于慧雯，馬曉茹，鄭書源，徐基偉，，李彤，夏明珠，王風(fēng)云*

（1. 南京理工大學(xué)，江蘇 南京 210094；2. 大連依利特分析儀器有限公司，遼寧 大連 116023）

RP/SCX雙模式混合機理固定相評價研究

于慧雯1，馬曉茹1，鄭書源1，徐基偉1，2，李彤2，夏明珠1，王風(fēng)云1*

（1. 南京理工大學(xué)，江蘇 南京 210094；2. 大連依利特分析儀器有限公司，遼寧 大連 116023）

液相色譜多模式混合固定相同時具有多種分離機理，被越來越多的應(yīng)用于復(fù)雜樣品的分析。通過改變兩種改性基團的投料比，制備了一組經(jīng)典的RP/SCX雙模式混合固定相，并對其進(jìn)行了系統(tǒng)的評價研究。采用元素分析、離子交換當(dāng)量測試，得到了-C18與-SO3H兩種基團的比例，驗證了空間位阻對-C18鍵合率的影響；分別在反相和離子交換模式下，考察了疏水性樣品、離子樣品的保留行為；并成功分離了含有6種不同類型化合物的混合物。評價結(jié)果表明，制備的固定相同時具有反相和離子交換色譜的雙重保留機理，為此類固定相分離復(fù)雜樣品提供了參考數(shù)據(jù)。

雙模式混合固定相；反相色譜；陽離子交換色譜；評價研究

前言

反相色譜是目前應(yīng)用最為廣泛的一種液相色譜分離模式，但在分離強極性及離子樣品時，往往不能表現(xiàn)出良好的分離選擇性，在此類應(yīng)用中存在局限性［1］?；旌夏Ｊ缴V固定相具有多重保留機理，對復(fù)雜樣品分離有一定優(yōu)勢，成為近年來的研究熱點［2，3］。彭西甜等［4］制備了辛基-磺酸基共同鍵合的反相強陽離子交換混合色譜固定相，并使用幾種堿性樣品作為探針研究了混合色譜固定相的兩點保留模型。梁鑫淼等［5］利用一種HILIC/WCX復(fù)合模式固定相，分別在HILIC、WCX和HILIC/WCX模式下，系統(tǒng)研究了殼寡糖的分離行為，并在HILIC/WCX模式下獲得更好的峰形。楊炳成等［6］采用制備的Click-ASP固定相，在HILIC模式下分離核苷和核酸混合物，在離子色譜模式下分離了無機陰離子?；旌夏Ｊ焦潭ㄏ嘀凶顬槌Ｒ姷氖蔷哂姓恍再|(zhì)的RP/IEC固定相［7，8］，兼具反相和離子交換的雙重保留機理，可以很好的解決反相色譜對強極性和離子樣品保留較弱的問題，應(yīng)用于多肽和蛋白質(zhì)分離［9-11］、藥物分子檢測［12，13］、中草藥提純［14］等領(lǐng)域。

在我們的前期工作中，制備了一種C18-磺酸基雙模式復(fù)合固定性，并進(jìn)行了初步的探討。本文在此基礎(chǔ)上，對固定相的制備方法及不同模式下的色譜性能進(jìn)行了評價研究。

1　實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

儀器：P1201高效液相色譜儀，包括UV1201紫外-可見檢測器、P1202高壓恒流泵，大連依利特分析儀器有限公司；7725i手動進(jìn)樣閥（10μL進(jìn)樣環(huán)），美國Rheodyne公司；Vario EL型有機元素分析儀，德國Elementar；超聲波清洗儀（AS20500AT），天津奧特賽恩斯儀器有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司。

試劑：5 μm球形硅膠（ThermoFisher Scientific，169 m2/ g，120），十八烷基三氯硅烷（95%）、3-巰丙基三甲氧基硅烷（97%）、芐胺、苯胺、三聚氰胺（北京百靈威科技有限公司）；甲苯、乙苯、丙苯、丁苯、戊苯、濃硫酸（98%）、磷酸二氫鈉（天津科密歐試劑有限公司）；甲醇、乙腈，色譜純（美國TEDIA天地試劑公司）；Milli-Q超純水。

1.2實驗條件

1.2.1固定相的制備

將硅膠在濃硫酸條件下活化得到活化硅膠（activated silica，簡稱AS），將不同比例的十八烷基三氯硅烷（Octadecyltrichlorosilane，簡稱OTS）和3-巰丙基三甲氧基硅烷（trimethoxysilylpropanethiol，簡稱MPS）鍵合到硅膠表面，得到C18-巰基鍵合硅膠（octadecyl-mercapto silica，簡稱OMS）；將OMS進(jìn)一步氧化得到目標(biāo)產(chǎn)物C18-磺酸基固定相（octadecylsulfonic silica，簡稱OSS）。

