂肪酰胺水解酶。二十四碳六烯酸是以亞麻酸為底物經(jīng)過碳鏈延伸和去不飽和度化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物,二十四碳六烯酸再經(jīng)過C24:6n-3到C22:6n-3的脂肪酸的β-氧化反應(yīng)產(chǎn)生二十二碳六烯酸。降低的二十四碳六烯酸與異常的脂肪酸β-氧化有關(guān),然而澤瀉提取物改善了高脂血癥中存在的脂肪酸β-氧化異常的發(fā)生。

生物標(biāo)示物3-氧-甲基多巴、吲哚-3-甲酸、吲哚-3-甲酸葡糖苷酸、多巴胺和苯丙氨酸的異常表明高脂血癥大鼠氨基酸的代謝的紊亂。生物標(biāo)示物3-氧-甲基多巴、甲基多巴和苯丙氨酸在動(dòng)脈粥樣硬化有重要作用[17]。高脂血癥中下調(diào)的3-氧-甲基多巴、吲哚-3-甲酸葡糖苷酸、多巴胺和苯丙氨酸和澤瀉提取物治療上調(diào)這些代謝產(chǎn)物證明澤瀉對高脂血癥有較好的治療作用。

生物標(biāo)示物尿酸和甲基肌苷的異常表明高脂血癥大鼠尿液嘌呤代謝的紊亂。尿酸是嘌呤代謝的最終氧化產(chǎn)物,黃嘌呤氧化酶氧化黃嘌呤到尿酸。生物標(biāo)示物肌酐的異常表明高脂血癥大鼠肌酸或能量代謝的紊亂。肌酐是肌肉在人體內(nèi)代謝的產(chǎn)物,肌酐是檢測腎功能的生物標(biāo)示物,增加的肌酐標(biāo)志腎臟的代謝異常[18-19]。因此，增加的肌酐可能意味著在高脂血癥大鼠腎功能受到影響。

3　結(jié)　論

采用高脂飼料誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠研究澤瀉對其治療的生物標(biāo)示物和生物化學(xué)作用機(jī)制,研究顯示澤瀉改善了高脂血癥中紊亂的脂肪酸代謝、氨基酸代謝和嘌呤代謝。代謝組學(xué)技術(shù)能夠應(yīng)用于高脂血癥及澤瀉對其的治療生物化學(xué)作用機(jī)制研究。

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(編輯陳鐿文)

The identified biomarkers and biochemical mechanism of therapeutic effect ofAlismaorientaleon diet-induced hyperlipidemia rats

MIAO Hua

(Department of Physicsl Edneation, Northwest University, Xi′an 710069, China)

The identified biomarkers and biochemical mechanism of therapeutic effect ofAlismaorientaleon diet-induced hyperlipidemia rats was studied by metabolomic approach. Urinary from control, hyperlipidemia andAlismaorientaletreatment groups was analyzed by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry. Acquired data were subjected to PLS-DA for differentiating the control, hyperlipidemia andAlismaorientaletreatment groups. Biomarkers were identified by PLS-DA. Fourteen metabolites were identified as potential biomarkers. Compared with control rats, up-regulated octadecanamide, oleamide, 3-methyluridine, palmitic amide, indole-3-carboxylic acid and creatinine as well as down-regulated tetracosahexaenoic acid, 3-O-methyldopa, 3-indole carboxylic acid glucuronide, dopamine, uric acid, phenylalanine, L-carnitine and methylinosine were observed in diet-induced hyperlipidemia group. The up-regulation and down-regulation of metabolites were reversed by treatment withAlismaorientale. The perturbations of fatty acid metabolism, amino acid metabolism and purine metabolism were observed in diet-induced hyperlipidemia rats. The study shows that metabonomics could be applied to investigation of identified biomarkers and biochemical mechanism of therapeutic effect ofAlismaorientaleon diet-induced hyperlipidemia rats.

hyperlipidemia; metabolomics;Alismaorientale; ultra-performance liquid chromatography; mass spectrometry; fatty acid metabolism; amino acid metabolism; purine metabolism

2015-12-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202909，81274025， 81001622)；西北大學(xué)本科教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程基金資助項(xiàng)目(JX13037)

苗華，女，副教授，河南南陽人，從事中藥藥理學(xué)和代謝組學(xué)研究。

R285.5

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-03-017