黃英楊明華孔令富郝美林高士爭李永能趙素梅

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 招生就業(yè)處，昆明 650201）

Leptin介導(dǎo)AMPK信號通路對豬皮下前脂肪細(xì)胞脂類代謝調(diào)控的研究

黃英1楊明華1孔令富2郝美林1高士爭1李永能3趙素梅1

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 招生就業(yè)處，昆明 650201）

以體外培養(yǎng)的豬原代皮下脂肪細(xì)胞為研究材料，檢測Leptin介導(dǎo)AMPK信號通路中基因表達(dá)水平，旨在闡明Leptin介導(dǎo)AMPK信號通路對脂肪代謝調(diào)控的分子機(jī)制。用0和100 ng/mL Leptin分別處理脂肪細(xì)胞48 h，油紅O染色鑒定脂肪細(xì)胞，試劑盒測定細(xì)胞中甘油三酯和游離脂肪酸含量，Real-time PCR方法檢測皮下前脂肪細(xì)胞中AMPK信號通路中基因表達(dá)水平。研究結(jié)果表明，皮下前脂肪細(xì)胞中，Leptin組甘油三酯含量均顯著低于對照組（P＜0.05），表明Leptin可以降低細(xì)胞中甘油三酯和游離脂肪酸含量。Leptin組中AMPK信號通路中的基因lepR、AMPK、CPT-1基因的表達(dá)量均顯著高于對照組（P＜0.05），ACC基因表達(dá)量顯著低于對照組（P＜0.05），表明Leptin通過調(diào)控AMPK信號通路中基因表達(dá)，啟動AMPK信號通路的信號傳遞。皮下前脂肪細(xì)胞中，lepR、AMPK和CPT-1基因表達(dá)量均與甘油三酯和游離脂肪酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；ACC基因表達(dá)量與甘油三酯和游離脂肪酸含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)果表明，Leptin通過激活A(yù)MPK信號通路，降低ACC基因的表達(dá)量，提高CPT-1基因表達(dá)水平，促進(jìn)甘油三酯分解及脂肪酸的氧化，降低細(xì)胞中甘油三酯和游離脂肪酸的含量。

前皮下脂肪細(xì)胞；瘦素；AMPK；信號通路

腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）在真核生物中是一個重要的蛋白激酶，可加速脂肪酸氧化、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解分解代謝途徑，同時能抑制糖異生、脂肪酸和膽固醇合成、蛋白質(zhì)合成等合成途徑，以降低能量消耗，維持機(jī)體能量代謝平衡［1］。Leptin介導(dǎo)的AMPK信號通路在脂肪代謝的調(diào)節(jié)中起主要作用，能促進(jìn)脂肪酸的氧化，減少脂肪沉積。本研究以體外培養(yǎng)的豬皮下前脂肪細(xì)胞為研究對象，用100 ng/mL Leptin處理48 h觀察Leptin對前脂肪細(xì)胞的影響。以油紅O染色觀察前脂肪細(xì)胞中脂滴的形成，從mRNA水平來研究Leptin對AMPK通路中各基因表達(dá)的影響，并通過檢測細(xì)胞中甘油三酯和游離脂肪酸的含量，闡明Leptin對脂類代謝的影響，為深入開展AMPK信號通路對脂肪代謝調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 取一頭15 kg仔豬的皮下脂肪組織，分離皮下前脂肪細(xì)胞，進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，Leptin組和對照組均為6個重復(fù)。仔豬購自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)豬場。

1.1.2 主要試劑 Trizol購自天根公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司；SYBR?Premix Ex TaqTM購自大連寶生物；甘油三酯試劑盒購自北京北化康泰臨床試劑有限公司；游離脂肪酸試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豬前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下切取15日齡仔豬背部皮下脂肪組織，PBS緩沖液沖洗3次，分離去除脂肪組織中可見的纖維及血管，剪碎后加入1 mg/mL 的Ⅰ型膠原酶消化液，置37℃振蕩搖床內(nèi)震蕩消化1 h，用不銹鋼細(xì)胞篩過濾（200目），濾液以1 500 r/min離心10 min，棄上清，沉淀物用無血清培養(yǎng)液重懸，再次過濾離心10 min，棄上清，沉積的細(xì)胞團(tuán)塊用基礎(chǔ)培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞以5.0×104個/cm2密度接種至培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃，飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，1 d后換液，此后每2 d換液一次。