1.2.2色譜柱的裝填

采用高壓等密度勻漿技術(shù)，將制備的固定相裝填為ID 4.6 mm ×150 mm色譜柱進(jìn)行后續(xù)評價。

1.2.3離子交換當(dāng)量測試

流動相A：乙腈:10mmol/L的磷酸二氫鈉緩沖液（pH=3.0）=20:80（V/V），流動相B：含有濃度為0.5 mg/mL三聚氰胺樣品的流動A。流速1 mL/min，采用流動相A對系統(tǒng)進(jìn)行平衡30 min后，切換到流動相B并同時用工作站254 nm波長采集信號，記錄曲線的突躍時間T。

色譜柱離子交換當(dāng)量計算公式為：Q=CF（Tb-T0），其中Q為離子交換當(dāng)量，C（mg/mL）為三聚氰胺的濃度，F(xiàn)（mL/min）為實驗過程中的流速，Tb（min）為系統(tǒng)連接混合色譜柱時的突躍時間，T0（min）為系統(tǒng)未連接色譜柱時的突躍時間。

2　結(jié)果與討論

2.1元素分析和離子交換當(dāng)量測試結(jié)果

對制備的混合色譜固定相進(jìn)行元素分析，并根據(jù)分析結(jié)果測算了C18與磺酸基的摩爾比，具體結(jié)果如表1所示。參考文獻(xiàn)［12］報道的方法，采用三聚氰胺，進(jìn)一步測定制備的3種固定相的離子交換當(dāng)量，具體實驗步驟見1.2.3。計算得到三根混合色譜柱的離子交換當(dāng)量依次為1105 μg/g、739 μg/g、470 μg/g。

表1　混合固定相信息參數(shù)表Table 1 Information table of OSS

結(jié)合元素分析與離子當(dāng)量的測定結(jié)果可知，3種固定相中兩種官能團的比例與投料變化趨勢基本一致，隨著OTS投料比例增加，固定相中的C元素含量不斷增加，S元素含量不斷減少，換算出的C18含量也逐漸增加，磺酸基減少。制備固定相過程中，C18鏈相對較長，在同時鍵合時空間位阻更大，所以與理論投料量相比，C18的鍵合量相對較少。

2.2疏水樣品的分離行為評價

采用丁苯作為分析對象，在反相分析模式下，考察其在3支混合模式色譜柱上的保留情況，結(jié)果如1（a）所示，隨著混合柱C18含量的增大，丁苯的保留時間增加。繼續(xù)在反相模式下，選擇固定相為OOS-2的混合柱，甲苯和乙苯為分析對象，考察流動中甲醇比例變化，對樣品保留行為的影響，結(jié)果如圖1（b）所示，并考察了流動相中甲醇含量對樣品洗脫的影響。結(jié)果如圖1（b）所示，隨著流動相中甲醇比例的提高，洗脫強度增大，樣品的保留時間逐漸減小。兩個實驗結(jié)果都說明，RP/SCX固定相表現(xiàn)出良好的反相分離機理。

圖1?。╝）丁苯保留時間隨C18基團含量變化的趨勢圖。色譜條件：流動相，MeOH/ H2O=85/15；流量，0.9 mL/min；檢測波長，254 nm。（b）甲苯、乙苯的保留時間隨甲醇含量變化的趨勢圖。色譜條件：流動相，甲醇水溶液；流量，0.9 mL/min；檢測波長254 nm。Fig. 1（a）Dependency of retention times of butylbenzene on C18 group content. Conditions: mobile phase，MeOH/H2O=85/15； flow rate，0.9 mL/min； 254 nm.（b）Dependency of retention times of toluene and ethylbenzene on MeOH content. Conditions: mobile phase，MeOH/H2O； flow rate，0.9 mL/min； 254 nm.