1.2.2 豬皮下前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 待豬原代皮下脂肪細(xì)胞匯合度達(dá)60%時，更換培養(yǎng)液為以10 mg/L胰島素、0.25 μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 1-甲基3-異丁基黃嘌呤的分化培養(yǎng)液，分別在分化培養(yǎng)液中添加0和100 ng/mL Leptin 處理48 h（其中0 ng/mL為對照組），一部分細(xì)胞用于油紅O染色鑒定，一部分細(xì)胞用于甘油三酯和游離脂肪酸含量測定，其余細(xì)胞用于提取總RNA。

1.2.3 油紅O 染色 誘導(dǎo)分化2 d后的細(xì)胞，取出培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，10%甲醛固定30 min，PBS漂洗3次后，油紅O工作液染色40 min，移去染色液，PBS漂洗3次，鏡檢。

1.2.4 甘油三酯的測定 用甘油三酯試劑盒（北京北化康泰臨床試劑有限公司）測定皮下脂肪細(xì)胞中的甘油三酯濃度，操作方法按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.2.5 脂肪酸含量的測定 用游離脂肪酸測試盒說明書（NEFA）（南京建成科技有限公司）測定皮下脂肪細(xì)胞中游離脂肪酸含量，操作方法按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.2.6 總RNA提取 收集對照組和100 ng/mL Leptin處理48 h后的脂肪細(xì)胞，采用Trizol-A+Reagent提取總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，通過OD260nm/OD280nm測定其濃度。

1.2.7 Real-time PCR反應(yīng)及條件 根據(jù)所測定的濃度，各取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用EasyScriptFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μL，其中含有10 μL 2×ES Reaction Mix、1 μL EasyScript RT/RI Enzyme Mix、1 μL Anchored Oligo（dT），加入Rnase-free Water至20 μL。將這20 μL混合物42℃孵育30 min，85℃加熱5 min失活，EasyScript RT反轉(zhuǎn)錄后的cDNA單鏈可于-20℃中保存。

目的基因：瘦素受體（Leptin receptor，lepR），肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1），腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC），肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1）和內(nèi)參基因18S rRNA的引物使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成。基因登錄號及引物序列見表1。

表1 內(nèi)參基因與目的基因的引物序列、產(chǎn)物長度和登錄號

Real-time PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：1.5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10 μL SYBR Green，10 mmol/L的上下游引物各0.4 μL，加ddH2O至20 μL。每個重復(fù)做2個平行，同時用ddH2O代替RT產(chǎn)物和熒光試劑作空白對照，以檢驗(yàn)是否有外源基因和基因組DNA 污染。1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用SAS9.0和Excel2003軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），并對平均值進(jìn)行方差分析，作顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 Leptin對前脂肪細(xì)胞形態(tài)變化的影響

觀察豬皮下前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的Leptin對前脂肪細(xì)胞形態(tài)變化無明顯影響。處理48 h后，可見部分細(xì)胞開始分化，細(xì)胞內(nèi)可見少量球形脂滴。油紅O染色結(jié)果（圖1）顯示，Leptin組比對照組著色細(xì)胞數(shù)多。

圖1 皮下前脂肪細(xì)胞油紅O染色（200×）

2.2 Leptin對前脂肪細(xì)胞甘油三酯和游離脂肪酸合成的影響

Leptin對豬前脂肪細(xì)胞甘油三酯和游離脂肪酸合成影響的結(jié)果（表2）顯示，Leptin組中甘油三酯含量顯著低于對照組（P＜0.05）；Leptin組中游離脂肪酸含量低于對照組，但沒有達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。

表2 甘油三酯和游離脂肪酸含量

2.3 Leptin介導(dǎo)AMPK信號通路中基因的表達(dá)水平

皮下前脂肪細(xì)胞中，Leptin介導(dǎo)AMPK信號通路中各基因相對表達(dá)水平結(jié)果（圖2）顯示，Leptin組lepR（圖2-A）、AMPK（圖2-B）和CPT-1（圖2-C）基因相對表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），Leptin組中LKB1（圖2-D）基因相對表達(dá)量高于對照組，但沒有達(dá)到顯著水平（P＞0.05）（圖2-D），Leptin組中ACC（圖2-E）基因相對表達(dá)量顯著低于對照組（圖2-E，P＜0.05）。

圖2 Leptin介導(dǎo)AMPK信號通路中基因的相對表達(dá)水平

2.4 皮下前脂肪細(xì)胞中AMPK信號通路中基因表達(dá)量與甘油三酯含量相關(guān)性

皮下前脂肪細(xì)胞中，Leptin介導(dǎo)的AMPK信號通路中各基因相對表達(dá)量與甘油三酯含量相關(guān)性結(jié)果顯示，lepR（圖3-A）、AMPK（圖3-B）和 CPT-1（圖3-C）基因的mRNA的表達(dá)水平與甘油三酯含量之間存在負(fù)相關(guān)且達(dá)到顯著水平（P＜0.05），LKB1（圖3-D）基因的mRNA的表達(dá)水平與甘油三酯含量之間存在負(fù)相關(guān)但沒有達(dá)到顯著水平（圖3-D，P＞0.05），ACC（圖3-E）基因的mRNA的表達(dá)水平與甘油三酯含量之間存在正相關(guān)且達(dá)到顯著水平（圖3-E，P＜0.05）。

2.5 皮下前脂肪細(xì)胞中AMPK信號通路中基因表達(dá)量與游離脂肪酸含量相關(guān)性

皮下前脂肪細(xì)胞中，AMPK信號通路中各基因表達(dá)量與游離脂肪酸含量相關(guān)性結(jié)果（圖4）顯示，lepR（圖4-A）、AMPK（圖4-B）和 CPT-1（圖4-C）基因的mRNA的表達(dá)水平與游離脂肪酸含量之間存在強(qiáng)負(fù)相關(guān)（P＜0.05），LKB1（圖4-D）基因的mRNA的表達(dá)水平與游離脂肪酸含量之間成負(fù)相關(guān)，但未達(dá)到顯著水平（P＞0.05），ACC（圖4-E）基因的mRNA的表達(dá)水平與游離脂肪酸含量之間存在強(qiáng)正相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

脂肪即甘油三酯，是動物機(jī)體內(nèi)儲能的主要形式，是能源物質(zhì)。當(dāng)動物攝入的能源物質(zhì)超過其所需要的消耗量時，就以脂肪的形式貯存起來。而當(dāng)攝入的能源物質(zhì)不能滿足生理活動需要時，則體內(nèi)貯存的脂肪會氧化供能。脂肪細(xì)胞從血液中攝取脂肪酸和葡萄糖，合成甘油三酯，并以脂滴的形式貯存在細(xì)胞內(nèi)部［2］，這些富含甘油三酯的脂滴是機(jī)體能量的貯存單位。甘油三酯可被脂蛋白酯酶分解，釋放游離脂肪酸和單甘油酯。游離脂肪酸和單甘油酯被脂蛋白的膜外小葉轉(zhuǎn)運(yùn)到脂肪細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，在脂肪細(xì)胞內(nèi)單甘油酯可以繼續(xù)分解成游離脂肪酸和甘油［3］。而游離脂肪酸由于作為能量物質(zhì)被消耗，將其作為衡量脂解的一個輔助指標(biāo)。Leptin是肥胖基因（ob）的表達(dá)產(chǎn)物，主要由白色脂肪組織合成和分泌，在調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪沉積和維持體重方面具有重要的作用。而Leptin能夠抑制食欲中樞，減少能量攝取，增加能量消耗，抑制脂肪合成，促進(jìn)脂肪分解，減少體內(nèi)脂肪沉積，從而發(fā)揮降低體重的功能［4］。Nogalska等［5］指出，Leptin的增加可在體內(nèi)抑制白色脂肪組織中脂肪酸合成酶的基因表達(dá)，從而使白色脂肪組織中脂肪酸的合成速度下降并導(dǎo)致脂肪酸氧化，脂肪量降低。Gregory等［6］研究認(rèn)為，Leptin對調(diào)節(jié)體內(nèi)肌肉甘油三酯的含量具有重要作用，血漿中瘦蛋白水平的慢性升高可通過刺激脂肪酸氧化和甘油三酯的水解，以及降低脂肪酸的攝取，而使瘦型大鼠肌肉內(nèi)甘油三酯含量減少。本研究表明，在皮下前脂肪細(xì)胞中，添加Leptin的Leptin組中的甘油三酯和游離脂肪酸含量均低于對照組，說明Leptin具有促進(jìn)脂肪分解和抑制脂肪合成的作用。