2.3離子樣品的分離行為評價

以苯胺為分析樣品，考察流動相中鹽濃度對其保留時間的影響。結(jié)果如圖2（a）所示，隨著流動相中鹽濃度的增加，離子強度增加，苯胺的保留時間逐漸減小，表現(xiàn)出典型的離子交換保留機理。再以芐胺、苯胺為樣品，考察了流動相pH值對其保留行為的影響。結(jié)果如圖2（b）所示，由于芐胺pKa=9.34是一種強堿性物質(zhì)，在pH 4.0-6.0變化范圍內(nèi)均以離子形式存在，故保留時間受流動相pH影響不大。苯胺的pKa=4.6，隨著pH的增大，苯胺的保留時間逐漸減小，在高pH時苯胺只受到疏水保留作用；在低pH值時，苯胺以離子形式存在，受疏水和靜電吸引雙重保留機理作用［15］，保留時間更長。

圖2　（a）鹽濃度對苯胺在混合色譜柱上保留時間的影響。色譜條件：流動相，乙腈/一定濃度的醋酸鹽=25/75；流量，0.9 mL/min；檢測波長，254 nm。（b）苯胺和芐胺在混合柱上保留時間隨流動相中pH變化趨勢圖。色譜條件：流動相，乙腈/20mM醋酸鹽=25/75；流量，0.9 mL/ min；檢測波長，254 nm。Fig.2（a）Influence of buffer concentration on the retention times of anilin on the mixed-mode column. Conditions: mobile phase，ACN/acetate=25/75； flow rate，0.9mL/min； 254nm.（b）Dependency of retention times of anilin and benzylamine on pH. Conditions: mobile phase，ACN/20mM acetate=25/75； flow rate，0.9mL/min； 254nm.

2.4混合樣品分離評價

選取6種不同類型化合物作為分析對象，考察OSS-1混合柱對6種樣品混合物的分離能力。結(jié)果如圖3，混合柱很好的分離了這6種物質(zhì)，峰形良好，說明了RP/SCX混合機理固定相具有分離復(fù)雜樣品的潛在能力。

圖3　6種化合物在混合柱上分離色譜圖梯度條件：70～30～70A%（0～7～10 min），流動相A：20 mmol/L醋酸銨pH 4.5；流動相B：乙腈。1-對甲基苯磺酸；2-對羥基苯甲酸；3-芐胺；4-甲苯；5-乙苯；6-對苯二胺Fig.3 Separation of 6 compounds on the mixed-mode stationary phase. Gradient: 70～30～70A%（0～7～10 min）. Mobile phase A: 20 mmol/L NH4Ac，pH 4.5； mobile phase B: ACN.1-p-toluenesulfonic acid； 2-p-hydroxybenzoic acid； 3-benzylamine； 4-toluene；5-ethylbenzene； 6-p-phenylenediamine

3　結(jié)論

通過元素分析、離子交換當(dāng)量測試，對制備的雙模式固定相中的鍵合基團比例和含量進(jìn)行了換算，驗證了投料比的變化，同時發(fā)現(xiàn)由于空間位阻作用導(dǎo)致C18鍵合率相對較低。通過進(jìn)一步的色譜行為評價，證明了制備的固定相在分離烷基苯類化合物時表現(xiàn)出典型的反相分離機理，分離苯胺和芐胺時表現(xiàn)出離子交換和反相雙重作用機理。通過分離6種不同類型化合物的混合物，進(jìn)一步說明RP/SCX雙模式固定相在分離復(fù)雜樣品方面具有一定應(yīng)用潛力。

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Evaluation of RP/SCX Mixed-mode Stationary Phase

Yu Huiwen1，Ma Xiaoru1，Zheng Shuyuan1，Xu Jiwei1，2，Li Tong2，Xia Mingzhu1，Wang Fengyun1*
（1. Nanjing University of Science and Technology，Nanjing 210094，China； 2. Dalian Elite Analytical Instruments CO.，Ltd.，Dalian 116023，China）

Mixed-mode stationary phases of HPLC had been applied to analyses of complicated samples more and more because of their multiple separation mechanisms. A number of classical RP/SCX mixed-mode stationary phases were prepared by changing the feed ratio of modifying agents. Then they were evaluated and researched systematically. The ratios of -C18 to -SO3H were acquired by element analyses and ion exchange capacity tests which confirmed that the bond rates were affected by steric hindrance. The retention behaviors of hydrophobic samples and ion samples were studied under RP and IEC mode respectively. A mixture of six kinds of compounds was separated successfully. Results showed that the prepared stationary phase had double retention mechanisms of RP and IEC which offered

for this kind of stationary phase to separate complicated samples.

mixed-mode stationary phase； reversed phase chromatography； cation exchange chromatography； evaluation and research

Q65［Document Code］ A

10.11967/2016140411

Q65

ADOI: 10.11967/2016140411

國家自然科學(xué)基金面上項目（51472121），南京理工大學(xué)本科生科研訓(xùn)練資助項目。

?王風(fēng)云：Tel:（025）84315190，E-mail：wangfy@njust.edu.cn 博士，教授，色譜填料的合成、改性及應(yīng)用。于慧雯：Tel:（025）84315190，E-mail：1058909128@qq.com 本科。