圖3 AMPK信號通路中基因表達(dá)量與甘油三酯含量相關(guān)性

圖4 AMPK信號通路中基因表達(dá)量與游離脂肪酸含量相關(guān)性

lepR是一種跨膜受體，主要的生理功能是與Leptin結(jié)合，lepR基因表達(dá)量與Leptin濃度有關(guān)［7，8］。Leptin與lepR結(jié)合后可激活LKB1，使LKB1與STE20相關(guān)接合蛋白（STE20 related adaptor protein，STRAD）和鼠蛋白25（mouse protein 25，MO25）結(jié)合形成三元復(fù)合物，使LKB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)中。此三元復(fù)合物可使LKB1活性增強(qiáng)從而激活下游的AMPK［9，10］。本研究表明，Leptin組與對照組相比，LKB1的表達(dá)量沒有顯著差異，說明LKB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)過程中其表達(dá)量沒有改變。活化的LKB1使AMPKα亞基中的Thr172磷酸化，并使AMPK活化［11，12］?；罨腁MPK可以磷酸化ACC的Ser79，從而使ACC失去活性。有研究表明，瘦素缺陷小鼠ACC mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，可導(dǎo)致脂肪酸合成增加，而給予瘦素干預(yù)后，ACC mRNA的表達(dá)下調(diào)［13］。在離體的脂肪細(xì)胞中，Leptin可以降低涉及合成脂肪酸的ACC的酶活性，同時上調(diào)了CPT-1基因的表達(dá)量，從而促進(jìn)了脂肪酸的氧化以及降低甘油三酯的合成［14］。本研究中Leptin組CPT-1基因相對表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），ACC基因相對表達(dá)量顯著低于對照組（P＜0.05），本研究結(jié)果與前人研究一致。

ACC是脂肪酸從頭合成過程中的限速酶，它調(diào)節(jié)脂肪酸的合成，可以催化乙酰CoA形成丙二酸單酰CoA，所以ACC直接影響丙二酸單酰CoA在細(xì)胞內(nèi)的濃度，而丙二酸單酰CoA是脂肪酸合成的底物，也是抑制脂肪酸β氧化的一種抑制劑，它可以抑制CPT-1活性從而阻礙脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體來降低脂肪酸的氧化［15，16］。當(dāng)ACC失去活性后會減少丙二酸單酰CoA的生成，一方面減少了脂肪酸的合成，另一方面解除了丙二酸單酰CoA對CPT-1的抑制，使CPT-1活性增強(qiáng)，促進(jìn)了脂肪酸進(jìn)入到線粒體內(nèi)進(jìn)行β氧化［17］。故ACC基因的表達(dá)量與甘油三酯和游離脂肪酸呈正相關(guān)，CPT-1基因表達(dá)量與游離脂肪酸和甘油三酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)。ACC是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，為AMPK重要底物。激活A(yù)MPK使ACC磷酸化失活，抑制了脂肪的合成。此外AMPK磷酸化甘油磷酸?；D(zhuǎn)移酶，抑制甘油三酯合成，以及磷酸化激素敏感酯酶，控制脂解作用，使其不超過脂肪酸的氧化速率，以防過量堆積的脂肪酸重新合成脂肪［18］。有研究表明，AMPK可以抑制甘油二酯和甘油三酯的合成，在大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)液中加入AICAR培養(yǎng)3 h，14C-油酸和3H-進(jìn)入甘油三酯的量分別降低50%和38%，14C-油酸進(jìn)入甘油二酯的量降低60%。肌細(xì)胞與AICAR儀器培養(yǎng)90 min，14C-油酸進(jìn)入甘油三酯量降低37%，而14CO2的產(chǎn)量增加48%［19］。Leptin具有促磷酸化作用，可活化骨骼肌中AMPKα2催化亞基。AMPK具有檢測細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)的作用，可通過抑制ACC的活性，有效地促進(jìn)肌肉中脂肪酸的氧化，降低脂肪酸的酯化。與AMPK活化相平衡，Leptin抑制ACC的活性，刺激脂肪酸在肌肉中的氧化。通過AMPK-ACC的調(diào)節(jié)作用實(shí)現(xiàn)Leptin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，故AMPK基因表達(dá)量與甘油三酯和游離脂肪酸成負(fù)相關(guān)。Leptin通過與lepR結(jié)合后使LKB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)與STARD和MO25兩種蛋白結(jié)合，形成的三元復(fù)合物可激活LKB1，但LKB1基因表達(dá)量沒有明顯改變?；罨腖KB1可以磷酸化AMPK并激活A(yù)MPK，故LKB1基因表達(dá)量與甘油三酯和游離脂肪酸含量呈負(fù)相關(guān)但沒達(dá)到顯著水平。Leptin通過lepR來調(diào)節(jié)下游基因，lepR基因表達(dá)量與Leptin濃度有關(guān)，故lepR基因表達(dá)量與甘油三酯和游離脂肪酸含量成顯著負(fù)相關(guān)。

4 結(jié)論

Leptin通過激活A(yù)MPK信號途徑，降低ACC基因的表達(dá)量，提高CPT-1基因表達(dá)水平，促進(jìn)甘油三酯分解及脂肪酸的氧化，降低細(xì)胞中甘油三酯和游離脂肪酸的含量。

［1］ Luo Z， Zang M， Guo W. AMPK as a metabolic rumor suppressor：control of metabolism and cell growth［J］. Future Oncol， 2010， 6（3）：457-470.

［2］Tauchi K， Ozek S， Houjou T， et al. The surface of lipid droplets is a phospholipid monolayer with a unique fatty acid composition［J］. Biological Chemistry， 2002， 277：44507-44512.

［3］ 趙素梅. 兩種肉雞胚胎期脂肪代謝及DHEA調(diào)控研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2007.

［4］Eikelis N， Lambert G， Wiesner G， et al. Extra-adipocyte Leptin release in human obesity and its relation to sympathoadrenal function［J］. Am J Physiol， 2004， 286（5）：E744-E752.

［5］ Nogalska A， Swierczynski J. Potential role of high serum Leptin concentration in age-related decrease of fatty acid synthase gene expression in rat white adipose tissue［J］. Experimental Gerontology，2004， 39：147-150.

［6］ Gregory R， Arend B， David J， et al. Fatty acid oxidation and triacylglycerol hydrolysis are enhanced after chronic Leptin treatment in Rats［J］. American Journal of Physiology Endocrinology and Metablism，2002， 282：593-600.

［7］Ramsay TG， Richards MP. Leptin and Leptin receptor expression in skeletal muscle and adipose tissue in response to in vivo porcine somatotropin treated［J］. Animal Science， 2005， 83：2501-2508.

［8］Borja G， Alfredo S， Teresa F， et al. Leptin receptors in human skeletal muscle［J］. Applied Physiology， 2007， 102：1786-1792.

［9］龍璐， 王平芳. LKB1-AMPK信號通路與胰島素抵抗［J］. 中國糖尿病雜志， 2007， 15：382-384.

［10］Song P， Xie ZL， Wu Y， et al. Protein kinase Cζ-dependent LKB1 serine 428 phosphorylation increases LKB1 nucleus export and apoptosis in endothelial cells［J］. Biological Chemistry， 2008，283：12446-12455.

［11］Eijiro Y， Jeffrey E， Irwin J， et al. Fyn-dependent regulation of energy expenditure and body weight is mediated by tyrosine phosphorylation of LKB1［J］. Cellular Metabolism， 2010， 11：113-124.

［12］Chung T， Blerina K， Marta K. AMPK as a mediator of hormonal signalling［J］. Molecular Endocinology， 2010， 44：87-97.

［13］Li J， Grigoryev DN， Ye SQ， et al. Chronic interm ittent hypoxia upregulates genes of lipid biosynthesis in obesemice［J］. Applied Physiology， 2005， 99：1643-1648.

［14］Niang F， Benelli C， Ribiere C， et al. Leptin induces nitric oxidemediated inhibition of lipolysis and glyceroneogenesis in rat white adipose tissue［J］. Nutrition， 2011， 141：4-9.

［15］Jeukendrup AE. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle［J］. Annals of the New York Academy of Sciences， 2002，967：217-235.

［16］Knafo L， Chessex P， Rouleau T. Association between hydrogen peroxide-dependent byproducts of ascorbic acid and increased hepatic acetyl-CoA carboxylase activity［J］. Clinical Chemistry，2005， 51：1462-1471.

［17］張芳林. 肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ的研究進(jìn)展［J］. 國外醫(yī)學(xué)內(nèi)分泌學(xué)分冊， 2002， 22：166-169.

［18］ 符慶瑛， 高鈺琪. 蛋白激酶AMPK的研究進(jìn)展［J］. 生命科學(xué)，2005， 17：147-152.

［19］Muoio D， Seefeld K， Witters L， et al. AMP-activated kinase reciprocally regulates triacylglycerol synthesis and fatty acid oxidation in liver and muscle：evidence that sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase is a novel target［J］. Biochemistry，1999， 338：783-791.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Regulation of Leptin-mediated AMPK Signal Pathway on Lipid Metabolism in Porcine Subcutaneous Preadipocyte

HUANG Ying1YANG Ming-hua1KONG Ling-fu2HAO Mei-lin1GAO Shi-zheng1LI Yong-neng3ZHAO Su-mei1
（1. Yunnan Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201；2. Faculty of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201；3. Admission and Employment Office，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201）

Using in vitro cultured porcine subcutaneous preadipocytes as the study material， the expression levels of related genes were measured for investigating the molecular regulation mechanism of leptin-mediated AMPK signal pathway on lipid metabolism. The subcutaneous adipocytes were treated with 0 and 100 ng/mL leptin for 48 h， and the adipocytes were identified by oil red O dyeing， and the contents of triglyceride and free fatty acids in the cells were measured by kit， and the mRNA expression levels of related genes in the AMPK signal pathway of subcutaneous preadipocytes were detected using Real-time PCR technology. The results showed that in leptin group， the content of the triglyceride of the subcutaneous preadipocytes was significantly lower（P＜0.05）compared with the control group， indicating that the leptin reduced the contents of triglyceride and free fatty acids in the cells. The expression levels of gene lepR， AMPK， CPT-1 in AMPK signal pathway were significantly higher in leptin group than control group（P＜0.05）， while the expression level of gene ACC in leptin group was significantlylower than control group（P＜0.05）， implying that leptin initiated the signal transmission in the AMPK signal pathway by regulating the mRNA expression of related genes. The expression levels of gene lepR， AMPK， and CPT-1 were significantly negatively correlated with the content of triglyceride and free fatty acid（P＜0.05）；however， the expression level of gene ACC was significantly positively correlated with the content of triglyceride and free fatty acid（P＜0.05）. In conclusion， the results suggested that leptin activated AMPK signal pathway， reduced the expression of ACC， and increased the expression of CPT-1， which therefore promoted the decomposition of triglyceride and oxidation of fatty acid，and finally decreased the contents of the triglycerides and free fatty acid in the cells.

subcutaneous preadipocyte；leptin；AMPK；signal pathway

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.029

2015-05-05

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（A3007017），云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院科學(xué)研究基金項(xiàng)目（DKY3P201105）

黃英，女，碩士，副教授，研究方向：動物分子營養(yǎng)與代謝調(diào)控；E-mail：hying5@sina.com

李永能，男，碩士，副教授，研究方向：動物分子營養(yǎng)與代謝調(diào)控；E-mail：lyn77@vip.sina.com趙素梅，女，博士，教授，研究方向：動物分子營養(yǎng)與代謝調(diào)控；E-mail：zhaosm2009@126.com